应用ＰｒｏＥｌｕｔ ＰＳＡ 柱净化、液相色谱串联质谱仪 测定饲料添加剂维生素Ｂ２中的氯霉素木 李 兰 杨云霞 邓晓娟ｚ 李文斌 （１．中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，北京１０００８１； ２．天津大学分析测试中心，天津３０００７２；３．迪马科技有限公司，天津３００４０２） 摘要：建立了利用ＰｒｏＥｌｕｔＰＳＡ小柱净化，液相色谱串联质谱（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）仪测定维生素Ｂ：中氯霉素的检测方法。 样本在氢氧化钠提供的碱性环境中经乙酸乙酯二次提取，提取液过ＰｒｏＥｌｕｔ ＰＳＡ小柱净化，上ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ测定。氯霉素添 加量在０．３ Ｉ￣ｇ／ｋｇ １．５ ｉｘｇ／ｋｇ时，回收率为９４．４３％～１０６．３３％。方法的检出限为０．０６￣ｇ／ｋｇ，定量限为０．２ ｉｚｇ／ｋｇ，可以满足 样品实际检测需求。 关键词：饲料添加剂；维生素Ｂ２；氯霉素；ＰＳＡ固相萃取小柱；液相色谱串联质谱 氯霉素最初是由委内瑞拉链丝菌（Ｓｔｒｅｐｔｏ— ｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）的培养液中提取制得．是一类广 加剂产品声誉，因此，研究探讨氯霉素的测定方法 具有现实意义。 一谱性抗生素．因其分子中含有１个不游离的氯。故 名氯霉素 有资料表明．如果长期微量摄入含有氯 、实验部分 超高效液相色谱仪 霉素残留的食物。不仅能使大肠杆菌、沙门氏菌等 菌株产生耐药性．而且能使机体正常菌群失调．从 而感染各种疾病。欧盟、美国等国家规定动物源性 食品中氯霉素的残留限量标准为“零容许量”。即 （一）仪器、试剂与材料（ＥＫＳＰＥＲＴ ＵＬＴＲＡＬＣ １００）：质谱检测器（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００＋）；旋转蒸发器（ＨｅｉｄｏｐｈＢｏｒｏｔａ ４０００）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙酸铵（色谱纯。 Ｄｉｋｍａ公司）：实验用水为一级水：饲料添加剂维 不得检出 我国农业部也已将氯霉素从２０００年版 《中国兽药典》中删除列为禁药，并已制定了各种 措施禁止氯霉素的使用．但由于其价格低廉．疗效 显著．Ｉ临床使用氯霉素的现象仍屡禁不止，致使我 国出Ｅｌ的畜产品中频频检出氯霉素．严重影响了我 国对外贸易和产品的国际形象 维生素Ｂ 也称核黄素，天然的维生素Ｂ：存在 生素Ｂ：（核黄素）；氯霉素标准品（ｓｉｇｍａ公司）； 固相萃取小柱ＰｒｏＥｌｕｔ ＰＳＡ １ ｇ／６ ｍＬ（Ｃａｔ．＃６３２０６）、 ＰＬＳ ６０ｍｇ／３ ｍＬ（Ｃａｔ．＃６８００３）、ＰＸＡ １５０ ｍｇ／６ｍＬ （Ｃａｔ＃６８３０４）购自于Ｄｉｋｍａ公司。 （二）ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ分析条件 于食物当中．而作为畜禽使用的饲料添加剂的维生 素Ｂ 通常通过发酵工艺制备。在发酵过程中为防 止细菌的产生．常使用抑菌剂。由于氯霉素使用量 １．ＵＰＬＣ条件 色谱柱：Ｄｉｋｍａ Ｅｎｄｅａｖｏｒｓｉｌ Ｃｌ８，１００ｘ２．１ ｍｎｌ，１．８ ｍ （Ｃａｔ＃：８７００３）；流 速：Ｏ．２ ｍＬ／ｍｉｎ；进样量：５ Ｌ；柱温：３５℃； 低、疗效显著、价格便宜等优点，不法分子违禁将 其使用于核黄素的发酵工艺中。在对欧洲出口的核 黄素产品中检出微量氯霉素．严重影响我国饲料添 流动相：Ａ：１０ｍｍｏｌ／ｍＬ乙酸铵，Ｂ：乙腈：梯度 洗脱程序：０ ｍｉｎ，２０／８０（Ａ／Ｂ）；０～４ ｍｉｎ，线性 变化至５０／５０（Ａ／Ｂ）；４～４．５ ｍｉｎ．线性变化至 基金项目：国家标准化管理委员会国家标准制修订项目“饲料添加剂核黄素”。 作者简介：李兰（１９６６一），副研究员，从事饲料及畜产品检测及标准方法研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｌａｎ＠ｃａａｓ．ｃａ。 农产品质量与安全２０１７年第１期 ● ９０／１０（Ａ／Ｂ）；４．５～６ ｍｉｎ，９０／１０（Ａ／Ｂ）；６～６．５ ｍｉｎ，线性变化至２０／８０（ Ｂ）；６．５～１２ ｍｉｎ， ２０／８０（Ａ／Ｂ）。 大量的维生素Ｂ：会保留在水相中，从而达到初步 净化效果 （二）样品净化条件优化在乙酸乙酯体系中 ３种小柱对氯霉素均无吸附．即回收率符合要求， ２．质谱条件。电离模式：ＥＳＩ；扫描方式：负 离子扫描：检测方式：多反应监测；电喷雾电压： 但是ＰＬＳ、ＰＸＡ小柱净化后杂质较多，ＰＳＡ由于 其对强、弱酸均有吸附效果，吸附能力较强，所以 净化后无干扰，且回收率符合要求。 （三）线性关系、检出限与精密度 将１０ ￣ｅ，／ｍＬ氯霉素的水溶液逐级稀释到０．０８、０．１、０．２、 ４５００ Ｖ：雾化气压力：５０ ｐｓｉ；辅助气压力：５Ｏ ｐｓｉ；气帘气压力：２０ ｐｓｉ；离子源温度：５００℃； 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压 见表１ 表１ 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压 ０．５、１．０ｎｇ／ｍＬ，氯霉素在此浓度范围内具有良好的 线性关系．线性方程及相关系数列于表２。由表２可 见．本方法测定的氯霉素线性范围宽，灵敏度高。 表２氯霉素的线性方程、相关系数、检出限与精密度 ３．样品处理。（１）提取：取０．５ ｇ样品与１５ ｍＬ ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠．混匀．加２０ ｍＬ乙酸乙 酯混合，振荡２ ｍｉｎ，６ ０００ ｒｐｍ下离心２ ｍｉｎ，收 集上清液：将下层残留物用２０ ｍＬ乙酸乙酯重复 提取１次．合并两次上清液，记作上样液ｌ。待净 （四）加标回收率实验在维生素Ｂ：样品中添 化。（２）净化：加人１０ ｍＬ乙酸乙酯活化固相萃取 小柱；加入全部上样液１，调节液面下滴速度为１ ｍＬ／ｍｉｎ，并收集流出液，记作流出液ａ；加入５ ｍＬ乙酸乙酯．收集流出液，记作流出液ｂ，并与 ａ合并：将流出液在４０℃下减压蒸馏至干．用甲 加０．３ ｇ／ｌ（ｇ、０．６￣ｇ／ｋｇ、１．５ ｐ￣ｇ／ｋｇ ３个不同浓度的 氯霉素进行加标回收率实验．照样品的提取步骤提 取净化．上ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ测定并计算回收率．结果 详见表３。氯霉素多反应监测（ＭＲＭ）色谱图见 图ｌ。 醇定容至ｌ ｍＬ，过０．２２ ｍ微孔滤膜，供ＬＣ— ＭＳ／ＭＳ分析 从表３可以看出，在维生素Ｂ：中添加不同浓 度的氯霉素．平均回收率可达９９．７ｌ％；连续测定 ５次．批内变异系数为３．Ｏ６％．批间变异系数为 ４．７１ ．均在５％以内．准确度满足要求。 表３维生素Ｂ 样品中氯霉素加标回收率实验结果 一、皇日７ｌ二、结果与讨论 —＿Ｊ ’Ｊ 匕 本实验比较了３种固相萃取小柱在提取和净化 过程中的性能以及最终效果 ＰＬＳ为含有极性基团 的聚苯乙烯／二乙烯苯的中性聚合物．适合于水溶 液样品或有机溶剂中极性或非极性化合物的净化： ＰＸＡ为含季铵基团的聚苯乙烯／二乙烯苯的强阴离 子交换聚合物．适合于水溶液样品或有机溶剂中弱 酸性化合物的净化：ＰＳＡ为含乙二胺基一Ｎ一丙基 的硅胶基质阴离子交换填料．适合于水溶液样品或 有机溶剂中强、弱酸性化合物的净化。 （一）样品提取条件优化 采用纯水溶解和稀 ＮａＯＨ溶解．直接过３种固相萃取柱净化．杂质很 多．无法检测。采用纯水溶解和稀ＮａＯＨ溶解后， 乙酸乙酯萃取．由于氯霉素为中性物质．杂质维生 素Ｂ 为弱酸性物质。所以氯霉素会提取出来，而 铷 农产品质量与安全２０１７年第１期 ４．０４ 谱法的测定广东地区市售８类动物源食品中氯霉素残 留的调查分析［Ｊ］．广东化Ｔ，２０１６（４）：１１４—１１６． ［４］刘丽丽，刘谦，王宇．水产品中氯霉素检测条件的优化 ［Ｊ］．食品安全质量检测学报，２０１６（２）：６２３—６２８． ［５］孙艳波．液相色谱法检测食品中氯霉素残留研究［Ｊ］． 科技经济导刊，２０１６（３）：１２４． ［６］王仁华．浅谈氯霉素的概况及其检测方法［Ｊ］．湖南饲 料，２０１５（５）：２７—２９． ３．２２３ ３７ 一 …８ ５：４７ ［７］薄永恒，高迎春，陈玲，等．高效液相色谱串联质谱法 检测家禽组织中氯霉素残留量的研究［Ｊ］．中国家禽， ２０１４（１４）：３０－３４． ：：：ｉ ＩＩｌＩ ｈ■ Ｉ４－ ・ ． － Ｌ— Ｌ～…． …１．Ｊ Ｔｉｍｅ（ｒａｉｎ） 图１ 氯霉素（添加水平Ｏ．３￣ｇ／ｋｇ）多反应监测（ＭＲＭ） 色谱图 ［８］邱启东，李锦清，郦明浩，等．液相色谱一串联质谱法 测定乳制品中的氯霉素［Ｊ］．广东化工，２０１４（６）： １７８一ｌ７９． （五）实际样品的测定利用本方法对取得的 饲料添加剂维生素Ｂ 样品进行实际测定，仅有１ 个样品检出氯霉素，其含量为Ｏ．１９８ ６ ｔｘｇ／ｋｇ，高于 检出限０．０６￣ｇ／ｋｇ。 ［９］曾芳，黄玉芬，刘忠珍，等．高效液相色谱法测定土壤 和畜禽粪中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素［Ｊ］．广 东农业科学，２０１０（１０）：３８—４０． ［１０］李卓，董文宾，李娜，等．食品中氯霉素残留检测技 三、结论 本实验建立了饲料添加剂维生素Ｂ 中氯霉素 的ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ的检测方法．通过使用ＰｒｏＥｌｕｔ ＰＳＡ 术研究新进展［Ｊ］．食品工业科技，２０１０（４）：４０８— ４１１． ［１１］王秀芳，田勇，钟国英，等．氯霉素在活性炭上的吸 附平衡与动力学［Ｊ］．高校化学Ｔ程学报，２０１０（１）： １６２－１６５． 固相萃取小柱净化杂质能够达到所需分离度．进行 准确测定。该检测方法对于维生素Ｂ 的出１２贸易 提供了有效的检测手段。 ［１２］新一代氯霉素类动物专用广谱抗生素［Ｊ］．北方牧业， ２００９（４）：１３． ［１３］杜继红，周德刚，孙志文．氯霉素残留检测方法研究 本文引用格式：李兰，杨云霞，邓晓娟，等．应用 ＰｒｏＥｌｕｔ ＰＳＡ小柱净化、液相色谱串联质谱仪测定 综述ｆＡ］．首届中国兽药大会动物药品学暨中国畜牧兽 医学会动物药品学分会２００８学术年会论文集，２００８： ３２３——３２８ 饲料添加剂维生素Ｂ：中的氯霉素［Ｊ］．农产品质量 与安全，２０１７（１）：５９—６１． ＬＩ Ｌａｎ．ＹＡＮＧ Ｙｕｎｘｉａ，ＤＥＮＧ Ｘｉａｏｊｕａｎ，ｅｔ ａ１． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ｉｎ ｆｅｅｄ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ，ｂｙ ＰｒｏＥｌｕｔ ＰＳＡ ＣＯｌｕｍｎ ｐｕｒｉｉｃａｔｆｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｑｕａｌｉ— ｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆＡｇｒｏ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２０１７（１）：５９—６１． 参考文献 ［１］宗万里，鲁刚．基于液相色谱一串联质谱法的鱼肉中氯 霉素残留量测定［Ｊ］．成都大学学报（自然科学版）， ２０１６（１）：２７－２９． ［２］韩燕，管清梅，邹影．牛奶中氯霉素残留的高效液相色 谱法测定［Ｊ］．阜阳师范学院学报（自然科学版）， ２０１６（１）：３７－４０． ［３］张燕，韩振亚，苏焕斌，等．超高效液相色谱质谱／质 农产品质量与安全２０１７年第１期 ●
