福建农林大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＦｕｊｉａｎ Ａ￣ｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） 第４１卷第１期 ２０１２年１月 绿茶９１０ ＥＧＣＧ的提取工艺 陈团生 ，程祖锌 ，杨志坚 ，郑金贵 （１．福建农林大学农产品品质研究所；２．福建农林大学医院，福建福州３５０００２） 摘要：以绿茶９１０为原料，采用咖啡碱沉淀一溶剂萃取法对茶叶表没食子儿茶素没食子酸酯（ＥＧＣＧ）进行提取，运用二次 回归正交旋转组合设计方法分析各影响因子对ＥＧＣＧ提取纯度的影响．结果表明，各因子对ＥＧＣＧ提取纯度影响程度的大 小为：氯仿萃取次数＞乙酸丙酯萃取次数＞水浸提温度＞咖啡碱浓度＞己酸乙酯萃取次数．ＥＧＣＧ提取的最佳条件为：水浸 提温度８０ ，咖啡碱浓度３０ ｍｍｏｌ・Ｌ～，氯仿萃取次数为５，己酸乙酯、乙酸丙酯萃取次数均为３．根据最佳条件提取 ＥＧＣＧ，得到纯度为８０．３％的ＥＧＣＧ产品． 关键词：绿茶９１０；表没食子儿茶素没食子酸酯（ＥＧＣＧ）；工艺优化；高效液相色谱 中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－５４７０（２０１２）０１－００１８－０６ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ＥＧＣＧ ｆｒｏｍ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ＣＨＥＮ Ｔｕａｎ—ｓｈｅｎｇ ，ＣＨＥＮＧ Ｚｕ．ｘｉｎ ，ＹＡＮＧ Ｚｈｉ－ｊｉａｎ ，ＺＨＥＮＧ Ｊｉｎ．ｇｕｉ （１．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｑｕａｌｉｙｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｅｒｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；２．Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，ＦｕｊｉａＩＩ ３５０００２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－３’ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ）ｆｒｏｍ ｔｅａ ｂｙ ｃａｆｆｅｉｎｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｌｖｅｎｔ ｐａｒｔｉｉｔｏｎ，ｔｈｅ ｅｘｐｅｆｉ— ｍｅｎｔ ｏｆｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＥＧＣＧ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｅａ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｔａｔｉｏｎ・・ｅｒｇｒｅｓｓｉｏｎ・・ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌｓ ｗｉｈｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｙｔ ｏｆ ＥＧＣＧ ａｓ ｔａｒｇｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂ￣ｓｈｅｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＣＧ ｆｒｏｍ ｔｅａ ｉｎ ｃａｆｅｉｎｅ ｐｒｅｃｉｐｉａｔｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｌｖｅｎｔ ｐａｒｔｉｉｔｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｗａｔｅｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｃａｆｆｅｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐａｒｔｉｉｔｏｎ ｉｗｔｈ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，ｗｉｔｈ ｅｔｈｙｌ ｈｅｘａｎｏａｔｅ，ａｎｄ ｉｗｔｈ ｐｒｏｐｙｌ ａｃｅｔａｔｅ・Ａｄｄｉｉｔｏｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌ Ｗａｓ ｗｅｌｌ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ＥＧＣＧ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｒａｎｇｅ．Ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｔｈｅ ＥＧＣＧ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ Ｗａｓ ｏｂｔｍｎｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｗａｓ ｇａｉｎｅｄ ｎａｄ ｔｈｅｎ ｍｅｓａｕｒｅｄ ｂｙ ｈｉｓｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ＥＧＣＧ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ｗａｔｅｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，８０℃；ｃａｆｅｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，３０ ｍｍｏｌ・ Ｌ～；ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐａｒｔｉｉｔｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，５；ｗｉｔｈ ｅｔｈｙｌ ｈｅｘａｎｏａｔｅ，３；ａｎｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｐｙｌ ａｃｅｔａｔｅ，３．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐａ－ ｒａｍｅｔｅｒｓ，ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｆｉｎａｌｌｙ ｉｔｓ ｐｕｒｉｙｔ Ｗａｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ８０．３％，８ｓ ｊｕｄｇｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ９１０；ｅｐｉｇａｌｌｃｅａｔｅｃｈｉｎ－３－ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＣ）；ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｐｔｉｉｍｚａｔｉｏｎ；ｈｉｓｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ＨＰＬＣ） 茶叶中含有许多生物活性成分，其中最主要的功能成分是茶多酚，茶多酚是由多酚类衍生物组成的混 合体Ⅲ．茶多酚中最主要的成分是儿茶素，属黄烷醇类化合物．茶叶中的儿茶素是２一苯基苯并吡喃的衍生 物，主要可分为４种类型：表儿茶素（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ，ＥＣ）、表没食子儿茶素（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ，ＥＧＣ）、表儿茶素 没食子酸酯（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ，ＥＣＧ）、表没食子儿茶素没食子酸酯（ｅｐｉｇａＵｏｃａｔｅｃｈｉｎ－３一ｇａｌｌａｔｅ，ＥＧＣＧ），其 中又以ＥＧＣＧ最为重要 ］．ＥＧＣＧ是儿茶素中生物活性最强的一种成分 】，属非酶类抗氧化剂，具有明显 的清除体内自由基 引、抗癌 、抗炎 引、抗突变 和抗衰老 等生物活性，现已被当作抗癌前体药物在进 行研究 】．随着人们对ＥＧＣＧ研究的深入，以及ＥＧＣＧ许多药理作用被进一步证实，国内外对ＥＧＣＧ单体 的分离提取工艺也有众多的研究．目前ＥＧＣＧ的提取多是通过先制备茶多酚，再进一步分离纯化得到 ＥＧＣＧ．根据ＥＧＣＧ的结构特性、溶解度及络合性能等理化性质，国内外茶多酚粗品的提取方法主要有水和 有机溶剂提取法 。。、离子沉淀法 ｎ 、层析柱分离法 心 引、低温纯化酶法 引、超临界流体萃取法ｎ 引、膜 分离法ｍ】、超声波浸提方法¨引、高效液相色谱法（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ） 等方 收稿日期：２０ｌｌ—ｏ４—１８ 修回日期：２０１１—０５—１８ 基金项目：福楚省高校服务海西建设重点项目（０ｂ０￥ｂ００５）． 作者简介：陈团生（１９７４一），男，主治医师，博士研究生．研究方向：药理品质生物技术．通讯作者郑金贵（１９４９一）。男，教授，博士生导师．研 究方向：农产品品质．Ｅｍａｉｌ：ｊｇｚｈｅｎ￣＠巧ａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ． 第１期 陈团生等：绿茶９１０ ＥＧＣＧ的提取工艺 ・ｌ９・ 法，先提取茶多酚粗品，再进一步进行纯化．纯化的方法主要还是以色谱分离为主 ，利用儿茶素各单体 之间理化性质的差异，选择不同的吸／脱附剂，使之与其他物质分离． 咖啡碱沉淀一溶剂萃取法由Ｃｏｐｅｌａｎｄ［２¨首先采用，其原理是利用咖啡碱易于与酯型儿茶素络合沉淀 的特性，加热后络合物在水中溶解，采用氯仿萃取除去咖啡碱，再用己酸酯作为萃取剂，分离出ＥＣＧ和 ＥＧＣＧ，最后用乙酸丙酯作为萃取剂，将ＥＣＧ与ＥＧＣＧ‘分离，得到ＥＧＣＧ产品．本试验采用简便的咖啡碱沉 淀—溶剂萃取法进行茶叶ＥＧＣＧ的提取，以产品ＥＧＣＧ纯度（质量分数）为考察值，采用二次回归旋转组 合设计方法，对影响ＥＧＣＧ提取的相关因子进行研究，建立数学模型并进行优化，确定提取的最佳条件；再 根据模型的最佳条件，以高含量ＥＧＣＧ绿茶９１０为原料进行分离提取，得到ＥＧＣＧ样品，并采用ＨＰＬＣ检 测样品ＥＧＣＧ的纯度，验证数学模型的可靠性．利用数学模型优化咖啡碱沉淀一溶剂萃取法从茶叶中分离 提取ＥＧＣＧ的研究尚未见报道，本试验旨在为工业化生产和实验室制备ＥＧＣＧ提供理论和实践基础． １材料与方法 １．１样品和试剂 高含量ＥＧＣＧ绿茶９１０由福建农林大学农产品品质研究所提供，ＥＧＣＧ标准品购自上海友思生物制 品有限公司，咖啡碱、己酸乙酯、乙酸丙酯、氯仿、乙醇、甲醇、乙酸等均为色谱纯． １．２仪器设备 主要仪器设备有Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Ｗａｔｅｓｒ ２９９６检测仪（美国沃特世公 司）；ＲＥ－５２０３型旋转蒸发器（南京智拓仪器仪表有限公司）、真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限 公司）等． １．３工艺流程 咖啡碱与酯型儿茶素络合沉淀，沉淀溶于热水，用氯仿分离咖啡碱，再用己酸乙酯、乙酸丙酯萃取出 ＥＧＣＧ，旋转蒸发后沉淀重新溶解于反渗透水中，最后冷冻干燥即得到ＥＧＣＧ干粉． 步骤：茶叶坚浸提液｛ 誊沉淀物堡重悬液 驾有机相号 水相 酯 相 重悬液 ＧＣＧ干粉． １．４试验方案 试验采用二次回归正交旋转组合设计方法，运用５因子５水平二次回归旋转组合设计，共计３６个试 验点，以优化ＥＧＣＧ的提取工艺．以影响ＥＧＣＧ分离提取的水浸提温度（ ）、咖啡碱浓度（ ）、氯仿萃取 次数（ ）、己酸乙酯萃取次数（蜀）、乙酸丙酯萃取次数（ ）５个因子为自变量，以所得干粉的ＥＧＣＧ纯度 （质量分数）为考察值，试验因素以及水平设计如表１所示．对影响绿茶ＥＧＣＧ提取的相关因子作进一步 的研究，并对建立的数学模型进行优化，以确定提取的最佳条件．再根据模型的最佳条件，以高含量ＥＧＣＧ 绿茶９１０为原料进行分离提取，得到ＥＧＣＧ样品，并采用ＨＰＬＣ检测样品ＥＧＣＧ的纯度，验证数学模型的 可靠性． 表１影响因子及水平编码表 Ｔａｂｌｅ １ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔｓ １．５统计方法 试验处理步骤采用五元二次正交旋转设计（表２），运用ＤＩ Ｓ统计软件进行数据分析． １．６样品ＥＧＣＧ纯度的ＨＰＬＣ检测 １．６・１ 样品处理样品溶解于流动相（１００％甲醇：１％乙酸＝２：８），上样前经０．２２ ｉｘｍ孔径的滤膜过滤． ・２０・ 福建农林大学学报（自然科学版） 表２二次正交旋转试验结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆｑｕａｄｒｉｅ ｒｅｇ￣ｓｉｏｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｒｏｔａｒｙｔｅｓｔ ０ｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＥＧＣＧｆｒｏｍｔｅａ 第４１卷 编号 １ Ｉ １．０ｏ０ Ｘ２ １．００Ｏ Ｘ３ １．０００ 以 １．０ｏ０ １．Ｏ００ Ｙ／％ ４４．９Ｏ 编号 １９ ｌ ０．０００ —２．０００ ０．Ｏ０ｏ ０．Ｏ００ ０．Ｏ０ｏ Ｙ／％ ４６．Ｏ１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ １．Ｏ０ｏ １．０００ １．０００ １．００ｏ １．Ｏ００—１．０００—１．Ｏ００ １．０００—１．ｏ００ １．０ｏＯ 一１．Ｏ０ｏ １．００Ｏ １．０００ ５４．００ ３Ｏ．９０ ５Ｏ．２Ｏ ５５．６ｏ ４８．６ｏ ４５．９０ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ０．０００ ０．ｏ（）０ Ｏ．Ｏ∞ Ｏ．Ｏ０ｏ ０．０００ ０．０ｏ０ ２．Ｏ０ｏ ０．Ｏ０ｏ Ｏ．Ｏ０ｏ一２．Ｏ００ Ｏ．Ｏ００ ２．Ｏｏ０ ０．Ｏ００ Ｏ．Ｏ０ｏ Ｏ．０ｏ０ ０．Ｏ０ｏ ０．０００ Ｏ．Ｏ００ ０．Ｏ０ｏ Ｏ．Ｏ０ｏ １９．７Ｏ ２９．４８ ６８．３ｌ ３４．２ｏ ３９．８２ ２５．９０ １．００ｏ一１．０００ １．ｏｏＯ—１．０（）ｏ一１．０（）ｏ １．０（）０ １．０００１．Ｏ００一１．００Ｏ １．０ｏＯ—１．Ｏ００ ０．０００ ０．Ｏ００—２．Ｏ０ｏ ０．０００ ０．Ｏ０ｏ Ｏ．００ｏ ０．Ｏｏｏ ２．０（）ｏ １．０００—１．０００ １．０００ １．Ｏ０ｏ一１．０００—１．０００ Ｏ．Ｏ００—２．Ｏ０ｏ ８ ９ １０ ｌ１ ｌ２ １３ ｌ４ １５ １６ １７ １８ １．００ｏ一１．０００—１．０００一１．０００—１．０００ ４２．５０ —１．０ｏ０ —１．００ｏ —１．Ｏ０ｏ —１．０００ １．０００ １．０（）０ １．０００ １．０００—１．０００ １．０００ １．０００ ４７．５７ ４８．３７ ４０．０２ ３６．Ｏ０ ４５．７０ ３５．６４ ２０．６０ ３４．２１ ４５．９４ ３２．８９ ２６ ２７ ２８ ２９ ３Ｏ ３１ ３２ ３３ ３４ ３５ ３６ ０．０００ ０．０００ Ｏ．０（）ｏ ０．０ｏＯ ０．Ｏｏｏ Ｏ．０ｏＯ Ｏ．０００ Ｏ．Ｏ００ ０．０ｏＯ Ｏ．００ｏ ０．Ｏ０ｏ ０．０００ ０．０（）ｏ ０．０００ ０．Ｏ０ｏ ０．Ｏ００ ０．０ｏ０ ０．Ｏ００ Ｏ．Ｏ００ ０．Ｏ００ Ｏ．Ｏ０ｏ ０．０（）ｏ ０．Ｏ００ Ｏ．０００ ０．Ｏ０ｏ Ｏ．Ｏ０ｏ ０．Ｏｏｏ Ｏ．Ｏ００ Ｏ．Ｏ０ｏ ０．０（）０ ０．Ｏ０ｏ Ｏ．Ｏ００ Ｏ．Ｏ０ｏ ０．Ｏ００ Ｏ．Ｏ０ｏ ０．００ｏ Ｏ．Ｏ０ｏ Ｏ．０ｏ０ Ｏ．０ｏ０ Ｏ．Ｏ００ Ｏ．０００ Ｏ．００ｏ Ｏ．０００ Ｏ．Ｏ０ｏ ２．０ｏ０ ０．０００ Ｏ．Ｏ０ｏ Ｏ．Ｏ０ｏ ０．Ｏ０ｏ ０．Ｏ０ｏ Ｏ．Ｏ０ｏ Ｏ．Ｏ００ Ｏ．Ｏｏ０ ３９．Ｏ８ ５９．７５ ７５．３７ ７４．９６ ７３．３Ｏ ８０．１Ｏ ５８．９ｏ ７６．１Ｏ １．０００—１．０００ １．０００ １．ｏ（）０—１．０００ １．０Ｏ０—１．０００１．０００ １．０００—１．０００—１．ＯＯ０ １．０００ １．０００ —１．０ｏＯ一１．０００ —１．０ｏ０—１．０００ —１．０００—１．０００一１．０００ １．０００—１．０００ —１．０００ ０．０００ ０．０００ １．０００ ０．０００ ０．０００ —１．０００—１．０００ —１．Ｏ００—１．０００—１．０００—２．０００ ２．０００ ０．０００ ０．０００ ０．０００ ０．０００ ６４．２８ ｍ ０．Ｏ０ｏ ５８．２６ 仉仉 Ｏ．０（）０ ６７．０ｏ ｍ啪 眦哪嘲ｉ８ ６ ４ ２ Ｏ畦６睥 Ｄ 宝 眦啪 １．６．２高效液相色谱参数ｓｕＩｌｆｉｒｅ Ｃ１８色谱柱：５ Ｘ４６ Ｉｎｎｌ ｘ １５０ ｍｍ；流动相：１００％甲醇：１％乙酸＝ ２：８，等度洗脱；流量：１ ｍＬ・ｒａｉｎ～；检测波长：２７６ ｎｍ；柱温：３５ ｏＣ；进样体积：３０ ；保留时间：１５ ｒａｉｎ． １．６．３标准曲线的绘制 称取ＥＧＣＧ标准品１．０００ ｎａｇ，加流动相（１００％甲醇：１％乙酸＝２：８）溶液定容 至５ ｍＬ，摇匀，作为对照品母溶液．分别精密吸取对照品溶液０．２５０、０．３７５、Ｏ．７５０、１．０００ ｍＬ于具塞试管 中，再用流动相溶液定容至１ ＩＩｌＬ，另取流动相溶液作随行空白对照，分别编号１、２、３、４，０，读取液相色谱图 （图１）．以峰面积为纵坐标，ＥＣＩ２Ｇ纯度为横坐标绘制标准曲线． ０．０５Ｏ ０．Ｏ４Ｏ ０．Ｏ３０ 自 Ｏ．０２Ｏ ０．０１０ ０．０００ ２ ６ ｌＯ ｌ４ ２ ６ ｌＯ ｌ４ 保留时间／口ｌｉｎ 保留时间／ｍｉｎ 围１ Ｉ￣．ＧＣＧ标准品和ＥＣＴＣＣＴ样品色谱图 Ｆｉｇ．１ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ＥＧＣＧ ｓｔａｓａｄｌｍｔ，，ｉｒｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １．６．４样品ＥＧＣＧ纯度的计算标准曲线经统计分析得到线性回归方程，各样品液相色谱图峰面积经计 算得到样品ＥＧＣＧ的纯度． ２结果与分析 ２．１标准曲线 根据液相色谱图，以峰面积为纵坐标，ＥＧＣＣ，纯度为横坐标绘制标准曲线．标准曲线经统计分析得到 线性回归方程为：Ｙ＝Ｏ．３９８６ ＋１９．３７８，Ｒ ＝０．９７２６（１，为液相色谱图峰面积， 为ＥＧＣＧ纯度）・所得干粉 ＥＧＣＧ纯度为目标函数，采用二次回归正交旋转设计对提取工艺进行优化． ２．２提取工艺参数的优化 各影响因子对ＥＧＣＧ纯度的影响不是简单的线性关系，为了更明确各因子对其的影响，采用ＤＰＳ软 第１期 陈团生等：绿茶９１０ ＥＧＣＧ的提取工艺 ・２１・ 件对表２的结果进行多元回归分析，得到如下回归数学模型：Ｙ＝６７．４６０＋１．６００ Ｘ 一１．２２５ ＋６．５７１墨 一０．２９５咒＋２．５６０正一５．３３４ 一６．９７４罡一２．９６４霹一５．９３５罄一７．０６５墨一３．０２６ Ｘ１ 一０．８０３ ｌ 一 方差分析（表３）可知，回归方程显著性检验Ｆ ＝３．６０６＜５．８００＝Ｆｏ．唧（６，９），拟合性良好，说明未控因 １．１０４五墨一１．３６８置 一Ｏ．２８８ ｘ２ 一２．００２ 五一０．３１６ Ｘ２墨＋２．０４１恐墨一２．８４８恐墨＋０．５３８墨Ｘｓ． 素对试验处理的影响不明显，误差是随机的，可认为所选用的二次回归模型是适当的；回归均方显著性检 验 ＝２．６７２＞２．３３０＝ ．∞（２０，１５），达到显著水平，说明５个因子与产品ＥＧＣＧ纯度之间的关系达到显 著水平．对ａ＝０．１０显著水平剔除不显著项后，简化的回归方程为：ｙ＝６７．４６０＋６．５７１驾一５．３３４ 一 ６．９７４跫一５．９３５墨一７．０６５霹． 表３ ＥＧＣＧ提取试验结果方差分析 Ｔａｂｌｅ ３ Ｖａｒｉａｎｃｅ￣ｍｌｙｓｉｓｆｏｒｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆＥＧＣＧ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ 变异来源 平方和 ， 自由度 １ １ 均方 ６１．４０８ ３６．０３４ Ｆ ０．４５３ ０．２６６ ｜Ｐ ０．５１１ ０．６１４ 变异来源 平方和 ２９．９４８ １．３２８ 自由度 １ １ 均方 ２９．９４８ １．３２８ ， ０．２２１ ０．０１０ Ｐ ０．６４５ ０．９２２ ６１．４０８ ３６．０４０ １０３６．３５２ 也 丘 １ １ １ １０３６．３５２ ２．０９５ １５７．３３８ ７．６５０ ０．０１５ １．１６１ ０．０１４ ０．９０３ ０．２９８ 五 ６４．１２０ １．５９４ ６６．６２６ １ １ １ ６４．１２０ １．５９４ ６ｔ５．６２６ ０．４７３ ０．０１２ ０．４９２ ０．５０２ ０．９１５ ０．４９４ ２．０９５ １５７．３７６ ９１０．３２９ １５５６．２１６ １ １ ９１０．３２９ １５５６．２１６ ６．７２０ １１．４８８ ０．０２０ ０．００５ 墨五 １２９．７８９ ４．６３３ １ １ １２９．７８９ ４．６３３ ０．９５８ ０．０３４ ０．３４３ ０．８５６ Ｘ｛ ２８１．Ｏ６２ ｌ ２８１．Ｏ６２ ２．Ｏ７５ Ｏ．１７Ｏ 回归 ７２３９．５２６ ２０ ３６１．９７６ ＝２．６７２ Ｏ．０２１ ｘ： Ｘ Ｘｌ Ｘ２ Ｘｌ Ｘ３ Ｘ１ Ｘ４ １１２７．１３６ １５９／．２０８ ｌ４６．４７１ １０．３２０ １９．５１４ １ １ １ １ １ １１２７．１３６ １５９７．２０８ １４６．４７１ １０．３２０ １９．５１４ ８．３２０ １１．７９０ １．０８１ ０．０７６ ０．１４４ ０．０１１ ０．００４ ０．３１５ ０．７８６ ０．７１０ 剩余 ２０３２．０５０ 失拟１４３５．０３５ 误差 ５９７．０１５ 总和 ９２７１．５７６ １５ ６ ９ ３５ １３５．４７Ｏ ２３９．１７３，】－－３．６ｏ６ ０．０２０ ６６．３３５ ２．３回归方程的模拟寻优 根据取得的回归方程，通过计算机模拟寻优得出最高纯度ＥＧＣＧ产品的优化组合为：五＝Ｏ， ＝Ｏ， ＝２，墨＝０， ＝０．即咖啡碱沉淀—溶剂萃取法分离提取ＥＧＣＧ的最佳条件为：水浸提温度８０℃，咖啡碱 浓度３０ ｍｍｏｌ・Ｌ～，氯仿萃取５次，己酸乙酯、乙酸丙酯均萃取３次，通过线性回归方程求得ＥＧＣＧ的纯度 为８０．６％． ２．４影响因子效应分析 将选取的４个因子固定为零水平，考察第５个因子与产品ＥＧＣＧ纯度之间的关系，根据第５个因子与 ＥＧＣＧ纯度的相关性得到曲线关系图（图２）． 产品ＥＧＣＧ纯度随着水浸提温度的升高呈现先升高后降低的趋势．温度较低时，温度对细胞壁的溶胀 效果不好，根据分子热运动理论，细胞内分子运动缓慢，不能完全离开细胞内部，随着温度升高细胞壁破裂 逐渐增加，分子运动速度加快，细胞内容物逐渐溶出；但当超过某一温度以后，温度的影响会造成ＥＧＣＧ分 子改变原有的结构，而且其他杂质的溶解率也升高，导致ＥＧＣＧ纯度下降．可见，水浸提温度应选取一个最 佳值，并非越高越好．随着咖啡碱浓度的提高，ＥＧＣＧ的纯度也呈现先升高后降低的趋势．由于咖啡碱与酯 型儿茶素络合沉淀时有一个最佳值，当咖啡碱浓度超过这一最佳值时，咖啡碱本身就变成一个影响ＥＧＣＧ 纯度的杂质．本试验中，氯仿的萃取次数越多，ＥＧＣＧ的纯度就越高．表明氯仿的萃取能去除咖啡碱等杂 质，提高ＥＧＣＧ的纯度，随着氯仿萃取次数的增加，ＥＧＣＧ纯度稳定在一定水平．己酸乙酯的萃取次数对 ＥＧＣＧ纯度的影响也呈现先升高后降低的趋势．己酸乙酯萃取主要是将ＥＣＧ与ＥＧＣＧ分离，萃取至ＥＣＧ 含量降低到一定水平时，会有一部分ＥＧＣＧ从溶液中萃取出来而流失，导致杂质比例升高，使ＥＧＣＧ纯度 下降．乙酸丙酯萃取次数增加会导致ＥＧＣＧ纯度先升高后降低，由于ＥＧＣＧ在乙酸丙酯中的溶解度极高， ＥＧＣＧ的ｌ纯度开始时会随着萃取次数的增加而增高；随着ＥＧＣＧ纯度下降，再增加萃取次数会同时将其他 可溶性杂质萃取出来，从而影响ＥＧＣＧ的纯度． ・２２・ 福建农林大学学报（自然科学版） 第４１卷 零＼越 ０：ｖ Ｈ ∞ ∞ ∞ ∞ 如 ∞ ∞ －２．０ －１．５ —１，０ －０５ 。０．０ ０．５ １．０ 因子水平 图２影响因子与ＥＧＣＧ纯度的关系 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ＥＧＣＧ ｐｕｔｔｙ ２．５最佳数学模型验证 采用二次回归正交旋转组合设计方法，对咖啡碱沉淀一溶剂萃取法条件进行优化，确定分离提取 ＥＧＣＧ的最佳工艺条件．按照最佳工艺条件制定提取方案，以高含量ＥＧＣＧ绿茶９１０为原料进行分离提 取，产品ＥＧＣＧ的纯度经ＨＰＬＣ检测为８０．３％（图１）． ３结论 本试验以绿茶９１０为原料，利用二次回归正交旋转组合设计方法分析各影响因子对ＥＧＣＧ提取纯度 的影响．结果显示，各因子对ＥＧＣＧ提取纯度影响程度的大小为：氯仿萃取次数＞乙酸丙酯萃取次数＞水 浸提温度＞咖啡碱浓度＞己酸乙酯萃取次数．确定了ＥＧＣＧ提取的最佳工艺条件为：水浸提温度８Ｏ℃，咖 啡碱浓度３０ ｍｍｏｌ・Ｌ～，氯仿萃取５次，己酸乙酯、乙酸丙酯均萃取３次．根据最佳条件进行ＥＧＣＧ提取试 验，得到纯度为８０．３％的ＥＧＣＧ产品，表明可直接从茶叶中分离提取得到高纯度的ＥＧＣＧ产品． 咖啡碱沉淀—溶剂萃取法使用安全、低毒、廉价的材料，采用相对简单、操作简便的提取工艺，进行 ＥＧＣＧ的分离提取，优化出了符合实际条件的提取参数，运用数学模型得到了最佳的工艺条件，获得高纯 度的ＥＧＣＧ产品．这是一种从茶叶中直接得到纯度较高含量ＥＧＣＧ产品的廉价简易方法，为工业化生产和 实验室制备ＥＧＣＧ提供理论和实践基础． 参考文献 ［１］郑金贵．农产品品质学（第一卷）［Ｍ］．厦门：厦门大学出版社，２００４：３３８—３５０． ［２］ＤＡＬＥ Ｇ Ｎ，ＤＡＮＥＥＬ Ｆ，ＺＨＯＵ Ｙ Ｄ．Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－３一ｓａｕ＝ｅ（ＥＧＣＧ）：Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙ— ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，６７（１７）：１８４９—１８５５． ［３］ＧＬＥＮＮ Ｓ，ＶＡＮ Ａ，ＪＥＦＦ Ｄ，ｅｔ ａｌ，Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ），ｔｔ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ￣＇ｅｅｎ ｔｅａ，ｉｓ ａ ｄｕａｌ ｐｈｏｓ－ ｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－３．ｋｉｎａｓｅ／ｍＴＯＲ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１ １，４０６（２）：１９４— １９９． ［４］ＪＯＡＮ ０，ＦＡＷＺＩＡ Ｂ Ｇ，ＢＲＩＴＹＡＮＹ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ，ＥＧＣＧ，ｃａｔｅｃｈｉｎ ａｎｄ ｂｅｔａｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１１，９ｏ（３）：２９５－２９９． ［５］ＭＥＥＲＡＮ Ｓ Ｍ，ＰＡＴＥＬ Ｓ Ｎ，ＣＨＡＩＮ Ｔ Ｈ，ｃｔ ａ１．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｄｒｕｇ ｏｆ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－３一ｇａｌｌａｔｅ：ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｈＴＥＲＴ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ），２０１１，１６（１）：１１４０—１１５８． ［６］ＬＩ Ｗ，ＺＨＵ Ｓ，ⅡＪ Ｈ，ｅｔ ａ１．ＥＣＡ２Ｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＨＭＧＢＩ ｌｅｖｅｌ８ ｉｎ ｅｎｄｏｔｏｘｌｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｍａｃｍｐｈ￣ｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１１，８１（９）：１１５２—１１６３． ［７］王小勇，毕志刚．表没食子儿茶酚没食子酸酯对ＵＶＡ抑制真皮成纤维细胞胶原合成影响的研究［Ｊ］．临床皮肤科杂志， ２００５，３４（９）：５７０—５７２． 第１期 陈团生等：绿茶９１０ ＥＧＣＧ的提取工艺 ・２３・ ［８］朱洁，金颂良，周炳荣，等．茶多酚提取物ＥＧＣＧ对人皮肤成纤维细胞自然老化及慢性光损伤的影响［Ｊ］．中国药学杂 志，２００８，４３（１）：２３—２７． ［９］ＣＨＥＮ Ｄ，ＷＡＮ Ｓ Ｂ，ＹＡＮＧ Ｈ，ｅｔ ａ１．ＥＧＣＧ，ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｎａｌａｏｇｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｒｇｓ ｎｆｏｒｈｕｍａｎ ｃａｎｃ－ ｅｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＣｌｉｍｃＭ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，５３（７）：１５５—１７７． ［１Ｏ］张肃，梁钢，雷耀兴．从广西绿茶中提取茶多酚及分离单体成分［Ｊ］．广西医科大学学报，２００３，２０（６）：８９１—８９２． ［１１］蒋建平，陈洪，汪秋安，等．茶多酚的离子沉淀法提取及其成分分析［Ｊ］．株洲工业学院学报，２００４，１８（５）：５４－５６． ［１２］杨磊，高彦华，祖元刚，等．中压硅胶柱层析连续纯化茶叶中ＥＧＣＧ及ＥＣＧ的研究［Ｊ］．林产化学与工业，２００７，２７（２）： １００—１０４． ［１３］ＺＨＯＮＧ Ｓ Ａ，ＺＨＯＵ Ｃ Ｓ，ＹＡＮＧ Ｊ Ｙ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｎｄ ａｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆｅｓｔｅｒ ｅａｔｅｈｌｎｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ－ ｐｂｙ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｗｏｒｌｄ，２００３（５）：２３７—２４０． ［１４］ＺＨＡＮＧ ｘ Ｈ，ＨＵＯ Ｂ Ｈ，ＳＨＥＮ Ｓ Ｙ．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｈｔｅ ｎｅｗ ｔｅｅｈｏｎｏｌｏｇｙ ０ｆ ｅａｔｅｃｈｉｎｓ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ＥＣ，ＣＧ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｔｅａ，２ＯＯ２，２８（３）：１３６—１３７． ［１５］李军，马耀声．茶多酚超临界萃取法研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，１９９６，８（３）：４２—４７． ［１６］ＭＩ ｘ Ｌ，ＹＡＮＧ Ｙ，ＹＵＡＮ Ｊ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｙ ０ｆｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ＥＧＣＧ ｎａｄ ｏｔｈｅｒ ｅａｔｅｈｌｎｓ ｆｒｏｍ ｔｅａ ｂｙ ｓｕｐｅｒｃｒｉｉｔａｅｌ ａｅｒｂｏｍ ｄｉｏｘｉｄｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ｔｅａ，１９９７（６）：１８２—１９１． ［１７］李振武，张效林，张卫，等．茶叶活性成分综合提取过程研究［Ｊ］．化学工程，２００６，３４（１０）：４６—５０． ［１８］陈素艳，邓清莲，巫晶晶，等．超声波法从茶叶中提取苯多酚［Ｊ］．渤海大学学报：自然科学版，２００５，２６（４）：３１６—３１９． ［１９］张莹，施兆鹏，聂洪勇，等．制备型逆流色谱分离绿茶提取物中儿茶素单体［Ｊ］．湖南农业大学学报：自然科学版，２００３， ２９（５）：４０８－４１７． 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