植物体内生长素的种类很多，其中吲哚乙酸（ 1AA ）是植物体内普遍存在的一种生长素。于不同的生育期测定不同器官中 IAA 的含量以及 IAA 氧化酶的活性，对于研究植物的生长、发育、衰老、脱落等均有重要意义。
Ⅰ 吲哚乙酸含量的测定
一、原理
1947 年，我国植物生理学家汤玉玮等发现，在无机酸存在下，吲哚乙酸能与 FeCl 3 作用，生成红色的鳌合物。该物质在 530 nm 有最大吸收峰，由此引出 IAA 的比色定量测定，此法可测出 μg 量级的 IAA 。
二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 玉米种子。 （二）试剂
1. IAA 标准溶液：精确称取 IAA （ A.R. ） 10 mg ，先用少量乙醇溶解，后用蒸馏水定容至 100 mL （其浓度为 100 μg/mL ）作为贮备液；然后用贮备液配成 0 （空白）、 0.5 、 1.0 、 5.0 、 10.0 、 15.0 、 20.0 、 25.0 μg/mL 的系列浓度标准溶液，作为工作液（现用现配）。 2. 试剂 A ：内含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 15 mL 、浓 H 2 SO 4 （比重 1.84 ） 300 mL 、蒸馏水 500 mL ，于使用前混合摇匀，避光保存， l mL 试液需加此试剂 4 mL 。
3. 试剂 B ：内含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 10 mL 、 35 ％高氯酸 500 mL ，于使用前混合摇匀，避光保存， l mL 试液应加此试剂 2 mL 。试剂 A 与试剂 B 可任选一种（试剂 B 比试剂 A 灵敏）。
4. 0.1 mol/L NaOH 溶液。 5. 甲醇。 （三）仪器设备
分光光度计，离心机，粉碎机，天平，水浴锅，移液管，大试管，烧杯。 三、实验步骤
1. 标准曲线绘制 取干洁大试管 8 支（ 0 ～ 7 号），依次加入 IAA 系列浓度工作液 2 mL ，分别加入试剂 B 4 mL （或试剂 A 8 mL ），于 40 ℃温箱中暗保温 30 min （加速显色反应）；于 530 nm 下比色，以 OD 值为纵坐标，以 IAA 浓度（ μg/mL ）为横坐标，绘出一条标准曲线。
2. 生长素的提取与测定 将风干的玉米种子（最好是白玉米）用粉碎机磨成细粉（约 lmm 大小的细粒，太粗提取不完全，太细加热时易糊化而使离心困难）；称取粉末 10 g 装入烧杯，加入 0.1 mol/L NaOH 溶液 40 mL ，于 100 ℃水浴中煮沸 15 min （上面加盖防止水分蒸干）；取出烧杯后再向其内加入 0.1 mol/L NaOH 溶液 25 mL ，充分摇匀，用甲醇定容至 100 mL ，静置 30 min ，取上层液离心 30 min ，上清液即为 IAA 提取液。
取干洁大试管 2 支，依次各加入上述样品 IAA 提取液 2 mL 和试剂 B 4 mL （或试剂 A 8 mL ），于 40 ℃温箱中显色 30 min ，在 530 nm 下比色（以标准曲线的“ 0 ”调零），记录 OD 值。 四、结果计算
式中： A ——标准曲线上查得的 IAA 量， μg 。
V l ——样品提取液体积， mL 。 W ——样品重量， g 。
V 2 ——样品反应液体积， mL 。
Ⅱ 吲哚乙酸氧化酶活性的测定
一、原理
吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶作用下，被分解成不活跃的物质。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平起着重要的作用。酶活力的大小可用其破坏吲哚乙酸的速度表示，吲哚乙酸的含量可用比色法测定。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料
大豆或绿豆幼苗的下胚轴。 （二）试剂
1 ． 0.02 mol/L 磷酸缓冲液（ pH6.1 ）。
2 ． 1 mmol/L MnCl 2 ：称取 MnCl 2 · 4H 2 O 19.8 mg 用蒸馏水定容至 100mL 。 3 ． 1 mmol/L 2,4 –二氯酚：称取二氯酚 16.3 mg 用蒸馏水定容至 100mL 。 4 ． 200 μg /mL IAA 。
5 ．试剂 A ：内含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 15 mL 、浓 H 2 SO 4 （比重 1.84 ） 300 mL 、蒸馏水 500 mL ，于使用前混合摇匀，避光保存， l mL 试液需加此试剂 4 mL 。
6 ．试剂 B ：内含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 10 mL 、 35 ％高氯酸 500 mL ，于使用前混合摇匀，避光保存， l mL 试液应加此试剂 2 mL 。试剂 A 与试剂 B 可任选一种（试剂 B 比试剂 A 灵敏）。 （三）仪器设备
分光光度计，离心机，研钵，移液管（ 5 mL 2 支， 2 mL 2 支， 1 mL 4 支），烧杯 1 个，恒温水浴，天平，试管 12 支。 三、实验步骤
1. 吲哚乙酸氧化酶的制备
（ 1 ）将大豆或绿豆种子于 30 ℃温箱中萌发 3 ～ 4 天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作实验材料。
（ 2 ）取 20 株下胚轴，称得重量，置于研钵中加入冰冷的磷酸缓冲液（ pH6.1 ） 5 mL 及石英砂少许，于冰浴中研磨成匀浆，再按 100 mg 鲜重加 1 mL 缓冲液的比例稀释之，离心（ 4000 rpm ） 20 min ，所得上清液即为酶液。 2. 标准曲线的制作
（ 1 ）配制吲哚乙酸的系列标准溶液，其浓度分别为 0 、 0.5 、 1.0 、 2.5 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25μg/mL 。
（ 2 ）取干洁的大试管 9 支，每支加入试剂 B 4 mL ，再分别加入不同浓度的 IAA 溶液各 2 mL ，摇匀，于 40 ℃的温箱中保温 30 min ，使反应呈红色。
（ 3 ）取反应液用分光光度计进行测定，测定时用波长 530 nm 。以 IAA 浓度（ μg/mL ）为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 3. 吲哚乙酸氧化酶的活性测定
（ 1 ）取 2 支试管编号， 1 号试管中加 MnCl 2 1mL ， 2,4- 二氯酚 1mL ， 200μg/mL IAA 2 mL ，酶液 1 mL ，磷酸缓冲液 5 mL ，混合均匀； 2 号试管，其中除酶液用磷酸缓冲液 1 mL 代替外，其余成分相同。将 2 支试管置于 25 ℃恒温水浴中作用 30 min 。
（ 2 ） 30 min 后，取 2 支试管编 1 ′、 2 ′号，先于每支试管中加入试剂 B 4 mL ，然后分别取反应混合液各 2 mL 加入到有试剂 B 的相应标记的试管中，小心地混匀，于 40 ℃的温箱中保温 30 min ，使反应液呈红色。
（ 3 ）在分光光度计上 530 nm 下比色测定，读出光密度，根据读数从标准曲线上查出相应的 IAA 浓度。
（ 4 ）从开始时加入的吲哚乙酸量减去酶作用后残留的吲哚乙酸量，即得被酶所分解破坏的吲哚乙酸量。 四、结果计算
[μgIAA/ 式中： C 1 ——对照管在标准曲线上查得 IAA, μg 。
C 2 ——测定管在标准曲线上查得 IAA, μg 。 V T ——酶液稀释后总体积， mL 。 V 1 ——酶液反应时用体积， mL 。 W ——样品重量， g 。 t ——酶促时间， h 。
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