２００８年第ｌ７卷第２２期 药物鉴定 ５种外用制剂微生物限度检查法中菌落计数方法验证 李秋菲 ，唐振宏 ，徐长根 ，徐（１．陕西省食品药品检验所，陕西西安翔 ７１００６１） ７１００６１； ２．陕西省医疗器械检测中心，陕西西安摘要：目的建立５种外用制剂的微生物限度检查方法。方法采用人工污染５种试验菌株测定其回收率，验证是否有抑菌作用。结果５种 外用制剂均有抑茵作用，其中肤疾洗剂、擦癣药水抑茵作用较弱，独活止痛擦剂、氯霉素擦剂和顽癣净抑茵作用较强。结论肤疾洗剂可采 用稀释法（０．５ ｍＬ／皿）和顽癣净可采用薄膜过滤法（３００ ｍＬ／膜）进行细菌、霉菌及酵母茵检查；擦癣药水可采用常规法进行细菌检查，采 用稀释法（０．２ ｍＬ／－￣－）进行霉菌及酵母菌检查；氯霉素擦剂可采用薄膜过滤法（２００ｍＬ／膜）和独活止痛擦剂可采用薄膜过滤法（３００ ｍＬ／膜） 进行细菌检查，采用常规法进行霉菌及酵母菌检查。 关键词：微生物限度检查；验证；抑茵作用 中图分类号：Ｒ９２７．１；Ｒ９８６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—４９３１（２００８）２２—００３９一Ｏ１ 干、测定，结果见表１。 表１ 样品微生物限度检查法验证试验茵回收率（％） 含抑菌成分的制剂的微生物限度检查，必须消除供试液抑菌 活性后，再依据２００５年版《中国药典（二部）》…规定进行检查，同时 所用检查方法需要进行验证试验。为此，笔者对５种外用制剂的微 生物限度检查法的菌落计数方法进行了验证，报道如下。 １ 材料 ＨＴＹ一２０００型智能集菌仪及一次性全封闭集菌器（杭州泰林 医疗器械厂）。肤疾洗剂（样品Ａ，批号为０６１００１，１００ ｍＬ／瓶），独活 止痛擦剂（样品Ｂ，批号为０６１２０１，５０ｍＬ／瓶），擦癣药水（样品Ｃ，批号 为０６１２０１，１００ ｍＬ／瓶），顽癣净（样品Ｄ，批号为０６０７０１，１００ ｍＬ／瓶）， 均由陕西思壮药业有限公司生产；氯霉素擦剂（样品Ｅ，西安灵丹制 药有限公司，批号为２００５０８０２，２０ ｍＬ／瓶）。改良马丁培养基、营养 肉汤培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、蛋白胨（中国 药品生物制品检定所），稀释液、冲洗液为ｐＨ＝７．０无菌氯化钠一 蛋白胨缓冲液，以上培养基和冲洗液均按照２００５年版《中国药典 （二部）》规定制备，采用高压蒸气灭菌法灭菌。金黄色葡萄球菌 ［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６ ００３］、大肠埃希菌【ＣＭＣＣ（Ｂ）４４ １０２］、枯草芽孢杆菌 【ＣＭＣＣ（Ｂ）６３ ５０１】、白色念珠菌【ＣＭＣＣ（Ｆ）９８ ００１］和黑曲霉菌 【ＣＭＣＣ（Ｆ）９８ ００３】均购于中国医学细菌保藏中心。 ２ 方法与结果 ２．１ 试验菌株菌液制备 取经３５℃培养１８～２４ ｈ的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯 草芽孢杆菌的营养肉汤培养物１ ｍＬ；取经２５℃培养２４—４８ ｈ的 白色念珠菌改良马丁液体培养物１ ｍＬ；取经２５℃培养１周的黑曲 注：方法Ｉ一Ⅳ分别为常规法、培养基稀释法一（１ ｍＬ加２个皿）、培养 基稀释法－－（１ ｍＬ加５个皿）及离心薄膜过滤法。 ３ 讨论 由于中成药是含有多种成分的复方制剂，其中任何成分具有 抑菌作用均可影响微生物限度检查的准确性。２００５年版《中国药典 （二部）》规定，应将５种阳性菌加入到样品中并测定其回收率。常 规法可用于抑菌作用弱的中成药。培养基稀释法可稀释药品中的 抑菌成分，从而消除其对细菌和霉菌生长的影响。如肤疾洗剂的细 霉斜面培养物，加０．９％氯化钠溶液３—５ ｍＬ洗脱孢子，取１ ｍＬ； 将以上各培养物分别加入到９ ｍＬ ０．９％氯化钠溶液中，１０倍倍比 稀释制成５０～ｌＯ０ ｃｆｕ／ｍＬ的菌悬液备用。 ２．２供试液制备 取供试品１０ ｍＬ，加入到ｐＨ＝７．０无菌氯化钠一蛋白胨缓冲 液９０ ｍＬ中，制备成１：ｌ０的供试液。 ２．３检查方法及验证 常规法：取２．２项下的供试液１ ｍＬ，分别加入上述５种试验菌 菌和霉菌（酵母菌）的回收率均高于７０％，即取１ ｍＬ供试液加２个 平皿；擦癣药水霉菌（酵母菌）的回收率高于７０％，即取ｌ ｍＬ供试 液加５个平皿。对于强抑菌作用的中成药，应采用薄膜过滤法进行 微生物检查。用不同量的冲洗液冲洗可彻底消除其抑菌作用，使对 照菌的回收率高于７０％，如顽癣净、氯霉素擦剂、独活止痛擦剂。 株１ ｍＬ，立即倾注１５ ２０ ｍＬ适宜培养基，平行制备两个平皿，待 凝固后置规定的温度培养２４—７２ ｈ，观察结果并计数，作为试验 本次试验发现，中成药对大肠埃希菌和白色念珠球菌的抑菌 作用较弱，而对金黄色葡萄球菌和枯草菌的抑菌作用较强，说明中 成药虽不像抗生素有明显的抗菌谱，但还是存在对不同菌种的抑 菌作用不同的特点。 参考文献： ［１】国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）ｆＭ】．北京：化学工业出 版社．２００５：８９． 组。同法测定菌液本底数和供试品本底菌数，作为菌液对照组和供 试品对照组。依法计算菌回收率，结果见表１。 培养基稀释法：取１：１０的供试液（０．５ ｍＬ和０．２ ｍＥ），分别加入 不同的试验菌株５０ １００ ｃｆｕ，照２．３项下方法进行试验，结果见表１。 离心薄膜过滤法：取１：ｌ０的上清供试液１ ｍＬ，加入到５０ ｍＬ 稀释液中，过滤，用ｐＨ＝７．０缓冲液２００ ｍＬ和３００ ｍＬ进行冲洗， 每次５０ ｍＬ，在最后一次冲洗液中加入５０—１００ ｃｆｕ的试验菌株，滤 （收稿日期：２００８—０２—２０；修回日期：２００８—０９—０３） ・中国药业Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ３９・
