一种单克隆抗体制备方法及其试剂盒[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105198996 A (43)申请公布日 2015.12.30

(21)申请号 201510763117.X(22)申请日 2015.11.10

(71)申请人三诺生物传感股份有限公司

地址410205 湖南省长沙市高新技术开发区

谷苑路265号(72)发明人刘伟

(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限

公司 11227

代理人赵青朵(51)Int.Cl.

C07K 16/26(2006.01)C12N 15/06(2006.01)G01N 33/543(2006.01)

权利要求书1页 说明书15页 附图1页

(54)发明名称

一种单克隆抗体制备方法及其试剂盒(57)摘要

本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，特别涉及一种单克隆抗体制备方法及其试剂盒。该制备方法包括：采用抗原对动物进行免疫，取免疫脾细胞；将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得融合细胞；采用间接ELISA方法对融合细胞进行检测，获得阳性杂交瘤细胞；采用竞争抑制ELISA方法对阳性杂交瘤细胞进行检测，获得具有竞争反应的杂交瘤细胞；将具有竞争反应的杂交瘤细胞进行亚克隆，获得单克隆抗体杂交瘤细胞；单克隆抗体杂交瘤细胞分泌获得单克隆抗体。本发明采用酶联免疫吸附试验间接法与竞争法相结合的方法筛选单克隆抗体，操作简便，目的性强，工作量小，能在短时间内锁定优质的杂交瘤细胞株。 C N 1 0 5 1 9 8 9 9 6 A CN 105198996 A

权 利 要 求 书

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1.一种单克隆抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用抗原对动物进行免疫，取免疫脾细胞；将所述免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得融合细胞；采用间接ELISA方法对所述融合细胞进行检测，获得阳性杂交瘤细胞；采用竞争抑制ELISA方法对所述阳性杂交瘤细胞进行检测，获得具有竞争反应的杂交瘤细胞；

将所述具有竞争反应的杂交瘤细胞进行亚克隆，获得单克隆抗体杂交瘤细胞；所述单克隆抗体杂交瘤细胞分泌获得单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亚克隆的次数为2～4次。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原为NT-BNP蛋白，所述单克隆抗体为NT-BNP单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述已知的与抗原对应的酶标单克隆抗体为酶标15C4或酶标13G12。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原为降钙素原蛋白，所述单克隆抗体为降钙素原单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述已知的与抗原对应的酶标单克隆抗体为酶标27A3或酶标14A2。

7.一种单克隆抗体制备试剂盒，其特征在于，包括抗原、包被液、封闭液、生物酶标记的第二抗体、已知的与抗原对应的酶标单克隆抗体、显色剂和终止液。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原为NT-BNP蛋白；所述与抗原对应的酶标单克隆抗体为酶标15C4或酶标13G12；所述抗原为降钙素原蛋白；所述与抗原对应的酶标单克隆抗体为酶标27A3或酶标14A2。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体为羊抗鼠IgG。10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液和标记抗体稀释液。

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CN 105198996 A

说 明 书

一种单克隆抗体制备方法及其试剂盒

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技术领域

[0001]

本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，特别涉及一种单克隆抗体制备方法及其试

剂盒。背景技术

心力衰竭简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和或舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。在临床上，根据患者有冠心病、高血压等基础心血管病的病史，有休息或运动时出现呼吸困难、乏力、下肢水肿的临床症状，有心动过速、呼吸急促、肺部罗音、胸腔积液、颈静脉压力增高、外周水肿、肝脏肿大的体征，有心腔扩大、第三心音、心脏杂音、超声心动图异常、利钠肽(BNP/NT-proBNP)水平升高等心脏结构或功能异常的客观证据，有收缩性心力衰竭或舒张性心力衰竭的特征，可作出诊断。

[0003] N端脑钠肽前体(NT-BNP)是脑钠肽前体原(preproBNP)的蛋白酶裂解产物。脑钠肽前体原(preproBNP108个氨基酸残基)在转化酶依赖反应中形成两个多肽，BNP(残基77-108)和N端脑钠肽前体(NT-BNP残基1-76)。这两种多肽浓度在不同的心脏病患者中都有升高。心衰患者血液中这两种多肽的浓度与疾病的严重程度成正比，而心衰患者血浆NT-BNP浓度可达到几十个ng/mL，是检测心脏病患者的一项重要指标。[0004] 目前，很多公司以及研发单位制备的体外诊断用的NT-BNP蛋白单克隆抗体，大多通过细胞融合到抗体的形成，得到一株可用于临床诊断的单克隆抗体需要通过大量的筛选过程，其在细胞筛选中用到的技术方案是通过酶联免疫吸附试验进行大量的筛选，然后得到阳性细胞株，这种筛选抗体的方式没有明确的目的性，且这些细胞株中大量存在假阳性或者是灵敏度和特异性性不好的情况，然后不得不大量纯化逐步检测以及试验。因此导致大量人力物力及科研经费的损失，耗时比较长，导致优质抗体细胞株丢失，未必能筛选到优质的抗体。鉴于NT-BNP抗体的制备过程繁琐、耗时比较长、所产生的单克隆抗体效价低、不能满足实验需求等问题，急需提供一种NT-BNP蛋白单克隆抗体及其它单克隆抗体的快速准确的制备方法。

[0002]

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种单克隆抗体制备方法及其试剂盒。该方法采用酶联

免疫吸附试验间接法与竞争法相结合的方法筛选单克隆抗体，操作简便，目的性强，工作量小，能在短时间内锁定优质的杂交瘤细胞株。[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0005]

本发明提供了一种单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：[0008] 采用抗原对动物进行免疫，取免疫脾细胞；[0009] 将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得融合细胞；

[0007]

3

CN 105198996 A[0010]

说 明 书

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采用间接ELISA方法对融合细胞进行检测，获得阳性杂交瘤细胞；[0011] 采用竞争抑制ELISA方法对阳性杂交瘤细胞进行检测，获得具有竞争反应的杂交瘤细胞；

[0012] 将具有竞争反应的杂交瘤细胞进行亚克隆，获得单克隆抗体杂交瘤细胞；单克隆抗体杂交瘤细胞分泌获得单克隆抗体。

[0013] 本发明采用酶联免疫吸附试验间接法与竞争法相结合的方法筛选单克隆抗体，通过已知优质的抗体与预筛选抗体的相互竞争作用，筛选过程中细胞培养上清液与优质抗体性质不一致显阳性；而与优质抗体具有相同位点的抗体，由于相互间存在竞争抗原位点的关系显阴性。应用本发明方法筛选能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，操作简便，目的性强，工作量小，能在短时间内锁定优质的杂交瘤细胞株。[0014] 在本发明提供的一些实施例中，直接竞争抑制ELISA方法为：将抗原包被到固相载体上，封闭，加入阳性杂交瘤细胞产生的培养上清液进行孵育，然后加入已知的与抗原对应的单克隆抗体进行孵育，显色，终止反应，检测OD值；与抗原对应的单克隆抗体为生物酶标记的与抗原对应的单克隆抗体。

[0015] 在本发明提供的一些实施例中，间接ELISA方法为：将抗原包被到固相载体上，封闭，加入融合细胞的培养上清液进行孵育，然后加入生物酶标记的第二抗体进行孵育，显色，终止反应，检测OD值。[0016] 作为优选，亚克隆的次数为2～4次。[0017] 在本发明提供的一些实施例中，抗原为NT-BNP蛋白，单克隆抗体为NT-BNP单克隆抗体。

[0018] 在本发明提供的一些实施例中，已知的与抗原对应的单克隆抗体为15C4或13G12。

[0019] 在本发明提供的另一些实施例中，抗原为降钙素原蛋白，所述单克隆抗体为降钙素原单克隆抗体。

[0020] 在本发明提供的一些实施例中，已知的与抗原对应的酶标单克隆抗体为酶标27A3或酶标14A2。

[0021] 本发明还提供了一种NT-BNP蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：[0022] 采用NT-BNP蛋白对动物进行免疫，取免疫脾细胞；[0023] 将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得融合细胞；采用间接ELISA方法对融合细胞进行检测，获得阳性杂交瘤细胞；

[0024] 采用竞争抑制ELISA方法对阳性杂交瘤细胞进行检测，获得具有竞争反应的杂交瘤细胞；

[0025] 将具有竞争反应的杂交瘤细胞进行亚克隆，获得NT-BNP蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞；NT-BNP蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞分泌获得NT-BNP蛋白单克隆抗体。

[0026] 本发明采用酶联免疫吸附试验间接法与竞争法相结合的方法筛选NT-BNP蛋白单克隆抗体，通过已知优质的抗体与预筛选抗体的相互竞争作用，筛选过程中细胞培养上清液与优质抗体性质不一致显阳性；而与优质抗体具有相同位点的抗体，由于相互间存在竞争抗原位点的关系显阴性。应用本发明方法进行分泌NT-BNP单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选，操作简便，目的性强，工作量小，能在短时间内锁定优质的杂交瘤细胞株。

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CN 105198996 A[0027]

说 明 书

3/15页

作为优选，竞争抑制ELISA方法为直接竞争抑制ELISA方法。[0028] 在本发明提供的一些实施例中，竞争抑制ELISA方法为：将NT-BNP抗原包被到固相载体上，封闭，加入阳性杂交瘤细胞产生的培养上清液孵育，然后加入已知的生物酶标记的NT-BNP蛋白单克隆抗体孵育，显色，终止反应，检测OD值。[0029] 在本发明提供的一些实施例中，已知的生物酶标记的NT-BNP蛋白单克隆抗体为生物酶标记的15C4或13G12。

[0030] 在本发明提供的一些实施例中，间接ELISA方法为：将NT-BNP抗原包被到固相载体上，封闭，加入融合细胞的培养上清液孵育，然后加入生物酶标记的第二抗体孵育，显色，终止反应，检测OD值。[0031] 作为优选，亚克隆的次数为2～4次。[0032] 在本发明提供的一些实施例中，亚克隆采用的方法为有限稀释法。[0033] 在本发明提供的一些实施例中，NT-BNP蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞分泌获得NT-BNP蛋白单克隆抗体为：将NT-BNP蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞接种于动物腹腔，收集腹水，纯化，获得NT-BNP蛋白单克隆抗体。

[0034] 本发明还提供了一种单克隆抗体制备试剂盒，包括抗原、包被液、封闭液、生物酶标记的第二抗体、已知的与抗原对应的酶标单克隆抗体、显色剂和终止液。[0035] 在本发明提供的一些实施例中，抗原为NT-BNP蛋白；与抗原对应的酶标单克隆抗体为酶标15C4或酶标13G12。

[0036] 在本发明提供的另一些实施例中，抗原为降钙素原蛋白；与抗原对应的酶标单克隆抗体为酶标27A3或酶标14A2。[0037] 作为优选，第二抗体为羊抗鼠IgG。[0038] 在本发明提供的一些实施例中，包被液为碳酸盐缓冲液，其pH为9.6。[0039] 在本发明提供的一些实施例中，封闭液为1％的BSA。[0040] 在本发明提供的一些实施例中，洗涤液为PBST。PBST是抗体稀释液，即在PBS中加入Twen-20，Twen-20配制而成。

[0041] 在本发明提供的一些实施例中，生物酶为HRP(辣根过氧化物酶)。[0042] 作为优选，试剂盒还包括洗涤液和标记抗体稀释液。[0043] 在本发明提供的一些实施例中，标记抗体稀释液为含10％小牛血清的PBST。[0044] 在本发明提供的一些实施例中，显色剂为TMB(四甲基联苯胺)。[0045] 在本发明提供的一些实施例中，终止液为H2SO4。

[0046] 本发明提供了一种单克隆抗体制备方法及其试剂盒。该制备方法包括：采用抗原对动物进行免疫，取免疫脾细胞；将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得融合细胞；采用间接ELISA方法对融合细胞进行检测，获得阳性杂交瘤细胞；采用竞争抑制ELISA方法对阳性杂交瘤细胞进行检测，获得具有竞争反应的杂交瘤细胞；将具有竞争反应的杂交瘤细胞进行亚克隆，获得单克隆抗体杂交瘤细胞；单克隆抗体杂交瘤细胞分泌获得单克隆抗体。本发明具有的有益效果为：本发明采用酶联免疫吸附试验间接法与竞争法相结合的方法筛选单克隆抗体，操作简便，目的性强，工作量小，能在短时间内锁定优质的杂交瘤细胞株，亚克隆次数可减少为2次；制得的单克隆抗体与优质抗体的性质一致，具有较强的特异性。

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CN 105198996 A

说 明 书

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附图说明

[0047]

图1示本发明制得的NT-BNP蛋白单克隆抗体电泳图。

具体实施方式

[0048] 本发明公开了一种单克隆抗体制备方法及其试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0049] 本发明提供的单克隆抗体制备方法及其试剂盒中所用试验动物、生物制剂、试剂、仪器均可由市场购得。NT-BNP蛋白、PCT抗原以及对照抗体均购自HYTEST公司。[0050] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：[0051] 实施例1 NT-BNP蛋白单克隆抗体的制备[0052] (一)动物免疫

[0053] 将NT-BNP抗原稀释至1mg/mL，与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化，皮下多点接种6周龄Balb/c小鼠5只，接种抗原剂量为50μg/只。3周后注射同一剂量弗氏不完全佐剂处理的抗原，以后每2周注射1次抗原，重复3次，每次免疫的剂量为25μg/只。细胞融合前3天，腹腔注射不加佐剂的NT-BNP蛋白进行加强免疫一次，随后即可进行细胞融合。

[0054] (二)脾细胞的制备[0055] 3天后，小鼠眼球采血，将血液在37℃放置0.5h，4℃放置1h，3000rpm离心5min，分离后的血清作为阳性血清。处死小鼠，75％酒精浸泡消毒5min后，取出小鼠，将四肢固定于超净台解剖板上。在无菌的条件下，依次剪开腹部皮肤、腹膜，充分暴露腹腔，在小鼠腹腔左侧用一套无菌的剪刀和镊子取出脾脏，置于含有少量无血清DMEM的无菌玻璃培养皿中的滤网上，剪去脾脏上的筋膜，用玻璃针筒研磨。冲下的脾细胞用无血清DMEM培养液洗涤2次(1500rpm，5min)，再次悬浮细胞后计数，以无血清DMEM培养液调整细胞浓度为1×107个/mL，获得约10mL细胞悬液，即免疫脾细胞。[0056] (三)Sp2/0骨髓瘤细胞的准备[0057] 快速取出液氮罐中的Sp2/0，放入37℃水中，不停摇动冻存管，使其尽快融化，1000rpm离心5min后弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，转入细胞瓶中，37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。

[0058] 融合前10天复苏Sp2/0细胞，融合当天取细胞形态均一、边界清晰、生长状态良好的Sp2/0细胞，弃去营养液，用无血清DMEM营养液洗涤后重新悬浮，细胞计数板计数，将细胞稀释为106个/mL，体积为5mL左右，放置37℃、5％CO2培养箱中融合备用。[0059] (四)饲养细胞的准备[0060] 融合前1d，选择未免疫的8周龄KM雌性小鼠1只，颈椎脱臼处死，75％酒精浸泡消毒5min后，取出小鼠，腹部朝上，将四肢固定于解剖板上，在无菌条件下剪开腹部皮肤，充分暴露腹部；用镊子拎起腹膜，用注射器向腹腔中注入5mL DMEM培养液，用酒精棉球轻轻按压腹部，最后用注射器将腹腔内的培养液吸出，悬浮细胞，细胞计数板计数，用HAT液重

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CN 105198996 A

说 明 书

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悬调节细胞数至5×105个/mL，100μL/孔加入96孔培养板，置37℃、5％CO2培养箱中融合备用。

[0061] (五)细胞融合

[0062] 将准备好的Sp2/0骨髓瘤细胞和免疫脾细胞以1：10的比例混和，置于50mL离心管内，用无血清DMEM培养液洗涤1次，1000rpm离心10min,用手指轻击离心管底部，使细胞松散。将离心管置于37℃水浴中，用1mL吸管吸取1mLPEG2000加入离心管，边加边轻轻搅拌，PEG2000平均在1分钟内加完，加完后轻轻静止1min。缓慢加入1mL无血清DMEM，1分钟加完，加完后每1s一滴，缓慢加入10mL后定容至45mL。1200rpm离心8min，弃去上清。重悬融合细胞，动作轻柔，防止将刚融合上的细胞吹散，加入100mL HAT培养基(HAT+90％DMEM+10％胎牛血清)开始铺96孔板，一共铺10块，不换液7天后进行检测。[0063] (六)NT-BNP杂交瘤细胞株的筛选[0064] 1、NT-BNP蛋白间接ELISA方法的建立

[0065] (1)将NT-BNP抗原用碳酸盐缓冲液(pH9.6)分别稀释至5μg/mL，100μL/孔，在37℃下孵育4h，4℃反应16h。[0066] (2)甩干包被液，PBST洗涤3次，3min/次。[0067] (3)加入1％BSA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。[0068] (4)拍干，加入上述(五)中制得的融合板细胞培养液上清，100μL/孔，37℃孵育1h。

[0069] (5)同上PBST洗涤4次，3min/次。

[0070] (6)加入羊抗鼠IgG-HRP用PBST+10％小牛血清，进行1：1500倍稀释，100μL/孔，37℃孵育0.5h。

[0071] (7)PBST洗涤4次，3min/次。

[0072] (8)每孔加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，避光显色10min。[0073] (9)加入2M H2SO4，50μL/孔，终止反应，自动酶标仪测定各孔OD450。[0074] 通过以上实验筛选出阳性克隆，转入24孔进行检测。筛选出的阳性克隆如下所示：

[0075] 表1筛选出的阳性克隆细胞株

[0076]

母克隆号OD450123456

2.5962.7452.6872.6062.3272.338

母克隆号910111213147

OD4502.1222.6112.6612.8912.2963.108

CN 105198996 A

78

[0077]

2.7462.765

说 明 书

15阴性

2.1130.117

6/15页

2、NT-BNP蛋白竞争ELISA方法的建立

[0078] (1)将NT-BNP抗原用碳酸盐缓冲液(pH9.6)分别稀释至5μg/mL，100μL/孔，在37℃下孵育4h，4℃反应16h。[0079] (2)甩干包被液，PBST洗涤3次，3min/次。[0080] (3)加入1％BSA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。[0081] (4)拍干，加入上述筛选出阳性克隆细胞株的融合板细胞培养液上清，100μL/孔，37℃孵育1h。

[0082] (5)PBST洗涤4次，3min/次。

[0083] (6)加入购买的HRP酶标记的对应的优质抗体15C4或13G12(HYTEST)，用PBST+10％小牛血清比例为1:1500稀释，37℃反应40分钟。[0084] (7)PBST洗涤4次，3min/次。(8)每孔加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，避光显色10min。[0086] (9)加入2M H2SO4，50μL/孔，终止反应，自动酶标仪测定各孔OD450。

[0087] 加入15C4-HRP的各孔OD450见表2。加入13G12-HRP的各孔OD450见表3。[0088] 表2加入15C4-HRP的ELISA检测结果

[0085] [0089]

母克隆号OD450123

[0090]

45678

[0091] [0092]

母克隆号OD450

母克隆号

OD450

2.0911.8822.0662.1461.992

12131415阴性

2.0502.0262.1092.1942.094

0.1772.0952.091

母克隆号91011

OD4502.1281.9862.019

表3加入13G12-HRP的ELISA检测结果

8

CN 105198996 A

12345678

[0093]

2.0031.7701.7091.7131.7591.6731.7831.752

说 明 书

9101112131415阴性

1.8371.8321.9310.1211.7701.7920.6721.659

7/15页

由表2可以看出，1号细胞株产生抗体与抗体15C4有明显的竞争反应。[0094] 由表3可以看出，12号和15号细胞株产生抗体有明显的竞争反应。但12号细胞株产生抗体比15号细胞株产生抗体竞争更有优势，而15号细胞株产生抗体并未竞争完全。[0095] 由上述试验结果筛选出1号细胞株和12号细胞株。[0096] (七)NT-BNP杂交瘤细胞单克隆化

[0097] 用HT(HT+90％DMEM+10％胎牛血清)培养基冲洗小鼠腹腔后获得的饲养细胞铺96孔板，100μL/孔，96孔板置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中过夜培养。将已检测为阴性的杂交瘤细胞孔(分别产生1号抗体和12号抗体的细胞)中的细胞吹起混匀，取10μL细胞，10倍比稀释后细胞计数，经计算从相应孔中取50个细胞加入5mL HT培养液中，接种于铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μL/孔，即每孔约1个细胞。将细胞板置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。3天后观察每孔克隆数，10天细胞长到1/4孔底时，进行ELISA检测，取2次检测均为阳性的单克隆孔进行再次亚克隆。一般需经2次亚克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100％时，即可确定已获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0098] (八)腹水生产和抗体制备

[0099] 选取1号母克隆下细胞株1A6和1B11，12号母克隆下细胞株12D10和12G9生产腹水，取10周龄Balb/c小鼠，腹腔内注入0.5mL弗氏不完全佐剂，7天后，每只小鼠腹腔接种106个杂交瘤细胞，1周后，小鼠腹部胀大，触之有波动感即腹腔内出现腹水，此时即可收集腹水并用蛋白A亲和层析纯化抗体，用SDS-PAGE电泳鉴定其纯度。电泳图见图1。从图1中可见，从左至右分别是1A6，1B11，12D10和12G9，其纯度大于90％。

[0100] (九)进口抗体与本发明制备抗体应用比较(ELISA双抗体夹心法)[0101] (1)将NT-BNP抗体(进口抗体13G12或自产12D10、12G9作为第一抗体)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)分别稀释至5μg/mL，100μL/孔，在37℃下孵育4h，4℃反应16h。[0102] (2)甩干包被液，PBST洗涤3次，3min/次。[0103] (3)加入1％BSA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。[0104] (4)拍干，分别加入10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL5个稀释了的

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说 明 书

8/15页

含NT-BNP抗原的血清样本100μL/孔，将含NT-BNP抗原的血清样本稀释成1μg/mL(阳性对照组)，PBS作为空白对照，37℃孵育1h。[0105] (5)PBST洗涤4次，3min/次。

[0106] (6)加入进口抗体15C4或自产1A6、1B11(15C4、1A6或1B11作为第二抗体)，分别用HRP标记，进行1：1500倍稀释，100μL/孔，37℃孵育0.5h。[0107] (7)PBST洗涤4次，3min/次。

[0108] (8)每孔加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，避光显色10min。[0109] (9)加入2M H2SO4，50μL/孔，终止反应，自动酶标仪测定各孔OD450。[0110] 并按照上述检测方法重复检测一次，检测结果见表4、5：[0111] 表4 ELISA检测结果

[0112]

[0113] [0114]

表5 ELISA检测结果

由此实验结果说明利用本发明筛选的抗体，对血清样本有良好的反应，能特异性

的识别，可用于体外诊断研发实验，且重复性好。[0116] 实施例2 NT-BNP蛋白单克隆抗体的制备

[0117] 按照实施例1单克隆抗体制备方法重复试验一次，[0118] 通过该实验间接ELISA方法筛选出阳性克隆，转入24孔进行检测。筛选出的阳性克隆如下所示：

[0119] 表6筛选出的阳性克隆细胞株

[0115] [0120]

母克隆号OD4501

2.824

母克隆号910

OD4502.877

CN 105198996 A

23456

[0121]

78

[0122]

2.8632.3752.5892.3182.7542.6312.482

说 明 书

1011121314

2.3792.9142.6442.2412.684

9/15页

15阴性

0.073.097

2、NT-BNP蛋白竞争ELISA方法的建立[0123] 按实施例1方法进行竞争ELISA试验，加入15C4-HRP的各孔OD450见表7。加入13G12-HRP的各孔OD450见表8。

[0124] 表7加入15C4-HRP的ELISA检测结果

[0125]

母克隆号OD45012345678

[0126] [0127]

母克隆号OD45012

2.6412.493

母克隆号910

OD4500.2412.753

2.6552.4932.6552.6012.6242.2780.1872.492

母克隆号9101112131415阴性

OD4502.4762.7422.7722.7482.3692.5363.142.854

表8加入13G12-HRP的ELISA检测结果

11

CN 105198996 A

345678

[0128]

0.2432.5522.6152.2412.5392.364

说 明 书

1112131415阴性

2.8652.5492.2862.5723.0282.789

10/15页

由表7可以看出，7号细胞株产生抗体与抗体15C4有明显的竞争反应。[0129] 由表8可以看出，3号和9号细胞株产生抗体与13G12有明显的竞争反应。[0130] 由上述试验结果筛选出3号、7号细胞株和9号细胞株。[0131] 对筛选出的细胞株进行单克隆化，进行腹水生产和抗体制备，将进口抗体与自己制备抗体应用比较(ELISA双抗体夹心法。)试验方法如下：

(1)将NT-BNP抗体(进口抗体13G12和自产3C6，9D12)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)

分别稀释至5μg/mL，100μL/孔，在37℃下孵育4h，4℃反应16h。[0133] (2)甩干包被液，PBST洗涤3次，3min/次。[0134] (3)加入1％BSA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。[0135] (4)拍干，分别加入10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL5个稀释了的含NT-BNP抗原的血清样本100μL/孔，将含NT-BNP抗原的血清样本稀释成1μg/mL(阳性对照组)，PBS作为空白对照，37℃孵育1h。[0136] (5)PBST洗涤4次，3min/次。

[0137] (6)加入进口抗体15C4(HYTEST)和自产7G4用HRP标记，进行1：1500倍稀释，100μL/孔，37℃孵育0.5h。[0138] (7)PBST洗涤4次，3min/次。

[0139] (8)每孔加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，避光显色10min。[0140] (9)加入2M H2SO4，50μL/孔，终止反应，自动酶标仪测定各孔OD450。[0141] 表9 ELISA检测结果

[0132] [0142]

由此实验结果说明利用本发明筛选的抗体，对血清样本有良好的反应，能特异性

的识别，可用于体外诊断研发实验。同时，表明该试验方法能够重复实施用于单克隆抗体的筛选。

[0143]

12

CN 105198996 A[0144]

说 明 书

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实施例3 PCT单克隆抗体的制备[0145] (一)动物免疫

[0146] 将PCT(降钙素原)抗原稀释至1mg/mL，与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化，皮下多点接种6周龄Balb/c小鼠5只，接种抗原剂量为50μg/只。3周后注射同一剂量弗氏不完全佐剂处理的抗原，以后每2周注射1次抗原，重复3次，每次免疫的剂量为25μg/只。细胞融合前3天，腹腔注射不加佐剂的PCT蛋白进行加强免疫一次，随后即可进行细胞融合。

[0147] (二)脾细胞的制备[0148] 3天后，小鼠眼球采血，将血液在37℃放置0.5h，4℃放置1h，3000rpm离心5min，分离后的血清作为阳性血清。处死小鼠，75％酒精浸泡消毒5min后，取出小鼠，将四肢固定于超净台解剖板上。在无菌的条件下，依次剪开腹部皮肤、腹膜，充分暴露腹腔，在小鼠腹腔左侧用一套无菌的剪刀和镊子取出脾脏，置于含有少量无血清DMEM的无菌玻璃培养皿中的滤网上，剪去脾脏上的筋膜，用玻璃针筒研磨。冲下的脾细胞用无血清DMEM培养液洗涤2次(1500rpm，5min)，再次悬浮细胞后计数，以无血清DMEM培养液调整细胞浓度为1×107个/mL，获得约10mL细胞悬液，即免疫脾细胞。[0149] (三)Sp2/0骨髓瘤细胞的准备[0150] 快速取出液氮罐中的Sp2/0，放入37℃水中，不停摇动冻存管，使其尽快融化，1000rpm离心5min后弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，转入细胞瓶中，37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。

[0151] 融合前10天复苏Sp2/0细胞，融合当天取细胞形态均一、边界清晰、生长状态良好的Sp2/0细胞，弃去营养液，用无血清DMEM营养液洗涤后重新悬浮，细胞计数板计数，将细胞稀释为106个/mL，体积为5mL左右，放置37℃、5％CO2培养箱中融合备用。[0152] (四)饲养细胞的准备[0153] 融合前1d，选择未免疫的8周龄KM雌性小鼠1只，颈椎脱臼处死，75％酒精浸泡消毒5min后，取出小鼠，腹部朝上，将四肢固定于解剖板上，在无菌条件下剪开腹部皮肤，充分暴露腹部；用镊子拎起腹膜，用注射器向腹腔中注入5mL DMEM培养液，用酒精棉球轻轻按压腹部，最后用注射器将腹腔内的培养液吸出，悬浮细胞，细胞计数板计数，用HAT液重悬调节细胞数至5×105个/mL，100μL/孔加入96孔培养板，置37℃、5％CO2培养箱中融合备用。

[0154] (五)细胞融合

[0155] 将准备好的Sp2/0骨髓瘤细胞和免疫脾细胞以1：10的比例混和，置于50mL离心管内，用无血清DMEM培养液洗涤1次，1000rpm离心10min,用手指轻击离心管底部，使细胞松散。将离心管置于37℃水浴中，用1mL吸管吸取1mLPEG2000加入离心管，边加边轻轻搅拌，PEG2000平均在1分钟内加完，加完后轻轻静止1min。缓慢加入1mL无血清DMEM，1分钟加完，加完后每1s一滴，缓慢加入10mL后定容至45mL。1200rpm离心8min，弃去上清。重悬融合细胞，动作轻柔，防止将刚融合上的细胞吹散，加入100mL HAT培养基(HAT+90％DMEM+10％胎牛血清)开始铺96孔板，一共铺10块，不换液7天后进行检测。(六)抗PCT杂交瘤细胞株的筛选[0157] 1、PCT蛋白间接ELISA方法的建立

[0156]

13

CN 105198996 A[0158]

说 明 书

12/15页

(1)将PCT抗原用碳酸盐缓冲液(pH9.6)分别稀释至5μg/mL，100μL/孔，在37℃下孵育4h，4℃反应16h。[0159] (2)甩干包被液，PBST洗涤3次，3min/次。[0160] (3)加入1％BSA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。[0161] (4)拍干，加入融合板细胞培养液上清，100μL/孔，37℃孵育1h。[0162] (5)同上PBST洗涤4次，3min/次。

[0163] (6)加入羊抗鼠IgG-HRP用PBST+10％小牛血清，进行1：1500倍稀释，100μL/孔，37℃孵育0.5h。

[0164] (7)PBST洗涤4次，3min/次。

[0165] (8)每孔加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，避光显色10min。[0166] (9)加入2MH2SO4，50μL/孔，终止反应，自动酶标仪测定各孔OD450。[0167] 通过以上实验筛选出阳性克隆，转入24孔进行检测。[0168] 筛选出的阳性克隆如下所示：[0169] 表10筛选出的阳性克隆细胞株

[0170]

母克隆号123

[0171]

45678

[0172]

3.0573.263.0843.2163.294

121314PBS对照小鼠眼球血对照

2.8483.1613.0530.0513.225

OD4503.1053.1773.064

母克隆号91011

OD4503.3663.1522.989

2、抗PCT(降钙素原)蛋白竞争ELISA方法的建立

[0173] (1)将PCT抗原用碳酸盐缓冲液(pH9.6)分别稀释至5μg/mL，100μL/孔，在37℃下孵育4h，4℃反应16h。[0174] (2)甩干包被液，PBST洗涤3次，3min/次。[0175] (3)加入1％BSA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。[0176] (4)拍干，加入融合板细胞培养液上清，100μL/孔，37℃孵育1h。[0177] (5)同上PBST洗涤4次，3min/次。

[0178] (6)加入购买的HRP酶标记的对应的优质抗体27A3或14A2(HYTEST)，用

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CN 105198996 A

说 明 书

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PBST+10％小牛血清比例为1:1500稀释，37℃反应40分钟。[0179] (7)PBST洗涤4次，3min/次。

[0180] (8)每孔加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，避光显色10min。[0181] (9)加入2M H2SO4，50μL/孔，终止反应，自动酶标仪测定各孔OD450。加入27A3-HRP的各孔OD450见表11。加入14A2-HRP的各孔OD450见表12。[0182] 表11加入27A3-HRP的ELISA检测结果

[0183]

母克隆号12345678

[0184] [0185]

母克隆号12345678

[0186]

OD4502.7730.1573.0553.2873.2713.1523.2143.146

母克隆号91011121314PBS对照小鼠眼球血对照

OD4503.0213.2172.8733.2193.1452.9562.9362.878

OD4503.3233.3292.8222.9893.2833.2313.2370.236

母克隆号91011121314PBS对照小鼠眼球血对照

OD4503.1292.8973.2833.1262.5493.3253.3072.823

表12加入14A2-HRP的ELISA检测结果

由上述实验结果可以看出，8号细胞株产生抗体与27A3有很好的竞争反应，而2号

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说 明 书

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细胞株产生抗体与14A2有很好的竞争反应。[0187] (七)PCT杂交瘤细胞单克隆化

[0188] 用HT(HT+90％DMEM+10％胎牛血清)培养基冲洗小鼠腹腔后获得的饲养细胞铺96孔板，100μL/孔，96孔板置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中过夜培养。将已检测为阴性的杂交瘤细胞孔中的细胞吹起混匀，取10μL细胞，10倍比稀释后细胞计数，经计算从相应孔中取50个细胞加入5mLHT培养液中，接种于铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μL/孔，即每孔约1个细胞。将细胞板置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。3天后观察每孔克隆数，10天细胞长到1/4孔底时，进行ELISA检测，取2次检测均为阳性的单克隆孔进行再次亚克隆。一般需经2次亚克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100％时，即可确定已获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[0189] (八)腹水生产和抗体制备

[0190] 选取8号母克隆下细胞株8A11和8D6，2号母克隆下细胞株2B3和2E9生产腹水，取10周龄Balb/c小鼠，腹腔内注入0.5mL弗氏不完全佐剂，7天后，每只小鼠腹腔接种106个杂交瘤细胞，1周后，小鼠腹部胀大，触之有波动感即腹腔内出现腹水，此时即可收集腹水并用蛋白A亲和层析纯化抗体，用SDS-PAGE电泳鉴定其纯度，其纯度大于90％。[0191] (九)进口抗体与自己制备抗体应用比较(ELISA双抗体夹心法)[0192] (1)将PCT抗体(进口抗体27A3和自产8A11、8D6)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)分别稀释至5μg/mL，[0193] 100μL/孔，在37℃下孵育4h，4℃反应16h。[0194] (2)甩干包被液，PBST洗涤3次，3min/次。[0195] (3)加入1％BSA封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。[0196] (4)拍干，分别加入10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL5个稀释了的含PCT抗原的血清样本100μL/孔，将含PCT抗原的血清样本稀释成1μg/mL(阳性对照组)，PBS作为空白对照，37℃孵育1h。[0197] (5)PBST洗涤4次，3min/次。

[0198] (6)加入进口抗体(14A2和自产2B3、2E9)用HRP标记，进行1：1500倍稀释，100μL/孔，37℃孵育0.5h。[0199] (7)PBST洗涤4次，3min/次。

[0200] (8)每孔加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，避光显色10min。[0201] (9)加入2M H2SO4，50μL/孔，终止反应，自动酶标仪测定各孔OD450。[0202] 表13 ELISA检测结果

[0203]

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说 明 书

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由此实验结果说明利用本发明筛选的抗体，对血清样本有良好的反应，能特异性的识别，可用于体外诊断研发实验。

[0205] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

[0204]

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说 明 书 附 图

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图1

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