巢式PCR

巢式PCR

1.增效PCR（booster PCR）

当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。

2.巢式PCR

此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。

除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。

巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增

❖ 巢式RT- PCR,这种方法的特点是需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第一对引物的产物为模版

3.RT-PCR

RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng～ug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。

4.基因芯片

（又称DNA芯片，生物芯片，DNA探针微列阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。

基因芯片是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量

1. 基因芯片的制备：

① 原位合成(in situ Synthesis)：

❖ 光引导原位合成 ：

❖ 成出DNA探针

通过使用4支分别装有A，T，G，C核苷的压电喷头在芯片上并行地合

② 合成后交联(post-synthesis attachment)：

❖ 探针制备：

❖ 点样：化学喷射法 ,喷点法

2. 样品的制备：

提取DNA或RNA，PCR或RT-PCR扩增，掺入荧光染料标记

3. 杂交

芯片的杂交属于固液反相杂交即探针分子固定于芯片表面, 与液相的靶分子进行反应

4. 杂交图谱的检测和资料分析

5.cDNA文库：

提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

实际为不包含内含子的基因组文库。

cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。 cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。

cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和，代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因

cDNA 文库的构建

cDNA 文库的构建共分四步：

第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；

第二，第一链 cDNA 合成；

第三，第二链 cDNA 合成；

第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。

❖ 双链DNA合成后，利用核酸酶S1切去回折处单链DNA，但会使cDNA失去5‘端部分序列。现在较少用

❖ RNaseH 部分水解杂交链中的RNA链，但留下一些小片段RNA，作为合成cDNA

第二链的引物。还需要加入DNA连接酶连接合成片段

❖ 末端转移酶在cDNA第一链3’端添加一种寡聚寡聚核苷酸尾巴，然后以配对的寡聚物作为引物合成第二链

6. DNA测序：

DNA 的序列分析的两种基本方法：

❖ 化学法 Maxam-Gilbert

❖ 酶法 Sanger，双脱氧终止法

现在全自动测序仍然沿用 Sanger 氏酶法，但是在标记上作了改进

1. 双脱氧终止法：

双脱氧核苷酸(ddNTP) 的脱氧核糖的 3‘ 位置的 -OH 缺失。

当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在 DNA 多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与 DNA 合成，以其 5' 位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的 3' 位置的 -OH 结合，但是，由于它自身 3' 位置 -OH 的缺失，至使下位核苷酸的 5' 磷酸基无法与之结合

过程：

▪ 设计4种反应体系：

❖ 都含有正常的4种dNTP（其中一种用同位素标记）

❖ 单链DNA模板（即待测DNA）

❖ 引物和DNA聚合酶I

❖ 每组分别各加入一种ddNTP

▪ 如果是 dNTP 掺入其中， DNA 互补链则将继续延伸下去；

▪ 如果是 ddNTP 掺入其中， DNA 互补链的合成则到此终止。由于双脱氧核

苷酸的掺入是随机的，故各个新生 DNA 片段的长度互不相同

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（能分辨出小至一个碱基长度差的 DNA 片段），将混合产物中不同长度 DNA 片段分离开，再通过放射自显影，根据片段尾部的双脱氧核苷酸读出该 DNA 的碱基排列顺序

2. DNA 自动测序：

▪ 基于 Sanger 双脱氧链终止法的原理，只不过 用四种不同的荧光染料分别标

记 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP 。

▪ 碱基。

这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种

▪ ddGTP

延伸中的 DNA 互补链分别终止于不同荧光标记的 ddATP、ddTTP、ddCTP、