细胞死亡方式的检测方法_王莲

第四军医大学学报(JFourthMilMedUniv)2009,30(24)　http://www.fmmuxb.cn

裂)出现之前,一旦线粒体跨膜电位崩溃,则细胞凋亡不可逆转.线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如JC-1等可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低.但是要注意的是,除了在凋

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·综述·　文章编号:1000-2790(2009)24-3196-03

细胞死亡方式的检测方法

王　莲,刘永红,李晓宁,黄远桂

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亡中出现线粒体去极化外,在胀亡中也可发生此现象[1].

第四

3　caspases检测

caspases是四聚体蛋白酶,在构成上表达为caspases前体.当暴露于凋亡刺激物时,caspases裂解、激活.这反过来导致下游效应器caspases的裂解和激活,后者启动了导致凋亡过程所具有的形态学改变.其中,caspase-3是诱导细胞死亡过程中的一个关键因素[2].caspase-3的激活提示PCD进程中注定不可逆地出现细胞死亡[3].caspase-3的激活是一种代表凋亡的标志.用caspase-3的激活作为凋亡标志的优势是可在死亡过程的早期阶段探测到凋亡细胞[4].caspase-3激活是一个早期事件,出现于仍有活力的细胞,发生在细胞形态和核结构发生改变之前[2,5].对caspases检测可用免疫组化方法,也可用WesternBlot分析方法.4　DNA片段检测

细胞发生凋亡或坏死时,DNA发生断裂,胞质内出现DNA片段.探测DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳、酶联免疫吸附法、TUNEL法及其它检测方法如ISEL(insituendlabeling)、ISOL(InSituOligoLigation).

4.1　琼脂糖凝胶电泳和酶联免疫吸附法　凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180～200bpDNA片段,而胀亡或坏死细胞的DNA断裂点为无特征的弥漫性随机片段,利用这些特征使用琼脂糖凝胶电泳可以确定细胞的死亡方式.凋亡细胞经电泳后出现阶梯状(DNALadder)条带;而胀亡或坏死细胞经电泳后呈随机性电泳条带[6].观察DNA最常用的方法是利用荧光染料EB进行染色.凝胶应该在无EB情况下电泳,电泳结束后用EB染色.但是要注意的是,在坏死中发生的蛋白水解途径也能导致将DNA分裂为核小体间片段的酶激活,因此也可能出现DNA阶梯状条带,这与凋亡过程中见到的情况不能区别[7].

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体.核小体由组蛋白及DNA片段组成,可用酶联免疫吸附法检测.4.2　TUNEL法　TUNEL方法是通过检测DNA双链断裂暴露出的粘性3′-OH末端来确定凋亡的经典方法.在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下,DNA的3′-末端与荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素标记的脱氧核糖核苷酸结合,从而进行凋亡细胞检测.TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离出来的细胞,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.用光学显微镜或共聚焦显微镜观察TUNEL检测结果,阳性着色的为凋亡细胞[8].TUNEL法标记的是凋亡晚期阶段的细胞,在此阶段,细胞形态已经明显紊乱.虽然TUNEL方法能识别发生凋亡

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(成都军区昆明总医院地干病房,云南昆明650032,

军医大学西京医院神经内科,陕西西安710033)

【摘　要】为了能对细胞死亡的机制和途径进行更深入的了解,许多科学家发展了越来越多的检测方法.为了利于对各种检测方法的了解和选择,本文对目前常用、实用及新发展的一些检测细胞死亡方式的方法进行了总结,对各种检测方法的检测原理、判定标准及优缺点进行了描述.【关键词】细胞死亡;检测方法;凋亡;坏死;胀亡【中图号】R361.3　　　【文献标识码】A0　引言

为了能对细胞死亡的机制和途径进行更深入的了解,许多科学家包括毒理学家、病理学家、解剖学家和组化学家发展了越来越多的检测方法.细胞死亡的方式可根据形态学、细胞膜通透性及染色体变化情况,并可结合各种染色或标记方法来确定.最常用的观察方法是用光镜、电镜或共聚焦荧光显微镜观察细胞、细胞核形态、细胞膜及细胞超微结构的改变,并按目前大多数学者接受的形态学标准加以鉴别.另外,流式细胞仪也常用于细胞变性的检测.为了利于对各种检测方法的了解和选择,本文对目前常用、实用及新发展的一些检测细胞死亡方式的方法总结如下:1　流式细胞仪定量分析法

细胞发生凋亡时,细胞膜的通透性增加,程度介于正常细胞与坏死细胞之间.利用这一特点,将被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中的细胞荧光强度,从而来区分正常、坏死和凋亡细胞.例如荧光染料PI(propi-dineiodide)或EB(ethidiumbromide)等不能进入细胞膜完整的细胞中,故正常细胞和凋亡细胞对这些荧光染料抗染,坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损,可被这些染料染色.根据这些特性,就可在流式细胞仪上将凋亡细胞和坏死细胞区别开来.选择荧光素染料时,要依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长来考虑.2　线粒体跨膜电位检测法

此法可用于早期凋亡的识别.线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,细胞发生凋亡时出现线粒体去极化而使线粒体跨膜电位下降,从而可引起线粒体膜内外一系列的生化改变,引起细胞凋亡的级联反应,最终导致细胞凋亡

[1]

.因

此,线粒体跨膜电位下降是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断

收稿日期:2009-07-01;　接受日期:2009-07-23

作者简介:王　莲.博士,主治医师.Tel:(0871)4774887　Email:lian-wangping@163.com第四军医大学学报(JFourthMilMedUniv)2009,30(24)　http://www.fmmuxb.cn的细胞,但是有时凋亡和坏死重叠,因此一些凋亡性细胞未染色,这使得在一些情况下会低估凋亡信息.而且,甲醛固定能妨碍TUNEL染色,被标记的细胞和周围正常细胞的对照性较差,在组织切片上难以确定准确结果.TUNEL染色对凋亡来说不是特异的,在胀亡中也可以见到[9].

4.3　ISOL法　ISOL法是根据T4DNA连结酶的特异性进行的.在此方法中,标有生物素的核苷酸与特殊类型基因组DNA末端(顿和短的单基末端-凋亡细胞的特征)反应;之后,加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶结合物,与寡聚核苷酸上的生物素紧密结合;最后,加二氨基联苯(一种产色的过氧物酶底物),产生棕色的沉淀物,用明视野显微技术观察.ISOL反应与TUNEL,ISEL比较产生的假阳性结果较小5　组化染料5.1　细胞核染料

5.1.1　Hoechst　Hoechst是一种不需要透化作用就可以穿透细胞膜并将DNA染色的的蓝色荧光染料

[10]

[3]

3197

凋亡性细胞.如依次使用AO和EB染色,使用共聚焦显微镜观察.EB不能穿透活细胞的质膜,而只穿过受损的细胞膜进入细胞[12],选择性地标记细胞膜受损的细胞,AO具有细胞渗透性,活和死亡细胞均标记.两种染色方法的结果是:活细胞核AO染色呈绿色,凋亡细胞核AO染色呈黄或橘红色,坏死细胞核进一步EB染色呈红色,显示为绿色和红色光谱区共存.5.1.5　Ethidiumhomodimer　Ethidiumhomodimer对核酸具有高度亲和力且不能透过膜完整的细胞.正发生死亡的细胞膜易通透,可允许ethidiumhomodimer进入到胞浆和核.当与DNA或RNA结合时,染料的荧光强度增加40倍.当在528nm激发时,正在死亡的细胞核显示红色(617nm释放).因此,ethidiumhomodimer荧光提供了一种识别死亡或正发生死亡的细胞的简单方法.用ethidiumhomodimer的好处是当与核酸结合时,与其它核酸染料如PI比较,它以更高的强度发出荧光,对膜更不通透、对DNA更具有特异性;另外,它不需要像Hoechst那样需要紫外光激发[16].

5.2　细胞膜染料(Annexin-V)　在正常细胞,PS主要位于质膜的内小叶,而在凋亡早期,PS从质膜的内小叶易位到外小叶(发生在核断裂之前),这可用Annexin-V来识别.Annexin-2+

V是一种Ca依赖性磷脂结合蛋白,对PS高度亲和.将An-

.

,是与DNA特异

结合的非细胞毒性活性染料,优先与双螺旋小沟外面的三个腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基对结合[11],既可染有活力的细胞又可染发生凋亡的细胞,常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜(在紫外光照明下)观察或流式细胞仪检测.细胞发生凋亡时,会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染,凋亡细胞的凝缩染色质着色比正常细胞的染色质更亮.5.1.2　PI　PI是一种核酸荧光染料,用作死亡或正在死亡细胞的一种标志物,因为此染料不能穿透活细胞的质膜,而只穿过受损细胞膜进入细胞

[12]

nexin-V进行荧光素或生物素标记,作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生.Annexin-V结合到细胞膜可使我们识别正在凋亡的细胞.Annexin-V与凋亡细胞相结合可在各种活体模型中定量凋亡细胞的数目.Annexin-V标记为阳性的时程依赖于所测系统的敏感性[17].Annexin-V法的优点是细胞不需要固定,避免了PI法中因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法中因固定造成的DNA片段丢失,不仅省时,结果亦更为可靠.然而,此方法不适合阐明关于凋亡动力学方面的问题.

PS从质膜的内小叶易位到外小叶在坏死性细胞中也可以发生[18],Annexin-V检测也为阳性.即使在坏死期间不发生PS易位,质膜完整性的丢失(是坏死的特征)也会使试剂很容易进到膜内部而导致假阳性.因此使用这一方法有时可能不能区分坏死或凋亡,多种染色方法结合使用,更有利于对细胞死亡的探测,如用Annexin-V和PI二重或两者又结合DAPI的三重免疫荧光染色来确定细胞是坏死还是凋亡.Annexin-V和PI二重染色时,Annexin-V阳性(膜绿色)而PI阴性为凋亡表现;Annexin-V(膜绿色)和PI(核红色)均阳性为坏死表现.三重染色时,AnnexinV将膜染成绿色,DAPI(蓝染)和PI(红染)将核染成粉色,也提示胀死或坏死.5.3　细胞质染料

5.3.1　Calcein-AM　Calcein-AM是一种非荧光、膜通透性的脂酶底物,后者被动地被装载进细胞.当分子的乙酰氧甲基酯部分水解时释放Calcein,后者不能透过膜,它被包围在膜完整的细胞胞质内.Calcein在蓝光(497nm)激发下发出绿色荧光(517nm).Calcein的绿色荧光提示细胞有完整的膜及脂酶活性,使其成为追踪活细胞的有用工具[16].

CalceinAM-ethidiumhomodimer联合染色程序也是方法学中重要的步骤.calcein-AM将活细胞染成绿色,ethidiumho-

,所以在凋亡晚期的细胞和死细

胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染.PI染阳性、细胞核不凝聚或断裂的细胞认为是坏死性的[13].

5.1.3　DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)　DAPI也是一种标记细胞核的蓝色荧光染料,能够与DNA中大部分A、T碱基相互结合,因为DAPI可以透过完整的细胞膜,它可以用于活细胞和固定细胞的染色.DAPI染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测.在荧光显微镜下观察时,利用紫外光激发,显示染色体浓缩、核分成小裂片或断裂.5.1.4　AO(acridineorange)和EB　AO为一种膜通透性活体染料,可区别正常和凋亡细胞核.在活细胞中,AO可作为一种PH指示剂,因为它被酸性层包围时会发出鲜亮的黄或橘红色光.正常和凋亡性细胞核染色不同,正常PH时,AO将双链核酸染为绿色,在凋亡过程中因为细胞核酸化、PH值降低而将凋亡细胞核染为黄或橘红色.因此,AO已被用作识别凋亡细胞的染色方法[12].AO程序有以下优点:首先,它可用于活细胞,在可能正发生死亡的细胞群中识别出凋亡细胞;第二,能根据其所发出的黄或橘红色光区别早发或晚发的凋亡.凋亡核的PH值降低可能与溶酶体的融合有关[12].凋亡核在所染颜色上可能会逐渐变化,因为当更多的溶酶体与核融合时,它变得更酸,AO染色从绿色向橘红色转变,这也反应了活或变性细胞的动态表现.因为AO为向溶酶体剂,可用其定量酸性囊泡的累积[14].还可以用AO染酸性空泡结构来评价自噬性细胞死亡[15].

这种简单的方法可灵活地附加到其它方法以识别和研究3198

modimer将死亡细胞的核染成红色.

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编辑　黄良田

5.3.2　TB(trypanblue)　TB用于检测细胞膜的完整性.如果细胞膜不完整、破裂,TB染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死.如果细胞膜完整,细胞不为TB蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞.5.3.3　H＆E(hematoxylin＆eosin)、尼氏或银染方法　尼氏或H＆E染色方法简单,是通过形态学变化或染色强度的变化来推断细胞变性,能显示变性细胞的一些变化,如细胞皱缩,空泡形成和染色过深.银染方法是选择性地将变性细胞染成黑色,而正常细胞不被染,因此,对比度高,容易区分变性和正常细胞.

5.3.4　Fluoro-Jade类染料　FJ类染料包括FJ、FJB和FJC,是一类阴离子绿色荧光配体,仅特异性探测和定位变性神经元,由Schmued等分别于1997年[19]、2000年[20]和2005年[21]开始引入.FJ家族成员对脑切片上正发生变性的神经元有高度亲和力,整个变性神经元包括细胞体、树突、轴突和轴突末梢均可突出显示,在背景上却不显示神经纤维网或正常细胞.染色方法简单、敏感、可靠、确定,染色结果很稳定,不需要特殊的储存条件和抗淬灭剂.而且,FJ类染色可与许多其它的标记程序如免疫荧光技术共同进行.6　凋亡动态信息检测

6.1　EYFP(enhancedyellowfluorescentprotein)易位检测法　Golbs等[4]描述了一种可以在神经元中实时观察凋亡启动的新方法,即用EYFP易位作为凋亡的标记物,这种荧光蛋白是一种Aqueoravictoria绿色荧光蛋白的变异体.用编码胞体内荧光蛋白的质粒转染神经元,在caspase-3被激活时,融合蛋白裂解,转入核内.由此可以通过荧光信号从胞体到核的易位来识别凋亡过程的发生.

6.2　FRET(fluorescenceresonanceenergytransfer)　这也是一种实时研究凋亡过程的方法[22],可在蛋白两端残基上分别与ECFP(enhancedcyanfluorescentprotein)和EYFP融合,此融合物在没有被裂解前发生FRET,当蛋白被裂解后,两种荧光基团分离,这时可以监测到FRET消失.利用此方法也可阐明凋亡过程中发生的caspase-3的早期激活.【参考文献】

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