3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量

一：目的

了解3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理 掌握总糖定量测定的操作方法 二：原理

还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。

HCOHOCOHHCOHHCOH( )nH2COH还原糖（碱）COHHCOH( )nH2COH烯二醇（碱）加热COOHOH糖酸COOHOHO2NNO2O2NNH23,5-二硝基水杨酸（黄色）3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）

黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。

对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以

折算系数（1-

18180= 0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。

三：实验材料及设备 1、材料：面粉

2、仪器：分光光度计 电子天平 沸水浴 3、器材：

刻度试管： 25mL×8 容 量 瓶： 100mL×2 锥 形 瓶： 100mL×1

移 液 管： 1mL×2 2mL×2 10mL×2 烧 杯： 250mL×1 50mL×1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 滤 纸： 11cm 坐 标 纸

漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1 四：试剂的配制

1、葡萄糖标准液（1mg/mL）

预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。

2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）

将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备用。 3、碘液

称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。 4、酚酞指示剂

称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%（V/V）的乙醇中。

5、HCl溶液（6N）

取500mL12NHCl，用水稀释至1000mL。 6、NaOH溶液（6N）

取240gNaOH，加水溶解，定容至1000mL。 五：操作步骤 1、样品中总糖的提取

(1) 取材：称取0.7g面粉，准确记录实际质量（W），放入100mL锥形瓶中。 (2) 溶解：先用几滴蒸馏水调成糊状；加入15mL蒸馏水；再加入10mL 6N HCl，

搅匀。

(3) 水解：置于沸水浴中水解30分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，

加1滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应继续水解。如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。

(4) 中和：加1滴酚酞指示剂，加入10mL 6N NaOH中和至微红色。 (5) 定容：将溶液转移至100mL容量瓶（B1）中，定容。 (6) 过滤：用滤纸过滤。（注意，滤纸不能用蒸馏水湿润。）

(7) 稀释：精确吸取滤液10mL，移入另一个100mL容量瓶（B2）中，定容。（B2）

液作为总糖待测液备用。

2、标准曲线制作及样品测定

取8支25mL刻度试管，按下表所示顺序操作。

管号 操作 葡萄糖标准液(mL) 样品待测液(mL) 蒸馏水(mL) DNS试剂(mL) 反应 空白 0 标准葡萄糖浓度梯度 1 2 3 4 5 样品 Ⅰ Ⅱ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 1.0 1.0 各2.0 各管混匀，沸水浴5分钟 定容 比色 记录吸光度（A540）

六：结果处理：

冷却；分别用蒸馏水定容至25mL 以0号管为空白参比，测定光度 =540nm处的吸1. 由0～5号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；

—

2. 求两个样品管A540的平均值A540；

—

3. 由A540从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)； 4. 计算你所取的生物材料中总糖的百分含量。