生态学实验

目 录

实验一 光强度的测定※ 实验二 温湿度测定※

实验三 种群空间分布格局的调查※ 实验四 植物群落数量特征的调查※ 实验五 植物群落中种的多样性测定※ 实验六 人体内微生物菌群分布的测定※

实验七 牛乳在自然发酵与酸败过程中细菌的生态演变※ 实验八 种间关系分析

实验九 饮料和水的卫生检测 实验十 污染胁迫对生物的影响 实验十一 等位酶技术 参考文献

注: ※为必做实验。

实验一 光强度的测定

一、目的

1、了解测定光强度的几种途径，并掌握照度计的原理及使用方法；

2、通过不同树冠内及不同群落中光强度的测定，认识植物和光的相互影响。 二、仪器

ZDS-10型照度计、钢卷尺、皮卷尺、记录纸。事先选好被测树木及测试群落。 三、原理

地球上所有生命的维持，均依靠来自太阳的辐射能。生物圈所接受的太阳辐射，其波长范围在290纳米到3000纳米之间，其中，波长380纳米到720纳米的可见光谱区的能量约占全部辐射的40~45%。绿色植物仅吸收波长380纳米到740纳米的辐射。

测定太阳辐射有两种途径，第一是测定辐射量，即入射到接收表面上的总辐射量以热量单位、能量单位或功率单位表示，如卡.厘米-2.分-1；瓦.厘米-2等。所用测定仪器为各种辐射仪和日射仪，前者是以热电偶为基础的热电装置，后者以双金属的变形对比做基础。这一途径对研究植物的能量平衡和生态系统中的能流过程是必要的。

第二种途径是测定照度或光强度，即物体表面所获得的光能量，以照度单位米烛光（lx）或千米烛光（klx）表示（100 klx=1.5卡.厘米-2.分-1）。由于植物生理有效辐射大致与可见光谱相吻合，所以这一方法也常被生态学或生理学工作者所采用。所有测定仪器通常以光电原理为基础，如各种照度计。照度计通常由光电变换器（光探头）、放大器、显示器等部件构成，关键部件为光探头。光探头的大小、形状可以不同，但其工作原理是相拟的。 四、实验步骤（分组进行） 1、仪器使用方法：

⑴取照度计，将电池放入主机箱内，然后放在测量环境位置进行测量； ⑵将开关拔向“ON”位置；

⑶打开按收器遮光罩，则仪表显示出被测点的照度读数。读数时注意事项：显示屏的右方有四个箭头（任何情况下只有一个箭头显示出来），当箭头指在×10-1档位时，应将显示屏上的读数乘以10-1后才是被测点的照度值。同理其它。箭头指在哪一档是由被测点的照度值决定的。

⑷若测量场合的照度多变时，为了便于读数，可将读数保持开关拔向“KEEP”一端，便可使显示屏上的读数保持不变；待读数结束后再将开关拔向“ON”，即可进行下一次的测量； ⑸当仪器工作时，如液晶显示屏上方出现“LOBAT”，说明机内电源电压已不足，应更换新电池；

⑹仪器用完毕，应将电源开关拔向“OFF”，以防电池空耗。

使用注意事项：严防剧烈震动，且应放干燥、无腐蚀性有害气体的环境中。

2、不同树冠内光的分布：选树冠密实与疏散的树木各一棵，分层测树冠内的光强度；同时测树冠外光强度，做为对照。每一层重复6次，记录结果，求平均值，计算各层相对光强度。

3、不同群落中光强度测定：选禾草群落、杂类草群落及人工林各一块。在每一群落中随机设置3个样点，每一样点上分层测定光强度，每层重复4次，记录结果，求平均值，计算各层相对光强度。

4、2和3步骤连续测5~8次制光强与时间的图。 五、讨论

1、比较各层光强的差异，分析植物对光强的影响。 2、大致绘光强与时间二度图，观察光强的变化规律。

实验二 温湿度测定

一、目的

温度与植物的生态学关系分析中，大气候、地方气候的特性可依据气象资料说明，局部小气候或生境中的热状况，则通常由实地观测获得。本实验通过对不同生境中气温与地温的测定，掌握测定温湿度的一般方法，并讨论植物与温湿度的生态关系。 二、仪器

水银温度计，TES-1360数位式温湿度计，记录纸，钢卷尺。 三、原理

植物生态研究中，测量温度的仪表可分为液体温度计、金属温度计和电温度计三大类。读数要准确。

气温测定：水银温度计或温湿度计 地表温度测定：最高和最低温度表 土壤温度测定：曲管地温表（浅层），直管地温表（较深层） 水温测定：水温计（表层温度），深水温度计（40米以下水深），颠倒温度计（40米以上水深）

四、实验步骤

1、观测场地的选择

2、仪器的安置（用绳固定）

3、观测程序：正规要求日进程，每2小时测一次。本实验每1小时读一次数，观察7小时，记录结果。（自设计表） 五、讨论

1、比较各测量点温度和湿度的差异，分析植物对它们的影响。 2、大致绘温度与时间二度图，观察温度的变化规律。

3、从实验一和实验二结果分析大气候与小气候之间的关系。

实验三 种群空间分布格局的调查

一、目的和意义

通过本实验，使学生认识群落中不同种群个体在空间分布上表现出的不同类型，了解检验种群空间分布类型的方法，并掌握种群最小面积确定方法和利用计算机处理生态学数据基本方法。

二、仪器、设备及材料

皮尺、铅笔、野外记录表格、计算器、计算机。 三、方法与步骤（野外调查） 1、准备工作:每两个学生一组选择所需研究的植物或动物种群,并确定合适的样地位置。调查前先画好野外记录表格（P58），并带齐调查所需物品。

2、确定样地面积：应根据最小面积确定，草本1m×1m，灌木5m×5m，乔木可20m×20m。 3、采用邻近格子法在所选出样地中划分小样方：草本0.1m×0.1m或0.2m×0.2m，灌木1m×1m，乔木可4m×4m或5m×5m。至少测8个小样方。

4、计数:将每一小样方中待测植物的株数,记录在野外记录表格中。 四、结果

1、画出你所确定种-面积曲线图，最小面积为多大？

2、采用方差/平均数比率法得出所调查物种的空间分布格局，之比=0为均匀分布；=1为随机分布；大于1为成群分布。

3、列出原始数据表格，并打印出植物丰富度的柱形图及折线图数据处理。 五、思考题

1、种群空间格局分布类型的特点及可能形成原因的分析。 2、讨论样方大小对实验结果的影响。

实验四 植物群落数量特征的调查

一、目的

使学生通过本实验掌握群落数量特征的调查方法，进一步可了解通过这些基本数量特征如何得出群落的其它特征。 二、仪器

1 平方米方框、铅笔、野外调查记录表格、计算器（自备） 三、原理

种群的数量特征是群落调查的重要内容，在植物生态学定量分析中尤为重要。在调查中取样非常重要，一般有两种：主观取样法和客观取样法。后者包括随机取样（较理想的方法）、规则取样（系统取样）和分层取样。

选定取样方法后，取样技术确定。常用的有样方法、样线法（植物组成分析及植被动态研究多用）、点样法（常用于草本群落的调查）及点四分法（森林和灌丛调查中多用）。本实验采用样方法。

样方即方形样地，是面积取样中最常用的形式，也是植被调查中使用最普遍的一种取样技术。

物种丰富度：群落所包含的物种数目。 多度：群落内各物种的个体数量。

密度（D）：单位面积上特定种的株数。

相对密度（RD）=100×某种植物的个体数目/全部植物的个体数目 高度（H）：植物体自然高度

相对高度（RH）=某个种的高度/所有种高度之和

高度比（HR）=某个种的高度/群落中高度最大的种之高度

频度：指某物种在样本总体中的出现率F=某物种出现的样本数/样本总数×100%

盖度、相对盖度、盖度比、优势度、相对优势度、重量、相对重量、重量比、总优势比、相对频度、频度比。 四、实验步骤 1、每4个学生一组，在已知的群落类型里用1平方米样方测定其种数及每个种的确个体数，及每个种的高度。重复取样8次，样方随机放置。 2、整理合并数据。 五、结果与讨论

1、列出你所调查的各样方调查结果，并得出整个群落的数量特征。（可进一步利用它们得出群落的其它综合特征。）

2、您认为合适的样方为多大？多少个样方最合适？怎么减少数据误差？ 3、对研究的群落，取哪些数量指标较为合适？为什么？

实验五 植物群落中种的多样性测定

一、目的

通过对群落中种的多样性的测定，认识多样性指数的生态学意义及掌握测定种的多样性的方法。 二、仪器

1 平方米方框、铅笔、野外调查记录表格、计算器（自备） 三、原理

物种的多样性是反映群落结构和功能特征的有效指标，是生态学稳定性的量度，因此研究群落中种的多样性对认识生态系统的结构、功能和稳定程度有着重要的意义。种的多样性反映了群落自身的结构和演替特征。群落的自身发展均趋于最大限度地利用环境资源，构成最复杂的结构特征，以适应当地环境空间的异质性。因此，要充分发挥生物种间的相互作用和调节能力，以维持生态系统的稳定和平衡。

多样性指数是以数学公式描述群落结构特征的一种方法，一般仅限于植物种类数量的考察。在调查了植物群落的种类及其数量之后，选定多样性公式，就可计算反映植物群落结构特征的多样性指数。

计算多样性的公式很多，形式各异，而实质是差不多的。大部分多样性指数中，组成群落的生物种类越多，其多样性的数值越大。

种的多样性有以下几个方面的生态学意义：1）是刻划群落结构特征的一个指标；2）用来比较两个群落的复杂性，作为环境质量评价和比较资源丰富程度的指标；3）从演替阶段的多样性比较，可作为演替方向、速度及稳定程度的指标。

本实验采用Simpson的多样性指数和Shannon-Wiener多样性指数（见教材）进行练习。 四、实验步骤 1、每4个学生一组，在已知的群落类型里用1平方米样方测定其种数及每个种的确个体数，及每个种的高度。重复取样8次，样方随机放置。

2、整理合并数据，并分别计算Simpson和Shannon-Wiener多样性指数。 3、比较不同群落类型的种多样性指数，并给以生态学意义上的解释。 五、结果与讨论

1、 1、 计算出群落的多样性指数。

2、 2、 多样性指数在群落分析中的作用；比较不同组之间的结果，分析相同或相异的

原因。

实验六 人体内微生物菌群分布的测定

一、目的

通过微生物菌群的初步测定，了解微寄生物与宿主的关系以及在宿主的分布规律。 二、原理

种群与种群之间的关系主要有竟争、捕食和寄生等，寄生物是多种多样的，寄生的方式及传播方式也是多种多样的。寄生物包括微寄生物、大寄生物及拟寄生物，微寄生物在人体不同部位分布情况是不同的。 三、仪器、试剂 恒温培养箱，冰箱，酒精灯，光学显微镜，培养皿，三角烧瓶，试管，载玻片，玻棒， 500mL葡萄糖盐水瓶， 牛肉浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂 四、实验步骤

1、分别取痰液、鼻内容物、牙垢或耳内容物或用手，涂布或划线 2、于28℃倒置培养24 h。

3、观察菌落特征，进一步纯化细菌进行革兰氏染色观察形态观察。 五、讨论

1、绘出所观察到的细菌形态，并描述菌落的特征。 2、比较不同部位分离微寄生物的的异同，有何规律？

实验七 牛乳在自然发酵与酸败过程中细菌的生态演变

一、目的

1、通过生牛乳的自然发酵了解牛乳酸败过程中细菌的生态演变过程。 2、了解牛乳的制作原理。 二、原理

由于牛乳的特殊生态，刚采集的生牛乳含有少量不同的细菌，而牛乳的成分对细菌来讲是一种很好的营养培养基，因此，在温暖的条件下，细菌即开始很快地繁殖。然而也不是所有的细菌都能如此，由于当时生牛乳的pH是中性，含有丰富的乳糖，故有利于自然存在的乳酸菌繁殖。它们发酵乳糖，使pH降低，随后被耐受低pH的发酵乳糖的菌种所代替，接着pH更低，接着酵母菌生长，pH再上升，假单胞菌和芽胞杆菌生长，当乳中蛋白质被利用完毕，牛乳的分解也就完成。生牛乳的这种生态演变过程是一个典型的例子。还有沼气。 三、仪器、试剂

恒温培养箱，光学显微镜，酒精灯，三角烧瓶，吸管，载玻片，玻棒，小倒管，牛奶，试纸，革兰氏染液，二甲苯，载玻片 四、实验步骤

1、旋转装牛乳的三角烧瓶，使样品充分混匀。 2、用灭菌滴管或接种环以无菌操作取一滴牛乳，放在pH试纸上比色，将结果记录于“结果”的表格内。

3、用无菌操作取满一接种环牛乳，在玻片上均匀涂2.5cm2面积（可先在纸上画2.5cm2的方格，然后将玻片放在纸上），玻片标明日期。

4、玻片放空气中干燥。贮存在一有盖盒内，待整个实验的所有涂片制作后一起进行“7”以后的步骤或每片先进行“7”步，再贮存，待所有玻片制成后再进行“8”以后的步骤。 5、牛乳样品放30℃温箱内培养。整个实验（约需10d）均需地此温度下培养。

6、每两天重复取样测pH和制作涂片。每次制作用同一接种环，取同样的量。直至牛乳完成变酸过程和开始为止。

7、所有涂片都用二甲苯处理约1min，以除去牛乳的脂肪，干燥后，火焰固定。 8、革兰氏染色。

9、油镜下观察，数几外视野的主要类型的细菌数，计算每一视野的平均数，描写细菌类型，注明形态（杆状或球状），大小（长或短，细长或宽大）以及排列（单个或呈链状）等。 五、结果与讨论 1、结果 天 pH 描写微生物类型 每视野的近似数 用上表数据绘制pH曲线和各细菌的生长曲线。 2、用自己的实验结果说明细菌在牛乳的自然生态演变中是如何改变其环境的，又如何依次影响有关细菌的？

3、如果你利用生牛乳通过细菌自然发酵制造能饮用的酸牛奶，应控制在哪一时期。

实验八 种间关系分析

本实验包括种间竞争和他感作用两个部分。 一、目的和意义

通过本实验使学生认识什么是种间竞争，种间竞争与他感作用的区别是什么。

种间竞争是指两个种在所需的环境资源或能量不足的情况下而发生的相互排斥关系。在为种相互关系中，对竞争中的个体生长和种群数量的增长都有抑制作用。种间竞争在自然界中是易于观察到的。种间竞争能力，决定于种的生态习性和生态幅度。而生长速率、个体大小、抗逆性、叶子和根系的数目以及植物的生长习性，也都影响竞争能力。种间竞争在决定共存的种类方面起着重要作用。

Candolle在1832年首先提出植物间存在他感作用，并使之广泛接受。Molisch首先给出他感作用（allelopathy）定义：化学物质从一种植物转移到另一种植物的过程中，对另一种植物的直接或间接影响（Molish，1937）。他感作用发生在两个不同种之间，研究供体植物（他感植物）对受体植物（目标植物）的他感作用。 二、仪器、设备及材料 1.仪器与设备

直径为22cm的花盆，沙土，有机肥，种子袋，剪刀，漏斗，胶皮管，标签以及放置花盆的台阶型装置等。 2.材料

种间竞争实验选用黑麦草（Lolium perence）和高羊茅（Festuca arundinacea）种子。 他感作用选用向日葵（Helianthus annuus L．）和莴苣（L．sativa）种子。 三、方法和步骤 （一）.种间竞争

实物设计：黑麦草和高羊茅种子按不同比例进行播种，从全部为黑麦草种子到全部为高羊茅 种子，两者的比例分别为：0.00:1.00， 0.25:0.75， 0.50:0.50， 0.75:0.25 ，1.00:0.00每个实验有5个处理，每个处理重复三次，共需15个花盆。

（1）土壤和有机肥充分拌匀，分别装到花盆里，使土面稍低于盆口约2cm，放在温室内备用。

（2）按上述比例，每盆均匀播种40粒种子。播完后，将每个花盆贴上标签，写明处理、重复编号和播种日期。将花盆依次排列在温室内，定期交换位置、浇水。 （3）种子萌发后，统计发芽率和幼苗成活情况。

（4）将生长3个月的幼苗进行收获，分盆分种统计并登记分蘖数、生物量（鲜重）、株高。 （5）将3个重复的分蘖数、生物量（鲜重）、株高进行统计，取其平均值。用图解法进行统计分析。

四、他感作用 实物设计：如图12-1所示，在台阶型装置上部的一排花盆中，每盆播种10粒向日葵种子。在下面一排花盆中，3个盆通过管子和漏斗与上面的盆相连，作为处理；另外3个作为对照。共两个处理，每个处理重复3次。

（1）将土壤和有机肥充分拌匀，分别装到花盆里，使土面稍低于盆口约2cm，放在温室内备用。 （2）先播种向日葵，等到向日葵的真叶出现以后，开始浇一定量的水（超过田间的持水量），使一部分水能够从上边的盆中流出来。第一次流出来的水溶液弃掉。第二次同样处理，将流出来的水溶液通过胶片皮管引入下边的盆中，同样过程进行两次以后，保证下边盆中的土壤水量可以播种。对照浇清水，保证与处理的含水量相同。

（3）每盆播50粒莴苣，将每个花盆贴上标签，写明处理、重复编号和播种日期，同时登记在表格上。

（4）按处理和重复编号，将花盆依次排列在温室内，定期浇水。

（5）种子萌发后，可以统计其发芽率和幼苗成活情况。对生物量进行测定，对所测定的数据进行统计分析。 五、思考题

1、何为种内与种间关系？种间关系有哪些基本类型？ 2、什么是他感作用？研究他感作用有什么重发意义？

3、生物密度效应的基本规律有哪两个？其主要特征是什么？

实验九 饮料和水的卫生检测

一、目的

了解水及其它饮料的常规检测项目，掌握细菌总数检验方法和报告方法，进而了解牛奶、乳制品及多种食品的卫生检验。 二、原理

细菌总数是指食品检样经过适当处理，37℃经24 h培养后，所得1 g或1 mL检样中所含细菌菌落的总数。经过消毒处理的食品，一般是无菌的或其细菌数减少到一定的程度，但当食品受到外界环境的污染、较长时期的保存、或贮存情况不良，这些因素均可使食品中的细菌大大增加，因此，被检食品中的细菌数越多，则表示其质量越差，是判定食品被污染程度的标志。

三、仪器、试剂

恒温培养箱，水浴锅，冰箱，光学显微镜，试管架，酒精灯，500mL取样瓶，培养皿，三角烧瓶，试管，吸管，载玻片，盖玻片，玻棒，小倒管，500mL葡萄糖盐水瓶，吸耳球，牛肉浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，牛奶、矿泉水（2个不同品种）、自来水 四 实验步骤

试验准备：培养皿150个（每10个一包），试管25支（每5个一包），10ml吸管5支（单独包），1mL吸管25支（每5个一包）；配制普通营养培养基2000mL，每500mL一瓶 1、以无菌操作，将检样25 g（或25 mL）剪碎放于含有250 mL（或225 mL）灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1∶10的均匀稀释液。

2、用1 mL灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1 mL，注入含有9 mL灭菌生理盐水的试管中振摇试管混合均匀，作成1∶100倍稀释。

3、另取1 mL灭菌吸管，按（2）操作作10倍递增稀释，如此递增稀释一次，即换一支1 mL吸管。

4、根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个平皿。

5、稀释液移入平皿后，应即将冷却至46℃左右营养琼脂培养基（可放置46℃水浴中保温）注入平皿约15 mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL灭菌稀释液的灭菌平皿内，作空白对照。

6、待琼脂凝固后，翻转平板，置37℃温箱内培养24±2 h（肉、水产、乳、蛋为48±2 h）取出，计算平皿内菌落数，乘以稀释倍数，即得每g（mL）样品所含菌落总数。 五、讨论

1、食品卫生检验中应注意哪些环节？ 2、比较不同样品的检验结果。 3、简述食品检验中的卫生指标。

实验十 污染胁迫对生物的影响

目的和意义

环境污染对生物的影响是多方面的，它可以直接影响生物的生理生化过程，进而对生物的生态过程和生态后果产生重要的影响。

环境污染对生物的影响可以从生物形态结构、生理生态过程，种群动态变化、群落的结构组成、生态系统的功能、景观格局的变化等多个方面进行反映。本实验主要是从生理生态学的角度认识和分析环境污染对生物的影响。

一、 一、 重金属污染对植物叶绿素含量的影响

叶片是植物光合作用的主要器官，叶绿素是植物光合作用最重要的色素。本试验通过模拟不同剂量重金属污染对植物叶片叶绿素a、b含量及其比率变化影响，使学生认识污染对植物作用的剂量效应和毒害过程。 （一） （一） 仪器.设备 研钵、分光光度计（如国产UV—751或755型紫外可见分光光度计）等。 （二）.材料

小麦种子。 （三）试剂 （1） （1） 重金属溶液处理：用水配制分别含Cd2+为0.00、5.00、10.00、25.00、50.00？g·ml-1

的溶液。

（2） （2） 80%丙酮水溶液 （四）方法与步骤 1、实验材料准备

将大小比较均匀的种子用蒸馏水浸泡、吸胀后，移入铺有滤纸的20cm培养皿中，置入光照培养箱中培养。

（一） （一） 染毒处理

在小麦长出2片真叶后，标记培养皿，分别用5个不同浓度的重金属溶液处理。每组作三个平行处理。每两天用蒸馏水冲洗1次，再用原相应浓度的重金属溶液培养。各种材料培养1周后，即可进行叶绿素提取分析。 （一） （一） 叶片叶绿素的提取

称取植物叶片0.1—0.5g，剪碎放入研钵中，加入少量细石英砂研成糊状，用80%丙酮水溶液分批提取叶绿素，直到残渣无色为止。将丙酮提取液过滤后定容至50mL。

（一） （一） 叶绿素的测定

在波长分别为663nm、5nm条件下测定提取液的吸光度。如果浓度较高，经适当稀释后比色定量。叶绿素a和b及总叶绿素的浓度分别为Ca、Cb、CT，可根据下式求算：

Ca=12.7Ａ663-2.69Ａ5 Cb=22.9Ａ5-4.68Ａ663

Cr=8.02Ａ663+20.21Ａ

式中:Ａ663、Ａ5——分别为提取液在波长663nm、5nm下的吸光度。

（五）实验结果分析

每个处理的平行测定结果用平均数±标准误表示，并用F检验分析不同处理间的差异性，利用Execel作图，展示实验结果。 注意事项： 1、 1、 提取叶绿素过程中尽量避免光照，以免叶绿素受光分解。提取过程中可适当加温，以加快提取速度，但要补足丙酮因挥发而减少的量。 2.有些植物材料细胞间质的酸度很高，在磨碎过程中会使叶绿素脱镁成去叶绿素，从而降低了测定值。因此，在磨碎这些材料时要加入pH为8.0的缓冲液一起研磨，并适当提高丙酮浓度，使混合后的丙酮浓度达到80%。

3.使用的分光光度计一定要用光分辨率高的型号如751型。分辨率低的分光度计测定波长的半波宽值大，不足以区分叶绿素a、b的吸收峰，易造成读数偏低，叶绿素a、b比偏小的现象。分光光度计使用前应作波长校正，稍有偏差也可造成相当大的误差。校正方法是：测定叶绿素a丙酮溶液的红光最大的吸收峰必须在波长663nm处。

二 . 农药污染对植物微核产生的诱变效应

在环境污染物质中，一部分有致癌、致畸、致突变效应（简称为“三致”）的物质，

被称为环境污染优先污染物。环境污染优先污染物进入大气、水和土壤环境后，虽然对生物生理生化指标的影响可能不大，但其潜在危害性很大。在“三致”作用下，细胞中的染色体发生畸变，这些畸变在细胞间期中以微核的形式表现出来，可以通过观测统计微核率的大小，认识和评估这类污染物对生物的诱变影响。目前有很多农药溶剂、助溶剂和乳化剂含有这类物质。本实验通过农药污染对植物微核诱变效应的影响，让学生了解农药污染对植物的细胞遗传毒害作用，并以此检测环境中的“三致”物质。

（一） （一） 仪器、试剂和材料 1.仪器

（1）显微镜、盖玻片、载玻片等显微解剖试验用具。盖玻片和载玻片一定要清洁干净。以免影响观察统计结果。

（2）人工光源：自制日光灯灯架。架高50cm，光源为两支并列的40W日光灯。 （3）塑料薄膜或直径为10cm带孔塑料板。 （4）血球分类计数器。 2.试剂

（1）卡诺氏液：由三份纯酒精和一份冰醋酸混合而成（现用现配）； （2）70%酒精

-1

（3） 1.0mol·L盐酸

-（4） 1.0 mol·L氢氧化钠溶液

（5） 1%醋酸洋红：将50mL45%的醋酸水溶液放入150mL锥形瓶中文火煮沸，然后徐徐投入0.5g洋红粉末，再煮1—2h，在此溶液中悬一个铁钉，1分钟后取出，使染色剂中略具铁离子（或在溶液冷却后加入1—2滴醋酸铁溶液）以便增加染色效果。将溶液过滤后，置于具玻璃？的棕色玻璃瓶中备用。

（6）农药磷胺（phosphamidon）与水可溶剂配置系列溶液：0%（对照），5%，10%，20%。 3、材料：蚕豆种子。 （二）方法与步骤 1.材料准备

取蚕豆种子，在蒸馏水中浸泡24h，使种子充分吸胀，置于铺有滤纸的瓷盘 中并盖上湿纱布，在23±1的光照培养箱中培养1—2d，使其长出1.5—3.0cm长的初生根，此时切除初生根以保证侧根的生长发育。 2.染毒处理

待侧根露白后，随机分组。每组选择10粒种子用配制好的农药溶液染毒处理6h，取出后用蒸馏水冲洗，并移至蒸馏水中修复培养22—26h（两个细胞周期）。 3.材料固定

取修复培养结束的蚕豆根尖0.5—1cm于卡诺氏固定液中固定12—14h 4.材料解离

-1

将固定后的根尖材料用0.1 mol·L的盐酸在60℃恒温水浴中解离15—20min。 5.制片

将解离后的根尖材料用蒸馏水漂洗数次，取出置于载片上，从根冠起切取根尖1—1.5mm，用解剖针捣碎，加1—2滴染液，染色10—15min。盖上盖片轻压。 6.镜检

在40×10倍显微镜下，凡小于1/4以下的，同主核有相同染色效果的，圆形，椭圆形或其他类似的形状的染色物质都可以算作微核。根据附表统计微核。 7.微核的定量表示

通常每一处理组至少观察5张较好的片子，每张片子至少观察1000个以上细胞。 结果有两种表示方法：

（1）微核率‰=微核数/观察统计的总细胞数×1000‰

（2）微核细胞率%=具有微核的细胞数/观察统计的总细胞数×1000‰ 实验结果需进行统计分析。统计方法见附件三相关内容。 表5—1 植物根尖细胞微核试验记录表 试验组： 固定日期： 境检日期： 玻片样本号 总细胞数 微 核 分 布 含单微核细胞数 含双微核细胞数 含三微核细胞数 含四微核细胞数 小 计 微核数 含有微核的细胞数 结 果 微核率/% 微核细胞率/%

1 2 3 4 5 6

思考题

1、在分析污染对植物叶绿素含量的影响中，为什么不选用成熟植株，而选用幼苗进行污染处理？

2、在本实验中，哪些是影响叶绿素测定的关键环节？如何提高实验的准确性？

3、经过氯气持续处理时间不同的材料，磷酸化酶的活性出现怎样的变化？为什么？ 4、为什么实验中各个环节都需要缓冲液？

5、微波率和微核细胞率有什么不同？在什么情况下两个数值是相等的？ 6、为什么微核测定可以反映污染物的“三致”效应？

实验十一 等位酶技术

目的和意义

遗传多样性是物种适应环境变化的基础，也是衡量物种进化潜力的重要指标。本实验目的是掌握检测遗传多样性的等位酶技术，并了解不同环境下植物种群遗传多样性及遗传分化的程度。

等位酶技术是利用电泳技术将酶蛋白的不同变异体分离，并推断控制该酶的基因型。酶电泳的方法主要有四种：淀粉凝胶电泳（SGE，包括水平的和垂直的）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、醋酸纤维素凝胶电泳（GAGE）和琼脂糖凝胶电泳（AGE）。琼脂糖凝胶的孔径较大，对蛋白质不起分子筛的作用，适用于较大分子的核酶电泳，而淀粉凝胶和聚丙烯酰胺凝胶的孔径凝胶比较适合于分离蛋白质和小分子核酸，其中分辨率较高的的是聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过本实验主要是使学生掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳和淀粉凝胶电泳的研究方法。

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳

（一）仪器、设备及材料 1、 1、 仪器、设备

垂直板凝胶电泳槽（DYCZ-30型，北京市六一仪器厂），直流稳压或稳流电源（电泳仪），注射器（20、5mL），进样器（100ul），离心机，染色盒（20cm×12cm）研钵，剪刀，镊子，滴管，烧杯，量筒。 2、 2、 试剂

（1）1— （1）1— 9号凝胶贮液：见表11—1

表11-1 1-9号凝胶储液的组成 分离胶 贮液 1 2 3 4

续表 浓缩液 电极缓冲液 贮液 5 6 3 7 8 9 100mL贮液中的含量 1mol/L Hcl 48.0Ml Tris. 5.98g Arc. 10.0g Bis. 2.5g K2S2O8 蔗糖40.0g Tris. 0.60g 甘氨酸 2.88g 水 工作液混合比例 1份 2份 1份 4份 1份 9份 8.3 pH 6.7 100mL贮液中的含量 1mol/L HCI 48.0Ml Tris. 36.6g Arc. 28.0g Bis. 0.74g K2S2O2////0.56g??? 水 工作液混合比例 1份 2份 1份 4份 pH 8.9

注:1.贮液1、2、5、6和8分别为分离胶缓冲液、分离胶、浓缩胶缓冲液、浓缩胶和电极液的浓缩液。

2.．Tris：三羟基氨基甲烷；Arc.：甲叉双丙烯酰胺。

-3

3.注胶前每毫升分离胶工作液加0.6×10 TEMED(四甲基乙二胺);每毫升浓缩胶工作液

-3

加1.5×10TEMED(四甲基础工业乙二胺)。

贮液于冰箱中保存，过硫酸钾可用1周，其他贮液可贮存3个月以上。 （2）.提取缓冲液（简单磷酸提取缓冲液）：在25mL磷酸缓冲液或Tris-HCI缓冲液（pH7.5，

-1-1

0.05～0.1 mol·L）中加入1.25g蔗糖,研磨前加入0.025mLβ-巯基乙醇(0.04 mol·L)和4%^-12%(W/V)R的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。 （3） （3） 酶染色液：称取50mgα-乙酸萘酯，50mgα-乙酸萘酯，100mg固蓝RR

-1

盐（或固蓝B盐），先用约5mL丙酮溶解，再用0. mol·L磷酸缓冲液稀释到150mL。 （4） （4） 过氧化物酶显色液：将5mL联苯母液（2g联苯胺，18mL冰乙酸，加热至沸腾，再加入72mL水）加水稀释至50mL，临用前加入1mL1%的H2O2 3、材料

选择生长在多个不同生境中的同种植物（如旱熟禾）种群，随机采取30个左右个体的叶片，迅速带回实验室。实验中分为苦于组，组与组之间配合完成几个种群的实验。 （二）方法与步骤 1.电泳草的安装

用两手夹住玻璃板的两侧（避免手指玷污玻璃板），将其装入胶框，再将胶框垂直装入两个电极之间，用螺栓将两个半槽固定在一起。按一定顺序逐步拧紧螺母，注意用力均匀。 装好电泳槽后，将熔化的1.5%琼脂注入玻璃板底部的琼脂池内，琼脂凝固后将前后两个电极液槽隔开，但允许电流通过。 2.凝胶的制备

（1）按照表面11-1的比例先将凝胶贮液（1号）、凝胶贮液（2号）和水混合于烧杯中，然后加入催化剂过硫酸钾及四甲基乙二胺（TEMED），混匀，立立即将凝胶液沿凝胶模子后面一块玻璃板的内壁缓缓的注入已准备好的胶室中。胶液加到离玻璃板顶部约两2cm处，立即用装有6号针头的注射器注水使胶的表面覆盖3-5mm水层，静置20-30min，胶和水层之间出现清晰的界面，表示胶聚合完成。 （2）浓缩胶：按照表面11-1的比例将凝胶贮液5号、6号和7号混合，加入过硫酸钾TEMED，同时将分离胶上水层吸出，立即将浓缩液胶混合液注入上述制备好的分离胶上，胶液加到接近胶室的顶部插入梳子，静置聚合。2-3h后聚合完成，小心地取出梳子，向样品槽中加入电极液备用。

3.样品的制备和加样

(1)取约0.2g样品,剪碎后放入预冷的研钵内,在冰浴中研成匀浆,研磨过程中加入约1mL提取缓冲液.

(2)匀浆液在4℃,5000r下离心10min,上清液待用. (3)用进样器在每孔的胶面上加入上清液10 0ul 再加入少量1%的溴酚蓝指示液,用电极缓冲液小心地将每孔充满. 4.电泳和脱胶

（1）向电泳槽内注入电极缓冲液。

（2）连接好导线，将上槽接到电泳仪的负极，下槽接正极。接通电源，电泳开始后电流控制在30mA左右，样品进入分离胶后可加大电流到60mA，这时电压一般在100V左右，此后，维持电流不变。

（3）当指示济到达离凝胶底部1.5cm时可停止电泳,电泳约需2h。关闭电源，吸出电极缓冲液，取出胶框和玻璃板，

（4）5mL注射器灌满水，配上6号长针头，将针头插入胶与板壁之间，一边注水一边将针头向前推进，直至把凝胶与玻璃板分离。将胶平放入染色盒中。 5、染色

（1）.过氧化物酶染色:量取5mL联苯胺母液倒入烧杯中加水至50mL,加入1mL1%的H2O2,将配好的染色液倒入染色盒内,室温下反应,约数秒钟即可观察到棕红色的过氧化物条带。待条带清晰时,弃去染色液,用蒸馏水冲洗,观察,记录酶谱.

（2）.染色:将50mL酯酶染色液倒入染色盒中,室温下显色约20min,可看到酯酶条带.弃去染色液,用蒸馏水冲洗,记录酶谱. 6、谱带分析

二、水平切片淀粉凝胶电泳

（一）仪器、设备及材料 1、 1、 仪器、设备

普通冰箱，电泳槽（DRCP-35型，北京六一仪器厂），稳压稳流电源组（电泳仪），纤维海棉布或纱布，投影胶片，玻璃板，染色盒，煤气灯或电炉，抽水水龙头（或真空泵），恒温箱，天平，微波炉手套，三角瓶（1000mL），研钵，手术刀，冰块等。

（1） （1） 提取缓冲液（简单磷酸提取缓冲液）：同本实验“（一）”。 2、 2、 试剂

-1

（1） （1） 电泳缓冲液：Tris-硼酸-EDTA缓冲液（0.18 mol·LTris，0.004

-1-1

mol·LEDTA，0.1 mol·L硼酸,调酸度pH8.6）。

-1

（2） （2） 凝胶缓冲液：Tris-硼酸-EDTA缓冲液（0.045 mol·LTris，0.001

-1-1

mol·LEDTA，0.025 mol·L 硼酸,调酸度pH8 .6）。 （3） （3） 酯酶染色液: 同本实验“（一）”。 （4） （4） 过氧化物染色液: 同本实验“（一）”。 3、材料 同本实验“（一）”。 （二）方法与步骤 1.制胶

制胶过程最好在实验前一天晚上做好，在室温下过夜，第二天早上使用。

（1） （1） 煮胶：称取27.5g水解马铃薯淀粉,倒入盛有250mL凝胶缓冲液的1000mL的三角瓶中(凝胶浓度为11%),摇匀,用微波炉手套握住三角瓶在火焰上不停地摇,加热约5min胶变稠时,继续用力摇,胶随之又变稀,至将要沸腾时离火。

（2） （2） 抽气：将凝胶接到真空泵上进行抽气，约有0-3min，当胶中只冒少数大泡或不再冒泡时停止抽气，待温度降至刚不烫手时进行注胶。注意抽气装置在煮胶三角瓶和抽气接口之间要经过一个缓冲瓶，以防热胶溢出进入抽气管道，冷却凝固导致管道堵塞。 （3） （3） 注胶：在水平实验台上放置凝胶模盘，趁热把胶倒入模盘中，从中间向四周倒，保证胶的均匀，避免形成气泡。整个过程力求迅速、准确。

（4） （4） 覆盖：取一张投影胶片，在接触胶之前，让薄膜在温热的胶上保持片刻，以使薄膜表面形成一层薄雾，然后从胶的一端向另一端覆盖，再在上面盖一块玻璃板。 2.制样

（1）取约0.1g样品,剪碎后放入预冷的研钵内,加入2-3滴提取缓冲液,冰浴研成匀浆。 （2）磨好后取几片4mm×6mm的纸芯（一般用滤纸制成），沾满溶液放在冰箱中待用。 3.上样

（1）用扁平尖头手术刀沿胶框四周把胶和边框切离，再用两手的前手掌轻轻压住胶，上下平移，使胶的底部和胶模分离，可以移动，在距胶底边约2.5cm处用扁平尖头手术刀切一条缝. （2）.在缝中插入纸芯,纸芯下端接触胶模盘,纸芯之间留出2-3mm的距离。在两端各放置一个沾有溴酚蓝指示液的纸芯。

（3）.在胶顶端和底端与边框之间各放置一条压胶条（有机玻璃条），以保持纸芯与胶之间接触紧密。 4.跑胶

（1）.分别在两个电泳槽内倒入适量（大约2/3）预冷的电极缓冲液，放入冰箱。将模盘架在两个电泳槽间（注意把有样品的一端接负极），在凝胶和电极缓冲液之间搭纱布作为盐桥。 （2）.在胶上盖一张投影纸片，再盖上一块玻璃板。可经在玻璃板上面加放冰块进行降温。 （3）.打开电源开关，首先以20mA的电流电泳约15min，待样品进入电粉凝胶后，暂时中断电流，把纸芯从胶的切缝中取出，然后按原样放好，加大电流至50mA，继续电泳约3-4h。当溴酚蓝指示剂跑出7-8cm时，停止电泳。 5.切片

（1）.把胶小心地从模盘上取出来放到割胶导盘上。

（2）.用割胶弓小心地割成3片，力求割得均匀平滑。割下来的胶放入染色盒中。 6.染色

（1）.过氧化物酶染色：同本实验“（一）”。 （2）.酯酶染色：同本实验“（一）”。 7.遗传判译与计算

（1）酶谱记录：用铅笔和直尺在酶谱记录纸上画出谱带的相对位置和浓度，记录纸可以装订成册，永久保存。 注意事项 保存凝胶

湿存：用固定保存液（乙醇：水：醋酸：甘油=5：4：2：1）固定，用塑料膜包裹起来放入冰箱中保存。

干存：把凝胶切片后用水冲洗后，涂上一层薄薄的甘油，然后用玻璃纸（半透膜）包裹，平铺在一块玻璃上，四周用压条压住，把压条用夹子夹紧，放在通风处晾干。

（2）遗传判译：本实验中都为共显性等位基因，即具不同特征的等位基因都能在杂合子表现型中得以表达。假设某基因位点具有两用人才个共显性等位基因A和A`，那么它有三种可能的个体AA、AA`和A`A`。设等位基因A 编码的多肽链记为○等位基因A`编码的多肽链记为●，则在纯合子中只有一种分子（AA为○，A`A`为●）。酶是由一个（单聚体）或几个（二聚体或多聚体）相同链组成，电泳后在电泳图谱上将表现为一条带，其位置因分子性质而异。在杂合子中有两种多肽链（●和○），结果为： 若酶是由1条链组成（单聚体），则杂合子表现为2条链，一条链与纯合子AA的迁移率相同，另一条与纯合子A`A`的相同。酯酶和过氧化物酶就是这类。 若酶是由2条链组成（二聚体），则由杂合子产生的2种多肽链随机组合将产生3种分子：2种同聚体（○○和●●）和1种异聚体（○●），这时杂合子的产物电泳之后将显示3条明显的谱带，中间一条常常比两端的谱带染色深。 如果酶是由3条链组成（三聚体），杂合子产生的两用人才种多肽链随机组合将形成4种分子：2种同聚体（○○○和●●●）和2种杂聚体（○○●和●●○）。因此杂合子的电泳图谱上显示4条带。 如果酶是由4条链组成（四聚体），两种多肽链随机组合将产生5种分子：○○○○、○○○●、

○○●●、●●●○、●●●●。杂合子的酶谱将显示5条明显的、规则分布的带。 判断基因位点时，由于不同位点编码的酶的区带往往相距较远，而且不同的等位区带的酶谱变化是的，因此可以结合等位基因的判译，根据区带的分布情况（如距离远近）来识别。

（3）.遗传多样性计算：遗传多样性的指标有以下几种。 多态位点百分比

多态位点百分比即所检测位点中多态位点所占的比例。它是反映遗传多态性的重要指标之一，其计算公式为： p=（K/n）×100%

式中：K——多态酶位点的数目； n——所测定酶位点总数； 平均等位基因数目

平均等位基因数目即各位点含有的等位基因数目的算术平均值。计算公式为： A=（见实验书）

式中：A——第i个位点上的等位基因数； n——所测定酶位点总数。 杂合度

期望杂合度（He）？即平均每个位点的预期杂合度，表示在Hardy-Weinberg平衡定律下预期的平均每个位点的杂合度（Nei，1987）。计算公式如下： Ｈe=（见实验书）

式中：Ｈei——第i个位点上的预期杂合度； n——所测定酶位点总数。

Ｑij——第i个位点上第j个等位基因的频率； mi——第i个位点等位基因总数。

观察杂合度（Ｈo）即平均每个位点的实际杂合度，也就是我们观察到的杂合子比例（Nei，1987）。计算公式如下：

Ｈo=（见实验书）式中：Ｈoi——第i个位点上的观察杂合度； n——所测定酶位点总数。 Ｑij——第i个位点上第j个等位基因纯合基因型的频率； mi——第？个位点上等位基因总数。

（4）.遗传分化程度：总基因多样度（Hr）为各种群内基因多样度（Hs）和各种群间基因多样度（Dsr）之和。对任何一个位点来说。他们之间的关系可表示为： ＨT=Ｈｓ＋ＤsT

存在于各种群间的基因多样度的比率为：

ＧsT =ＤsT/ＨT

ＧsT值的范为0—1，？？越大，表示各种群间基因的相对量越大，其中： Ｈｓ＝（见实验书）

式中：Ｈｓi——第I个种群某位点的期望杂合度； n———所测定的种群总数；

qij——第I个种群该位点第j个等位基因的频率； mi——第I个种群该位点等位基因数。 ＨT=？？？？？？？？？？？？ 式中：m——该位点等位基因数； ｒj——该位点第j个等位基因在总种群中的平均频率。

上面是对一个位点所进行的计算，对于全部位点来说，平均基因多样度的Ｈｓ、ＨT 和

ＧsT可以通过计算所有位点的ＨS.ＨT和ＧsTi的算术平均值而获得。

（一） （一） 随机扩增多态性DNA技术（RAPD）

目的和意义

RAPD是基于分子生物学技术聚合酶链式反应（PCR）基础上，分析种群遗传多样性的一种方法。PAPD技术是Williams等人于1990年发明的，此项技术的产生基于这样一种可能性：即一段与某一单一引物同源的DNA序列，有可能在另一链上的不同位置出现，这些位置之间的距离又处于可用PCR进行扩增的长度范围之内。因此，当条件满足时，单个该位点等位基因数寡核苷酸引物就可以在PCR反应中介导DNA呈几何级数上升。

PAPD依靠单一引物（一般为10碱基寡核苷酸片段）与基因组中某些特定的DNA序列退火扩增。这些扩增的特定序列要求在100—3000个核苷酸范围内有与引物匹配的反向互补序列存在，即在3000个碱基对（bp）范围内含有紧密相邻的反向重复序列。这类特定序列多随机分布于整个基因组染色体中，这要包括某些转座子、微卫星和异染色质，有时也能在单烤贝DNA区域扩增。RAPD标记的发明允许在事先未知DNA序列的情况下检测基因组中存在的多态性，大大方便和拓宽了对生物基因组DMA变异的研究。

RAPD扩增DNA片段的数目和大小取决于所用随机引物长度、序列组成和基因组类型。不同引物扩增的同一基因组产生片段的数目不同，同一引物扩增不同基因组产生的片段数目也不同。通常10碱基长的随机引物扩增产生的RAPD片段在200—2000bp范围内，扩增的多态性DNA可通过电泳后片段数目变化来检测，每个引物通常可以产生3—10个不连续DNA片段。一般认为这些产物是由不同的遗传位点产生的。

以种群为研究对象，以种群中的个体为取样单位，提取其中的DNA作为扩增模板，经过不同的随机引物RAPD近增后，电泳检测扩增产物，并统计分析结果，估算种群的的遗传变异状况。不同种群间也可通过本方法比较遗传多样性的差异程度。

近年来，随着分子生物学设备的成套和自动化，进行RAPD分析的速度大大加快。下面介绍一般实验室可以开展的常规实验方法。

（二） （二） 仪器、设备及材料

1、主要仪器和设备

（1）高速离心机：转速达到每分钟12000转以上。 （2）冰箱：冷冻室低温可达-65℃以下。

（3）PCR仪：每次可上样48个以上，建议采用目前比较常用的美国MJ公司PTC-200扩增仪。

（4）电泳仪：可稳压、稳流。 （5）电泳槽：平板电泳槽。 （6）样品上样器（）：可以准确吸取0.5～10цL。

（7）紫外DNA分析仪：装有紫外光源、通过激发可清楚辨识DNA电泳图斑。 （8）其他：小型研钵，离心管，移液管、头等。 2、材料

拟研究的种群、以个体为取样单位的组织。目前一般以基因组的总DNA作为模板，由于RAPD模板需要量少，可用新鲜、冷冻、浸泡组织，甚至干制标本和化石标本中提出的微量降解DNA也能进行分析，本实验用植物叶片为材料。 3、主要试剂

-1-1

（1）CTAB提取缓冲液：2%（W/V）CTAB，1.4 mol·LNaCL，20m mol·L巯基乙醇，20

-1

mmol·LEDTA，100Tris-HCL（PH8.0）。

-1-1

（2）TE：10 mmol·L Tris-HCL（PH7.4），1mol·LEDTA。

（3）氯仿-异戊醇：24:1。

-1

（4）1.5%琼脂糖：含EB0.5цg·mL

（5）上样缓冲液：40%蔗糖+0.23%溴酚蓝。

-1-1-1

（6）其他：50mmol·LKCL，10mol·L Tris-HCL，0.1%Triton-100，2.5 mmol·LMgCL2灭菌纯水。

-1

（7）0.3цmol·L引物，1单位Taq DNA聚合酶，4 m mol·LdNTP。·

（8）电极缓冲液：Tris-硼酸-Na2EDTA缓冲液，PH8.3 （二）.方法与步骤 RAPD技术有三个步骤组成：模板DNA的制备，RAPD扩增，数据分析。 1、 1、 模板DNA的制备

目前制备基因组的总DNA的方法很多，大部分是在Saghai-Maroof等发表的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）碱裂解法的基础上作一些细节上的改进。

取1g左右新鲜叶片，置于预冷的研钵中，加入65℃预热过的0.6mLCTAB提取缓冲液进行研磨,将上述研磨液转入灭菌消毒的1.5mL离心管中,于65℃保温60min,10 000转离心1min。取上清液至另一离心管，加等体积的氯仿-异戊醇（24:1）,轻轻混匀,室温下10

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000r．min离心10min。取上清液加入等体积的预冷的丙醇，12 000r．min离心2min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀多次，待沉淀干燥后，用TE溶解沉淀，于4℃保存。

注意事项

（1） （1） 此方法的优点是步骤简单，整个过程所用时间较少，利用此方法1个人3小

时可提8-10个样品；缺点是所提DNA中杂质较多，且保存时间较短，一般20d后DNA就降解比较严重。

（2） （2） 此方法主要适用范围是植物的新鲜材料，冷冻、干制材料也可用此方法。 （3） （3） 可在TE溶解沉淀后，于96℃水浴2-3min。此步骤的目的主要是降解所提

DNA中DNA的活性，以延长DNA保存期限和提高RAPD扩增质量。

（4） （4） 提取过程中的机械力可能使大DNA断裂成小片段，所以为提高DNA的完整性，

各步骤操作均应较温和，避免剧烈震荡。

（5） （5） 所提DNA浓度可通过分光光度进行测定，具体测定方法见《生物化学实验原

理和方法》（李建武，北京大学出版社，1994）。 2、 2、 RDPA扩增

（1） （1） 扩增反应体系：采用25цL （2） （2） PCR参数：目前通用的PCR仪上的循环温度参数为：1为95℃时间120s）；2为94℃（60s）；3为36℃（60s）；4为72℃（90s）；5为GOTO2（34个循环）。12为72℃（维持600s）；13为END。

-1

（3） （3） 产物的检测：1.5%琼脂糖(含EB0.5цg．mL),每个样品中加4цL

-1

上样缓冲液(40%蔗糖+0.23溴酚蓝)上样,琼脂糖凝胶上所加电压不应超过5V．cm.电泳至胶板2/3处,停止电泳1.5h。在紫外透射仪上观察、拍像。 注意事项

（1 ）RAPD影响因素很多，DNA模板的浓度、纯度及完整性，引物的G+C含量，Tap DNA聚合酶的来源及用量，PCR反应的变性、退火、延伸温度、MgCL2的浓度对结果的影响都很大。因此，在实验以前，必须做预备实验，以求达到最佳效果。

-1-1

（2 ）在购买Tap DNA聚合酶时，会免费提供扩增液，其中含有500mmolKCL，100 mmol·L Tris-HCL，1%Ttiton-100。另外有的公司所提供方的Tap DNA聚合酶中含有MgCL2，所以在进行PCR时慎重添加相关试剂，因为增加MgCL2的含量会增加反应的特异性。

（3 ）把PCR混合物在显著低退火值（Tm）的温度下哪怕是作简短的保温，也可能产生引物二聚体和非特异性配对。通过采用热启动PCR方法可大大减少这些麻烦。其方法是在第一个

循环中温度升到超过反应物的Tm值以后才加入一两种关建成分。一般是，在95℃预变性后，紧接着设定一个60℃，在此时加入Tap DNA聚合酶，由于温度显著高于Tm值，从而减少了引物聚合体的生成。

（4）必须对引物进行筛选，选择那些扩增条带；较多且较清晰的引物，目前美国Operon公司、中国科学院遗传研究所、华美公司、上海生工都可提供大量10碱基随机引物序列，以供筛选。

（5 ） 脂琼脂糖和丙烯酰胺（PAGE）两种凝胶都适合于分离RAPD产物，但由于琼脂糖电泳比较方便，大多数研究者习惯用琼脂糖电泳。

（6 ） 每批RAPD-PCR反应都应有对照反应。其中阳性对照为：使用一已知引物，在其他条件都完全相同的情况下进行扩增，目的是检验反应所用试剂和条件是否正常。阴性对照为：将模板换成纯水，其他一切条件相同，反应结束后与正常反应一同电泳，观察有无扩增带出现，目的是检查反应液中是否具有污染的外源DNA扩增带。 3、 3、 数据分析 （1） （1） 种群Shannon多样性指数：RAPD是显性标记。凝胶上相同位置出现的同一引物扩增条带，也就是迁移率一致的条带，在遗传上认为具有同源性。按照扩增阳性［1］和扩增阴性［0］记录电泳条带，形成原始数据矩阵，根据矩阵统计RAPD扩增产物的条带总数和多态条带数，计算多态条带比率（PPB）和单位引物条带数，并计算基于各引物条带表型的Shannon多样性指数。

（2） （2） 种群内和种群间的遗传多样性比较：用相关软件进行方差分析，计算种群内、种群间的变异方差，种群间的遗传距离。

RAPD数据统计分析可以通过软件来完成。目前常用的软件及其可免费获得的网址见表11-2。这些软件具有很好的数据接口，有很好的说明文件，容易学习掌握。

表11-2 分子生态分析常用软件包 软件名称 操作平台 分析的数据对象 可免费获得的网址 TFPGA

Windows

等位酶，RAPD http：//herb.bio.edu/~miller

POPGEME Windows 等位酶，RAPD，SSR http：//www.ualberta.ca/fyeh/index.htm GDA Windows 等位酶，微卫星 http：//chee.unm.edu/gda

四、 单序列重复技术

目的和意义 单序列重复技术（single sequence repeat，SSR），又叫微卫星（microsaellite）技术，是Hearne等人于1992年发展起来的一种分子标记技术。微卫星是指整个真核生物基因组中存在的排列2-6核苷酸的短串联重复单位，它们通常连续重复多次，而且不同物种其重复序列及重复单位数都不同，通常长度能达到150bp。而在重复序列的两端往往是趋于保守的性内切酶点，因此人们便在重复序列的两端设计特殊的引物，经PCR扩增反应、聚炳烯酰胺电泳和放射自显影，得到因简单重复序列数不同而引起的扩增片段的多态性。

微卫星的应用主要取决于对研究对象基因组中微卫星座位的识别。对于已进行过基因物理图谱或基因组测序的模式生物或已进行过广泛的微卫星研究的生物，可直接从基因数据库或文献中寻找微卫星座位（例如，美国国家生物技术中心http//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。 （一）仪器、设备及材料 1.主要仪器和设备

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（1）高速离心机：转速达到12 000 r．min以上。 （2）冰箱：冷冻室低温可达-65℃以下。

（3）PCR仪：每次可上样24个以上。建议使用MJ200型、PE9700及其以上型号的PCR仪。 （4）电泳仪：可稳压、稳流。 （5）电泳槽：平板电泳槽。 （6）样品上样器（）：可以准确吸取0.5-1Цl。

（7）紫外DNA分析仪：装有紫外光源、通过激发可清楚辨识DNA电泳图斑。 （8）其他：小型研钵，离心管，移液管、头等。 2.材料

拟研究的种群、以个体为取样单位的组织。本实验用植物叶片为材料。 3.主要试剂

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（1）.CTAB提取缓冲液：2%（W/V）CTAB，1.4 mol·L NaCl，20nmol

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（2）TE：10 m mol·L Tris-HCL Tris-HCL（PH7.4），1 mol·L EDTA。 （3）氯仿-异戊醇：24:1。 （4）16%非变性聚丙烯酰胺。

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（5）上样缓冲液：40%蔗糖+0.23%溴酚蓝。 50nmol·ＬKCL,10mmol·ＬＴｒ

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ｉｓ－ＨＣＬ，０.１％Ｔｒｉｔｏｎ－１００，２．５ｍｍｏｌ·ＬＭｇＣＬ２灭菌纯水。

（6）电极缓冲液：Tris-硼酸-Na2EDTA缓冲溶液，PH8.3。

（二）方法与步骤 本方法实物流程与RAPD一样，两者最大的差异在于引物不同。 1、 1、 模板DNA的制备

取1g左右新鲜叶片，置于预冷的研钵中，加入65℃预热过的0.6mLCTAB提取缓冲液进

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行研磨,将上述研磨液转入灭菌消毒的1.5mL离心管中,于65℃保温60min,10 000 r．min离心1min。取上清液至另一离心管，加等体积的氯仿-异戊醇（24:1）,轻轻混匀,室温下10

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000 r．min离心10min。取上清液加入等体积的预冷的异丙醇，12 000 r．min离心2min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀多次，待沉淀干燥后，用溶解沉淀，于4℃保存。 2、 2、 PCR反应 （1） （1） 反应体系：目前一般扩增反应体系采用25цL。其中含有50

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mmol·LKCL，10 mmol·L Tris-HCL，0.1%Ttiton-100，2.5 mmol·LMgCL2，0.3 цmol·L

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引物，1单位Tap DNA聚合酶，0.4 mmol·LdNTP,30ngDNA模板，加灭菌纯水补足25цL。 （2） （2） PCR参数：1为95℃（60s），2为65℃（60S，-1℃/cycle），3为go to1（9次），4为95℃（60s），5为55℃，6为72℃（90s），7为go to4（24次），8为end。在Mj200型、PE9700及其以上型号的PCR仪上都可运行。 （3） （3） 产物的检测：16%非变性聚丙烯酰胺，每个样品中加4цL上样缓冲液，

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150V电压，电泳至PAGE胶板末端，停止电泳，用EB（0.5цg．mL）溶液染色30-45min，

-在紫外透射仪上观察、拍像。 3、 3、 数据分析 微卫星与等位酶相似，具有的共显性等位基因。由于微卫星是中性的且比等位酶法有更多的可检测等位基因，表现出更高的多态性。 数据分析参见RAPD部分所列出的方法。 注意事项：

1.SSR分析中的PCR参数一般采用touch-down程序，以提高扩增反应的特异性，但如所用PCR仪无此功能，可采用以下程序：1为94℃（60s），2为94℃（60S），3为60℃（120S），4为72℃（120s），5为30℃，6为72℃（300s），7为end。此过程中，退火温度较高，目的也是提高扩增的特异性。

2在扩增体系中，MgCL2不应低于2.5mmol．L。

2.目前对于扩增产物的检测，存在多种手段，有的直接利用3%的琼脂糖电泳，但由于琼脂糖分辨率所限，一般不采用此种方法；有的利用6%变性聚丙烯酰胺电泳，如果变性济的梯度平缓，这一技术足以将一个碱基对的DNA片段分开，但由于这一技术对仪器和人员的要求较高，大部分国内研究者也不利用此技术，而是采用16%非不变性聚丙烯酰胺电泳，另外电泳所用的胶板越长越好。 3.目前INTER网的发展，使得可以直接在网上方便快捷获得所需引物方面的信息，而无需自己设计。例如，进入美国国家生物技术信息中心（http：//www.ncbi.nlm.nih,gov/）主页后，先输入你所要查询物种的拉丁学名，再输入SSR，即可获得有关SSR引物方面的大量信息。

4.每批SSR-PCR反应都应有对照反应。阳性对照：用一已知引物与模板扩增结果的体系，应用同一批试剂和溶液进行扩增，目的是检验反应所用试剂和条件是否正常。阴性对照：将模板换成纯水，其他一切试剂和条件不变，反应结束后与正常反应一同电泳，观察有无扩增带出现，目的是检查反应液中是否具有污染的外源DNA扩增带。 思考题 1、 1、 如何测定不同生境植物种群遗传多样性以及种群间的遗为遗传分化程度，分析导致这种格局的原因。 2、 2、 RAPD分析揭示种群遗传多样性的原理是什么？ 3、 3、 为什么SSR可以揭示种群遗传多样性水平？ 4、 4、 种群内的遗传多样性指标和种群间的遗传多样性指标有什么区别和联系？

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