2008No116
SerialNo1193
ChinaBrewing
ResearchReport
高产纤维素酶的枯草芽孢杆菌的选育
屈二军,张红波,赵 桢,陈兰英,谷令彪
(平顶山工学院生物工程系,河南平顶山467044)
摘 要:利用紫外线诱变出发菌株S1并筛选出高产纤维素酶的菌株NS1。结果表明:诱变菌株NS1在28℃培养48h,酶活达15104U/mL,分泌的纤维素酶活力比出发菌株S1提高1151倍。关 键 词:纤维素酶;枯草芽孢杆菌;紫外线
中图分类号:Q81315 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2008)16-0038-02
ScreeningandbreedingofahighcellulaseproducingstrainBacillussubtilis
QUErjun,ZHANGHongbo,ZHAOZhen,CHENLanying,GULingbiao
(BioengineeringDepartment,PingdingshanInstituteofTechnology,Pingdingshan467044,China)
Abstract:Ultravioletray(UV)wasusedtoinducemutationonS1andanewBacillussubtilisNS1withhighyieldofcellulasehasbeenselected1Thecellu2laseyieldofNS1was1151timesthanthatofS1andtheyieldofcellulasereachedthehighestwhentheywerecultivated48hours1NS1frominducedmuta2tionhadbettercapacityofproducingcellulase,whichprovidedatheoreticbasefornaturalcellulosedecomposition1Keywords:cellulose;Bacillussubtilis;ultravioletray
纤维素是地球上最为丰富的可再生性资源,占地球生物总量的40%,它同时是植物纤维的主要成分,占其干重的30%～50%,是目前分布最广的天然碳水化合物,每年全球产量高达4000亿t。纤维素通过降解,可转化为人类急需的能源、食物、化工原料,对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义
[2]
[1]
悬液并调整其浓度约为10个/mL～10个/mL左右。
11212紫外线诱变
34
紫外灯预热10min后取15mL菌悬液在无菌培养皿中并放于离紫外灯30cm处磁力搅拌器上,诱变时间分别
0min、1min、5min、10min、15min、20min。照射处理后的菌悬
。因此利用微生物所分泌
[3][4]
液在黑暗中存放1h,后在红光下将菌液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上。
11213纤维素刚果红培养基平板筛选
的纤维素酶对纤维素降解是一条既高效又环保的途径纤维素酶广泛存在于动植物和微生物体内是不争的事实目前已分离筛选了多种产纤维素酶的微生物
[8]
[527]
。
,
,其中以真菌选取致死率为90%左右的处理中生长良好的菌株分别点种在纤维素刚果红平板上,28℃培养72h,观察测定透明圈直径的大小和菌落直径的大小。选取二者比值较大者
NS1进一步检测。11214粗酶液的制备
产纤维素酶研究居多,但鉴于细菌繁殖快,发酵周期短,有利于工业生产。此外,由于细菌所产生的纤维素酶一般最适
pH值为中性至偏碱性,因而随着中性纤维素酶和碱性纤维
素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用,细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。本研究以实验室保存的枯草芽孢杆菌S1为出发菌株,通过紫外线诱变并筛选高产纤维素酶的菌株。1材料和方法111材料
11111出发菌株和培养基
[9]
在基础产酶培养基接入NS1菌液于30℃下恒温培养。取上述培养基5g,加水50mL,于30℃保温1h,用砂芯漏斗过滤,4500r/min离心10min,提取上清液定容至100mL,得到1∶20的粗酶液。
11215葡萄糖标准曲线
葡萄糖标准曲线的绘制参照参考文献[3]进行。
11216酶活力的测定
[9]
出发菌株(S1):采用本实验室保存的枯草芽孢杆菌。同时制备牛肉高蛋白胨培养基、纤维素刚果红培养基础产酶培养基
112方法
11211菌悬液的制备
[10]
、基
μmol葡萄在一定的反应条件下,每分钟由底物生成1糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。计算公式为:
酶活力(U/mL)=[葡萄糖含量(mg)×稀释倍数×5156]/[应液
中酶液加入量(mL)×反应时间(min)]
式中:系数5156表示1mg葡萄糖的μmol数。
,DNS试剂
[11]
。
枯草芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基活化3代。取玻璃珠20～30粒放入250mL三角瓶中,加入0185%生理盐水灭菌。挑取活化的出发菌株,接入三角瓶28℃振荡1h成菌
收稿日期:2007204215
作者简介:屈二军(19752),男,讲师,研究方向为分子细胞生物学。
2结果与讨论
研究报告
211葡萄糖标准曲线
中国酿造
2008年第16期
总第193期
·39 ·
根据测得吸光度值绘制葡萄糖标准曲线(见图1)。利
用一元线性回归方程分析得到葡萄糖标准曲线回归方程为
2
y=018354x+010009;相关性R=019982。
从表2数据可知,诱变后的新菌株的酶活力彼此不同,其相对酶活力最高的为NS1,约为诱变前的1164倍。214培养时间对诱变菌株产酶量的影响
为了确定不同发酵时间对NS1产酶活性的影响,28℃条件下在不同发酵时间进行了酶活力测定。随着发酵时间的延长,酶活性呈逐渐升高趋势,48h酶活达到15104U/mL的最高点,之后开始逐渐下降(见图3)。
图1葡萄糖标准曲线
Figure11Thestandardcurveofglucose
212紫外线诱变致死率统计
随着紫外线处理时间的延长枯草芽孢杆菌的致死率逐渐升高,至10min时致死率达到90%,15min后基本无活菌,致死率与诱变时间关系见图2。
图3NS1菌株纤维素酶活和培养时间关系
Figure31Therealtionsbetweenthetimeofcultureandits
celluaseofNS1
3结论
研究以普通的枯草芽孢杆菌S1为出发菌株,经过紫外线诱变筛选出1株高产纤维素酶的菌株NS1,28℃条件下培养48h,酶活达到15104U/mL,诱变菌株NS1酶活比出发菌株S1酶活提高1151倍。参考文献:
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2003(2):192241
图2S1菌株致死率和诱变时间关系
Figure21Therelationsbetweenthetimeofinducedmuta2
tionandfatalityrateofS1
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213纤维素刚果红培养基平板初筛诱变菌种产酶活力
将出发菌株S1和诱变10min的各菌株分别点种在纤
维素刚果红平板上,初步确定各菌株是否产纤维素酶并比较其活性的大小。各菌株生长的菌落周围都具有明显的透明圈,说明都有纤维素酶产生,醋酸固定后,透明圈呈浅色,测定其透明圈直径(H)与菌落直径(C),比值结果见表2。
表2刚果红检测诱变菌株的透明圈与菌落直径及相对酶活力比较Tablet21ThestatisticsofcelluloseofinducedbacteriabyCongored菌株编号
S1(出发菌株)
S2S3NS1S5
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菌落直径(C)/透明圈直径(H)/
cm0138501345013650138401361
cm0150301505017080182501615
相对酶活大小
H/C1130611464119392114811704
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