第４３卷第２期 ２０１２年２月 东北农业大学学报 ４３（２）：８３￣８７ Ｆｅｂ．２０１２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 低温兼性厌氧纤维素降解茵系的选育 杜俊杰，徐凤花 ，赵忠宝，谢晶钧 （东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨１５００３０） 摘要：经过２５代限制性继代培养，选育出一组稳定的低温兼性厌氧纤维素降解菌系（ｘ１），其优势茵群为 短杆菌。ｘ１最适生长温度为２０℃，适宜生长溶氧量（ＤＯ）范围为０．０４—０．０９ ｍｇ・Ｌ～，在合０．２％稻秸的改良ＰＣＳ培养 液中静置培养７ ｄ，Ｃ 酶（内切葡聚糖酶）、Ｃ。酶（外切葡聚糖酶）、／３－葡聚糖苷酶活分别为１８．７、５４－３、１７．８ ｕ・ ｍＬ～；稻秸、玉米秸、滤纸降解率分别为５５．３％、６４．６％、９４Ｉ３％；稻秸降解液主要产物为乙酸、丙酸、丁酸，其 含量分别为０．６５６、０．１６８、０．１２８ ｇ・Ｌ～。 关键词：低温茵系；纤维素酶；降解率；代谢产物 中图分类号：Ｑ９３．３３ｌ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５—９３６９（２０１２）０２—００８３—０５ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｃｏｌｄ－ａｃｔｉｖｅ ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ／Ｄｕ Ｊｕｎｊｉｅ，ＸＵ Ｆｅｎｇｈｕａ，ＺＨＡＯ Ｚｈｏｎｇｂａｏ，ＸｌＥ Ｊｉｎｇｊｕｎ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏａｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １ ５００３０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ．ａ ｃｏｌｄ．ａｃｔｉｖｅ ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｎａｍｅｄ Ｘｌ ｗａｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ， ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｕｍ ｇｒｏｗｔｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２０。Ｃ．Ｗｈｅｎ Ｘｌ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＳ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ０＿２％ｒｉｃｅ ｓｔｒａｗ ｔｈａｔ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｎｌｙ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ，ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃ Ｃ１ ａｎｄ￣－ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｗｅｒｅ １ ８－７。５４．３ ａｎｄ １ ７．８ Ｕ・ｍＬ’。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｔｒａｗ，ｃｏｍ ｓｔａｌｋｓ ａｎｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ｗｅｒｅ ５５．３％，６４．６％ａｎｄ ９４．３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ（ＶＦＡ）， ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ０．６５６，０．１ ６８ ａｎｄ ０．１ ２８ ｇ・ 。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｌｄ－ａｃｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ；ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ；ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ 植物纤维素是一种巨大的可再生天然有机资 源，通过生物技术可将其转化为乙酸，乙醇和清 洁能源气体，对于解决能源危机和环境污染问题 具有重大意义。 微生物降解纤维物质是在ｃ 、Ｃ。、／３一葡聚糖苷 效而稳定的纤维素分解混合菌群 １，曾胤新等从北 极楚科奇海分离得到最适生长温度为ｌ０℃，产纤 维素酶的低温菌 。本文从黑龙江北部山区枯树腐 木和低温堆肥样品中，通过限制性继代培养选育到 菌系（ｘ１），对其菌群组成，纤维素的降解能力以 及产物进行研究。 酶三大主要纤维素酶系协同作用下进行，但很多 菌株不能产全组分的纤维素酶，所以纯培养的微 生物难以有效降解天然纤维素物质，而稳定的纤 １ 材料与方法 １．１材料 维素降解菌系是解决此问题的有效途径ｕ 。近年 来，许多学者在微生物降解纤维素方面做了深入 研究 叫，崔宗均等筛选得到在５０℃培养条件下高 收稿日期：２０１１－０４—２６ 样品来源：黑龙江北部山区枯树中心腐木和低 温堆肥样品。 基金项目：国家８６３计划（２０ｏ７ＡＡ１０ｏ７０５）；哈尔滨市科技攻关项目（２０１０ＡＡ６ＣＮ０６７） 作者简介：杜俊杰（１９８５一），男，硕士研究生，研究方向为生物质转化与利用。Ｅ－ｍａｉｈ ｊｕｎｊｉｅ２００８５６７＠１２６．ｃｏｒｎ ｛通讯作者：徐凤花，教授，研究方向为应用微生物。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｆｈ００００１＠１２６．ｃｏｍ ・８４・ 东北农业大学学报 第４３卷 土壤浸汁 ：土壤与去离子水以质量比１：ｌ搅 测定上清液Ｃ 酶，Ｃ。酶和 葡萄糖苷酶的活性。酶 活单位（Ｕ）定义为：４０℃反应条件下，１ ｍｉｎ内水 解底物产生１ ｍｍｏｌ还原糖（以葡萄糖计）所需的酶 量。 拌混合，过滤，灭菌后备用。 １．２培养基 筛选培养液Ｈ ：蛋白胨５ ｇ，酵母粉１ ｇ，ＮａＣ１ ５ ｇ，ＣａＣＯ，２ ｇ，碎稻秸２ ｇ，微量元素液０．５ ｍＬ， 土壤浸汁１００ ｍＬ，蒸馏水９００ ｍＬ，ｐＨ ７．０。 ＯＤ值测定：北京普析Ｔ６新世纪紫外可见光分 光光度计。 １．３．７测定培养液中有机酸含量 挥发性脂肪酸（ＶＦＡ）测定：以接菌７ ｄ的培养 微量元素溶液成分（ｇ・ ）：ＺｎＳＯ ０．２９，ＣａＣ１： ０．２４，ＣｕＳＯ４０．２５，ＭｇＳＯ４０．１７。 １．３试验方法 １．３．１茵系筛选 培养瓶：容积３００ ｍＬ的葡萄糖注射瓶 将１０ ｇ样品（或５％菌液）接种到装有滤纸条的 ２００ ｍＬ筛选培养液中，密闭封口，２０℃培养箱中 静置培养，当滤纸开始崩解时，再按５％的接种量 传代，如此进行继代培养，每代培养７ ｄ时测定稻 秸降解率。 如无特殊说明，本研究的培养方式均为２０℃ 静置密闭培养。 １．３．２茵系和稻秸纤维组织观察 稻秸微观形态的观察：将ｘｌ以５％接种于筛选 培养液（稻秸未经粉碎），同时以未接菌的培养液 作为对照，培养５ ｄ，在扫描电子显微镜（ｓＥＭ）下 观察稻秸组织变化。 菌系的观察：使用生物显微镜观察菌液。 １－３．３纤维素降解率的测定：失重法『２１ 按１．３．１的方法得到的培养液，５ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离 心，弃上清液，用盐酸和硝酸的混合液冲洗消除 菌体，离心，清水洗，离心，１０５ ｏＣ烘干至恒重， 计算失重率。 １．３．４培养温度对稻秸降解率的影响 将ｘｌ接种于筛选培养液，分别于Ｏ、５、ｌＯ、 ｌ５、２０、２５、３０℃培养７ ｄ，不同温度做３个平 行，测定稻秸降解率，取平均值作为该处理的结 果。 １．３．５溶氧量（ＤＯ）对稻秸降解率的影响 调整培养液的液面高度分别处于２、４、６、 ８、１０ ｅｍ，培养７ ｄ，不同深度做三个平行，测定 稻秸降解率，取平均值作为该处理的结果。 ＤＯ值的测定：ＰＢＪ一６０８型便携式溶解氧分析 仪。 １．３．６纤维素酶活力测定 培养液经５ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ，ＤＮＳ法 ｌ 液为样品。 设备及参数：ＧＣ一２０１０，色谱柱：ＡＴ．ＦＦＡＰ （３０ ｍｘ０．３２ ｍｍｘ０．５ ｍ），ＦＩＤ检测器。检测条件： 柱温１５０℃，检测器温度２３０ ｏＣ；升温程序：初始 温度ｌｌ０℃，以１０￣Ｃ／ｍｉｎ升至１５０℃，保持５ ｍｉｎ。进样口温度２００℃，载气为高纯氮气，分流 比４０：１。 样品预处理：样品经３ ５００ ｒ・ｍｉｎ‘。离心ｌ５ ｍｉｎ，再取上清液ｌ ｍｌ于１．５ ｍＬ离心管中，加人 ０．２ ｍＬ ２５％偏磷酸溶液（按照５：ｌ比例），用涡旋振 荡器混合均匀，再经１０ ０００ ｒ・ｍｉｎ－。离心１５ ｍｉｎ，上 清液用０．２２ Ｉｚｍ水系滤膜过滤，滤液用微量进样器 取１ 上机分析。 ２结果与分析 ２．１茵系的选育 采用１．３．１的方法，从朽木和低温堆肥样品分 别得到培养物Ａ和Ｂ，两者混合得到ｃ，培养７ ｄ后 其稻秸降解率分别为４０．６％、４５．３％、５６．５％，Ｃ培 养物的稻秸降解率明显高于Ａ和Ｂ，说明来源不同 的培养物中的菌群具有互补性和协同性。将３种培 养物分别继代培养，其稻秸降解率见表１，３种培 养物在最初２￣４代，新鲜培养基的加入使菌量增 加，稻秸降解率提高；传到８～ｌ０代，随着原生境 营养基质的消耗，一些菌的生长因缺少某些微量 成分受到抑制，导致稻秸降解率下降。１２代之 后，菌群逐渐适应新环境，稻秸降解率趋于稳定。 经过２５代，３种培养物的稻秸降解率达到稳 定，ｃ培养物降解率最高，编号ｘｌ，培养７ ｄ，稻 秸降解率为５５．３％，Ｃ 酶、Ｃ．酶、 葡聚糖苷酶活 性分别为ｌ８．７、５４．３、ｌ７．８ Ｕ・ｍＬ－ 。 通过显微观察，结果显示（见图ｌ，２）：菌系 中优势菌群为短杆菌，其长度为２～３ ｍ，宽度约 为０．６５ Ｉｘｍ。 东北农业大学学报 第４３卷 ２．２．３培养温度对稻秸降解率的影响 结果见图４。 温度不超过２Ｏ ，最适宜温度在ｌ５℃，在０℃可 生长繁殖的微生物，称之为嗜冷菌（Ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅｓ）。 ２Ｏ℃培养时稻秸降解率最高。由图４可以看 出，经过长期选育，菌系最适生长温度为２０ ｏＣ； 一 一瓣琏世 ０ ｏＣ时，菌系仍具有８．６％的稻秸降解率。低温微生 ∞ －盛０口∞ｐＢ ∞盘 另一类是最高生长温度高于２Ｏ℃，最适温度高于 １５ ｃｃ，在０ ５℃可生长繁殖的微生物，称之为耐冷 菌（Ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈｓ）。ｘｌ作为整体研究对象，属于耐 冷菌系。 物分两类［１２－１４ 。一类是生活在低温下且其最高生长 培养温度（ｏＣ） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ 图４不同培养温度下的稻秸降解率 Ｆｉｇ．４ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｔｒａｗ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ 葛 ２．２．４溶氧量（ＤＯ）对稻秸降解率的影响 一 １５０ 培养液的ＤＯ值直接影响微生物的酶活性和代 谢途径，试验通过不同ＤＯ值条件下稻秸降解率的 变化研究ｘｌ的最适溶氧量范围。 从图５、６可以看出，液面高度为８ ｃｍ时，稻 秸降解率最高。与液面高度８ ｃｍ相比，６和１０ ｃｍ 的相对降解率也都超过９０％；２、４、６、８和１０ ｅｍ 的ＤＯ值分别为０．２１、０．１４、０．０９、０．０６和０．０４ ｍｇ・ 。可见，Ｘｌ菌液的适宜溶氧量范围是０．ｏ４— ０．０９ ｍｇ・Ｌ～，复合系在低溶氧量的环境中具有较 好的稻秸降解效果。复合菌系中，氧需求量不同 的各菌种通过共养互栖作用协同创造有利的生 长、繁殖环境，维持菌系的稳定性和降解稻秸的 高效性。 ２．３稻秸降解液中ＶＦＡ的测定 通过气相色谱检测培养液获得了如图７的色谱 图。 通过与标准品色谱图比对，保留时间２．９５０、 ３．２００和３．５６０ ｍｉｎ处峰分别为乙酸、丙酸和丁酸， 其含量分别为０．６５６、０．１６８和０．１２８ ｇ・Ｌ～。可见， ｘ１在具有很强纤维素降解能力的同时，还将稻秸 转化为产甲烷菌群中产甲烷菌和产氢产乙酸菌的 营养物质。三种有机酸在沼气反应系统中的转化 速度依次为：乙酸＞丁酸＞丙酸” ，培养液中乙酸和 丁酸的质量浓度之和占总ＶＦＡ的８２．３％，乙酸的质 图５溶氧量对不同培养深度处理降解率的影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅｏｎＤＯ 量浓度占６８．９％，菌系ｘ１适宜应用于含秸秆原料 的低温沼气发酵。 第２期 杜俊杰等：低温兼性厌氧纤维素降解菌系的选育 ・８７・ 》 ｉ 暑喹 ０葛量星Ｉｌ 西砖０ 时间（ｍｉｎ）Ｔｉｍｅ 图７第７天培养液的气谱检测色谱 Ｆｉｇ．７ ＧＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ａｔ ｔｈｅ ７ｔｈ ｄａｙ ３讨论与结论 ａ．本研究针对我国北方寒区的秸秆大面积堆弃 ４．【 问题，为加快秸秆合理处置和资源化而提出。笔者 Ｊ 】 生长特性及酶学性质［Ｊ】＿高技术通讯，２００５，１５（４）：５８－６２． 费辉盈，常志州，王世梅，等．常温纤维素降解菌群的筛选及其 特性初探【Ｊ】．生态与农村环境学报，２００７，２３（３）：６０－６４． ［ 罗辉，仇天雷，马诗淳，等．一株中温厌氧纤维素降解细菌的分 【 卜 ＿【 ８ 【 【 ． ［ 】 】 】 】 Ｉ 】¨ 【 选育出一组最适生长温度为２Ｏ℃，０ ｃｃ仍具降解稻 秸能力的低温耐冷菌系ｘ１，而且其稻秸降解液的 有机酸组分可以在沼气发酵中为产甲烷提供前体物 质。因此，菌系ｘ１不仅为利用生物技术解决寒区 秸秆堆积问题提供菌种资源，而且可以应用于低温 沼气发酵，具有重大的研究价值。 ｂ．利用自然界微生物之间的协同作用关系，从 离、鉴定及其系统发育分析［Ｊ】．中国沼气，２００８，２６（３）：３－８． Ｓｏｕｉｃｈｉｒｏ Ｋａｔｏ，Ｓｈｉｎ Ｈａｒｕｔａ，ＣＵＩ Ｚｏｎ￣ｕｎ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕ－ ｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｍｉｘｅｄ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ａ ｃｅｌｌｕ— ｌｏｌｙｔｉｃ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｎｄ ａｅｒｏｂｉｃ ｎｏｎ－ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００４，５１（１）：１３３—１４２． 张丹，许景钢，路伟明，等．低温降解纤维素的细菌的筛选及鉴 定Ｕ１．东北农业大学学报，２００８，３９（１）：５５—５７． 杜然，李十中，章晓庆，等．兼性厌氧复合菌群Ｈ纤维素降解和 产乙醇能力及生态组成初探［Ｊ】．生物工程学报，２０１０，２６（７】： ９６０－９６５． 黑龙江北部山区枯树腐木和低温堆肥样品中取样， 以０．２％稻秸为碳源选育得到复合菌系ｘｌ，２０℃静 置密闭培养７ ｄ，Ｃ 酶（内切葡聚糖酶）、Ｃ 酶（外切 葡聚糖酶）、 一葡聚糖苷酶活分别为１８．７、５４．３、 ｌ７．８ Ｕ・ｍＬ～，稻秸降解率达到５５－３％。可见，菌系 何特，李妮，黄小菲，等，青藏高原高寒湿地产纤维素酶菌株的 分离、鉴定和产酶的初步研究ｌＪ］．中国农业科技导报，２００９， １ １（４）：ｌ１２一ｌｌ７． ｘｌ产酶全面、酶活高，降解稻秸能力强，弥补了 单菌株或少数单菌株组合的降解能力不足的缺陷。 Ｃ．目前，国内外关于低温纤维素降解菌研究主 要集中在单菌株的分离筛选、鉴定，文献报道的能 降解纤维素的细菌多属于交替假单胞菌（Ｐｓｅｕ— ｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）“ ，对低温纤维素降解菌系的研究报 道较少。本研究通过显微观察，了解到菌系Ｘｌ的 张龙翔，张庭芳，李令嫒．生化实验方法和技术【Ｍ】．２版．北京： 高等教育出版社，１９９７：１－３． 刘爽，李文哲，王春影，等．高效木质纤维素分解复合菌系降解 稻草特性的研究Ｕ】．环境工程学报，２０１０，４（３）：７００—７０４． Ｍｏｒｉｔａ Ｒ Ｙ．Ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ，１９７５，３９： １４４—１６７． 优势菌群是短杆菌，但其菌种分类和菌群间的协同 作用机理还有待于进一步研究。 【参考文献】 辛明秀，周培瑾．低温微生物研究进展ｌＪ】．微生物学报，１９９８， ３８（５）：４００－－４０３． Ｍａｖｒｏｍａｔｉｓ Ｋ，Ｔｓｉｇｏｓ Ｉ，Ｔｚａｎｏｄａ ｓｋａｌａｋｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａ ｇｌｙｃｉｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｃｏｌｄ ａｄａｐｔｍｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐ— ｈａｔａｓｅ［Ｊ］．ＦＥＢＳ，２００２，２６９：２３３０－２３３５． 【１】王佳婧，刘晓风，袁月祥，等．厌氧纤维素降解产氢复合菌系Ｌ－３ 研究【Ｊ】．应用与环境生物学报，２０１０，ｌ６（１）：１０４—１０８． 任南琪，刘敏，王爱杰，等．两相厌氧系统中产甲烷相有机酸转 化规律ｆＪ】．环境科学，２００３，２４（４）：８９－９３． 董硕，迟乃玉，王鑫，等．低温纤维素酶的研究进展【ｊ】．生物技 术通报，２０１ ｌ（２）：３７—４１． 【２】崔宗均，李美丹，朴哲，等．一组高效稳定纤维素分解菌复合系 ＭＣＩ的筛选及功能［Ｊ］．环境科学，２００２，２３（３）：３６—３９． 【３】曾胤新，俞勇，陈波，等．低温纤维素酶产生菌的筛选、鉴定、
