双泵高效液相色谱仪标准操作规程

一、 实验原理

根据高效亲和色谱的原理，在PH为6.5的磷酸盐缓冲液条件下免疫球蛋白IgG与配基连接，在PH2.5的盐酸-甘氨酸缓冲液条件下洗脱免疫球蛋白IgG。 二、 相关设备和试剂 2.1实验室常用仪器设备。 超纯水装置 匀浆机

高效液相色谱仪 2.2相关试剂

2.2.1除非另有说明，在分析中使用的试剂皆为分析纯，水为去离子水或相当纯度的水，应符合GB/T 6682 二级用水的规定。 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾

流动相A：PH6.5,0.05mol/L磷酸盐缓冲液。 流动相B：PH2.5,0.05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液。 2.2.2IgG工作标准溶液：

称取IgG标准品0.0100g,用流动相A溶解并定容到10mL，摇匀，浓度为1mg/mL，然后稀释成含IgG0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mg/mL的标准系列。临用时配置。 三、 操作步骤 3.1、 开机

3.1.1打开双泵、检测器的开关。

3.1.2打开电脑，检测器自检后，双击桌面上“伍丰液相”图标，进入色谱数据采集程序。 3.2数据采集参数设置

3.2.1 单击工具条按钮，进入数据采集参数设置对话框

3.2.2 输入采集的自动停止时间30min，各项屏显参数，数据采集的文件名称，采集文件自动保存路径。

3.3、泵及检测器参数设定

3.3.1 泵流量控制 在泵控制界面上输入流量、流动相比例，以及相应程序，按“设置”键确定。

时间/min 0 4.5 5.5 15.0 18.5 26.0

流速/(mL/min) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 流动相A/％ 100 100 0 0 100 100 流动相/B％ 0 0 100 100 0 0 3.3.2 紫外检测器参数设置 在“波长设置”框中输入所需波长280nm，按“设置”键确定。

3.4、数据采集

3.4.1 点“泵启动”，启动泵。

3.4.2 基线平稳后方可进样，进样量为20uL。

3.4.3 用待测溶液洗针3次，然后再吸取待测溶液，将进样阀向上旋转至“load”位，进样后向下旋转至“inject”，仪器开始自动采集数据。进样完成后，用甲醇洗针3次。

3.5、关机

3.5.1 用甲醇冲洗进样阀。

3.5.2 先用水相：有机相=20：80的流动相比例冲洗管路10min，然后再用100%的有机相冲洗管路10min。

3.5.3 关闭色谱数据采集程序，关闭电脑。 3.5.4 关闭检测器、泵、柱温箱。