酿酒酵母分离纯化的实验设计

一、实验目的

1、学习并掌握酿酒酵母的分离纯化技术； 2、复习血清记数法和培养基的配制操作； 3、巩固显微镜的使用。

二、基本原理

酵母菌是一类单细胞真菌，一般成圆形，椭圆形和圆柱形。无性繁殖以芽殖为主，也有少数是裂殖，有些酵母菌能产生子囊孢子，有的酵母菌能形成假菌丝。酵母菌的菌落近似细菌的菌落。但较大且厚，多呈白色。酵母菌在液体中生长可形成菌膜，菌环，沉淀和混浊，酵母菌的细胞结构较完整即有壁、膜、质、核等结构。酵母菌的细胞形态、繁殖方式和培养特征均为菌种鉴定的依据。

分离纯化即从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。平板分离的方法主要有平板划线分离法和稀释涂布平板法，后者除能有效分离纯化微生物外，还可以用于测定样品中活菌数量。另外还有混菌法分离。

平板菌落记数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中的细胞密度。由于待测杨平往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是耽搁细胞生长繁殖而成，有的可能来自2个或多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。

显微计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定的容积的载玻片上，于显微镜下直接观察、计数的方法。本实验用血细胞计数板进行计数。血细胞计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一横槽隔成两半，每边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。每一个大方格都有400个小方格。每一个大方格边长1mm，则每一个大方格的面积1mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度0.1mm,所以计数室的容积为0.1mm3。计数时，通常数5个中格的总菌数，然后求得每个中格的平均值，再根据下式计算：

1mL菌液中的总菌数=A/5*25*104*B

(A为5个中格的总菌数，B为菌液稀释倍数)

三、实验准备

仪器：无菌试管（根据稀释倍数暂定大试管7个、用作斜面的小试管3个）、无菌培养皿6个、无菌涂布器3个、无菌移液管1ml的7个，接种环、带玻珠的无菌三角瓶、酒精灯、血细胞计数板、盖玻片、显微镜。

制备培养基：用现成的麦芽汁琼脂培养基粉调制。

灭菌：需要干热灭菌的有试管、培养皿、涂布器、移液管、三角瓶；待干热灭菌完了将大试管各装9ml蒸馏水，小试管装3到4ml麦芽汁琼脂培养基，三角瓶内装适量蒸馏水（刚淹没玻珠即可），然后再将它们进行湿热灭菌；湿热灭菌后小试管摆斜面冷凝。

四、实验步骤

1、挑取几环菌种接到无菌三角瓶内，振摇20min，使菌充分混合，全为单细胞存在，无抱团现象。然后用血细胞计数板进行计数，需要稀释到1mL200至300个左右。用无菌移液管吸取1mL菌液到一支盛有9mL无菌水的大试管中，制成10-1稀释液，以此类推，稀释到合适的倍数，做好标记。

2、将6个培养皿分别标号三个浓度个两个，一个涂布，一个混菌。 3、涂布法：将麦芽汁琼脂培养基熔化，将三个不同浓度的培养皿各倒一个平板，待其冷凝后，用移液管吸取0.!或0.2mL对应菌液至平板，用涂布器在培养基表面轻轻涂匀，室温下静置5~10min。 4、混菌法：在剩下的培养皿移放0.1或0.2mL对应菌液，将熔化的麦芽汁琼脂培养基冷却到45度左右，然后倒适量在培养皿内，立即摇匀，静置冷凝。

5、将上述6个培养皿倒置于28度培养两天。

6、观察菌落，挑取酿酒酵母菌在斜面上进行接种，然后置于28度培养两天。

7、观察斜面上的菌落，可以进行镜检，然后进行性能指标的测定，如：酒精产量，发酵力，活化性能等等。