鸡毒支原体灭活疫苗抗原制备工艺的优化研究

鸡毒支原体灭活疫苗抗原制备工艺

的优化研究

赵玉龙1，刘业兵2，石勇1，焦玉兰1，朱秀同1，

刘涛1，张新新1，尤永君1，赵丽霞1

（1.瑞普（保定）生物药业有限公司，河北保定

摘

071000；2.中国兽医药品监察所，北京100081）

应用其培养的菌液浓度达到1×1011CCU/mL，要：研发出一种鸡毒支原体培养基，远高于目前常用培养基的培养

按照2次10×浓缩-稀释方法，菌液浓度；使用300KD膜包处理15000mL菌液，最终将纯化前蛋白浓度11307.3μg/mL降低到2867.1μg/mL，杂蛋白去除率73.6%；同时将纯化和未纯化菌液制成灭活疫苗免疫SPF鸡，结果未纯化组发生应激反应，而纯化组未见异常，且免疫后3周抗体水平高于未纯化组。本研究解决了鸡毒支原体灭活疫苗制备中培养菌液滴度低，成本高的难题。

关键词：鸡毒支原体；鸡毒支原体培养基；抗原；纯化DOI:10援3969/J.ISSN援1671-6027援2018援03.013

鸡毒支原体病是由鸡毒支原体（MG）引起鸡的一种慢性呼吸道病（CRD）。临床上主要表现为咳嗽、流鼻涕、呼吸时发出罗音等症状，感染鸡群的免疫力受到抑制，引起肉鸡的体重减轻和蛋鸡的产蛋率降低，是危害养鸡业的重要疾病之一。目前对支原体感染的防治主要在于药物治疗、疫苗预防及健康畜群的建立，有效的疫苗免疫是防控该病的重要手段。主要应用改良Frey氏培养目前鸡毒支原体疫苗生产中，

（半成品）基或其它支原体培养基，所培养的鸡毒支原体菌液的浓度一般达到1×108CCU/mL左右，需对半成品进行一定浓缩后方可制备成品疫苗。本研究使用自行改良的鸡毒支原体培养基，提高培养菌液浓度到1×1011CCU/mL；同时使用300KD膜包对菌液进行超滤纯化，去除菌液中杂蛋白含量，降低灭活疫苗发生副反应的概率，提高免疫效果。1材

料

11

在实验室分别应用改良Frey氏培养基和公司改良培养基，同时接种鸡毒支原体CR株菌液进行增殖，培养体系3000mL，按照10%接菌量进行传代培养3代，记录每代生长时间和测定的菌液CCU值。CCU测定方法按照中国兽药典的方法进行。

取15000mL鸡毒支原体培养菌液，使用300KD膜包

（5块）先进行第一次10×浓缩至1500mL，补充无菌生理盐水至原体积15000mL；再进行10×浓缩至1500mL，补充无菌生理盐水至原体积15000mL，重复浓缩洗涤3次；收集每次纯化前、10×浓缩渗出液、10×浓缩液和10×浓缩稀释液进行蛋白含量测定和CCU测定。

同时将纯化和未纯化的鸡毒支原体（菌液浓度均为1×10CCU/mL）灭活后，按照水油比1：2分别制苗，制备的疫苗免疫3~4周龄SPF鸡，免疫后第3周采血分离血清进行ELISA抗体检测，评价免疫效果。3结

果

改良Frey氏培养基按照中国兽药典的方法进行配制；

公司改良的鸡毒支原体培养基按照专利配方进行配制，培养酵母浸出物、精氨基主要成份PPLO肉汤、葡萄糖、猪血清、酸等。

鸡毒支原体CR株，由中国兽医药品监察所提供。Lowry法蛋白含量检测试剂盒购自Thermo公司；鸡毒支原体ELISA抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；300KD膜包（5块）购自Millipore公司。2方

法

使用Frey改良培养基最终培养产物CCU值达1×108；使用公司改良培养基最终培养产物CCU值达到1×1011，且

见公司改良培养基增殖速度快于Flury改良培养基3h以上，表1。

以标准品蛋白浓度为纵坐标（μg/mL）、以吸光度OD750值为横坐标做标准曲线，见图1，标准曲线R2值0.9997，符合统计学要求。

基金项目：河北省科技计划项目：鸡毒支原体疫苗产业化关键技术研究与应用

作者简介：赵玉龙，硕士，兽医师，主要从事兽用生物制品方面研究。

通过标准曲线和待检样品的OD值，计算待检样品总蛋白浓度，同时按照CCU测定方法判定样品CCU结果，纯化过程样品总蛋白浓度和CCU测定结果见表2。

鸡毒支原体纯化前CCU值为1×1011，3次10×浓缩液

畜牧兽医科技信息2018年第3期

21

试验研究

表1

两种培养基培养效果对比

目前常用培养基生产的菌液抗原含量不高，菌液浓度低于1×109CCU/mL，需要进行一定倍数的浓缩。我们根据鸡毒支原体调整现有培养基的成份和含量，生长特点，

研发出一种改良的鸡毒支原体培养基，实

验室培养菌液浓度达到1×1011CCU/mL，

显著提升产品质量，降低疫苗生产成本。

表3疫苗免疫后3周ELISA抗体S/P值检测结果

图1标准品OD750值与蛋白浓度标准曲线

CCU值均为1×1012，3次10×浓缩稀释液CCU值均为1×1011，3次10×浓缩渗出液CCU值均为0，表明使用300KD膜包经过3次10×浓缩后，鸡毒支原体未见损失。因此判定鸡毒支原体不能通过300KD的膜包滤膜，且在本方法浓缩过程中，鸡毒支原体抗原含量未发生变化。

鸡毒支原体纯化前蛋白浓度为11307.3μg/mL，使用300KD膜包经过一次10×浓缩稀释，蛋白浓度达到

杂蛋白去除率为46.4%；6056.4μg/mL，经过2次10×浓缩稀释，蛋白浓度达到2984.7μg/mL，杂蛋白去除率为73.6%；经过3次10×浓缩稀释，蛋白浓度达到2608.3μg/mL，杂蛋白去除率为76.9%。第2次与第3次杂蛋白去除率相差不大，考虑时间因素确定纯化2次综合效果要好。

未纯化（总蛋白含量11307.3μg/mL）与纯化2次的鸡毒支原体（总蛋白含量2608.3μg/mL）制苗后免疫SPF鸡，未纯纯化组化组免疫后第2~3天部分鸡只精神沉郁、采食下降，

免疫后精神状态良好未见异常；免疫后3周采血检测ELISA抗体水平，纯化组与未纯化组所有血清样品S/P值均大于试剂盒阳性临界值0.5，全部转阳，但是纯化组抗体水平（S/P值）明显高于未纯化组。ELISA抗体检测结果见表3。4讨

论

鸡毒支原体的生长条件较细菌苛刻，营养要求也较高，

表2

超滤是借助于超滤膜或其他超滤装置对生物大分子物质进行分离、纯化及浓缩的一种技术，该工艺已用于流感疫苗、口蹄疫、狂犬病毒疫苗等疫苗的纯化和浓缩，并取得了良好抗原浓缩效果和杂蛋白去除效果。本研究采用300KD膜

包、2次10×浓缩-稀释的方法对鸡毒支原体培养菌液进行纯化，渗出液CCU测定为0、纯化前后CCU值均为1×1011CCU/mL，鸡毒支原体在纯化过程无渗漏，杂蛋白去除率达73.6%，提高了抗原的纯度，更高效率的纯化方法还需进一步优化试验条件。

由于鸡毒支原体生长条件苛刻，需要添加高浓度血清和多种营养物质，因此制备的疫苗容易引起免疫动物的过敏反应。通过对比纯化和未纯化的抗原制备的疫苗，未纯化组鸡发生应激，而纯化组未见异常，且免疫后3周纯化组抗体水平较高，推测是高纯度的抗原有利于机体产生特异性抗体。本研究解决了鸡毒支原体灭活疫苗抗原培养菌液滴度低，成本高的难题，从鸡毒支原体抗原生产的培养基和浓缩纯化方法两方面为后续研究提供了一定思路和方法。

纯化过程样品总蛋白浓度和CCU测定结果

22

2018年第3期畜牧兽医科技信息试验研究

种猪场伪狂犬病净化技术探讨与应用

朱

雁1，李长彬1，林成1，陈燕眉1，陈绵旭1，王冰1，张

杜明喜1，王培永1，尤笠羽2，陈文静2，王红梅3

3.江苏省徐州六马种猪科技有限公司，江苏徐州

摘

221007）

萍1，

（1.江苏省徐州市铜山区畜牧兽医站，江苏徐州221007；2.徐州市铜山区农业委员会，江苏徐州221007；

通过开展对种公猪、生产母猪、后备种猪、要院选择徐州六马种猪科技有限公司种猪场作为伪狂犬病净化创建场，

待售种猪伪狂犬病野毒感染抗体（gE抗体）和疫苗免疫抗体（gB抗体）检测，进行猪伪狂犬病野毒感染情况的本底调查，了解各阶段猪群健康状态、免疫情况、免疫抗体水平和野毒感染状况。根据猪伪狂犬病毒野毒感染状况，采用不同的净化方案，进行猪伪狂犬病净化。通过净化，该场种公猪、生产母猪、后备种猪及待售种猪连续2次以上抽检结果均为伪狂犬病gE抗体阴性且gB抗体合格率70%以上，达到猪伪狂犬病净化创建场标准；同时，猪群的健康状况、母猪生产性能和仔猪成活率均有明显提高，为今后猪场伪狂犬病净化工作的开展提供技术参考。淘汰；免疫；净化；关键词：猪伪狂犬病；野毒感染；检测；gE抗体；gB抗体DOI:10援3969/J.ISSN援1671-6027援2018援03.014猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的猪的急性传染病，可造成妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪出现昏睡、鸣叫、呕吐、腹泻、神经症状以及大量死亡，病猪呼吸困难、生长停滞。伪狂犬病对母猪、仔猪以及猪场生产的危害都相当严重。为推进动物疫病综合防控，促进畜牧业健康发展和畜产品有效供给，根据《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》精神，结合《江苏省规模化猪场猪伪狂犬病净化工作意见》（苏农牧[2015]35号）等文件要求，徐州六马种猪科技有限公司种猪场率先开展了猪伪狂犬病疫苗免疫及净化创建工作，并取得了满意效果。1材料与方法1.1.11.1.2

猪伪狂犬病疫苗检测试剂及检测

（K-61株）猪伪狂犬活疫苗，gE基试验按照《伪狂犬病诊断技术》

1.2.1

2014年6月开始，通过生产性能分析、临床症状观察

及猪伪狂犬病野毒感染抗体（gE抗体）和疫苗免疫抗体（gB后备种猪、待售种猪伪狂抗体）检测，进行种公猪、生产母猪、犬病野毒感染情况的本底调查，了解各阶段猪群健康状态、评估伪狂犬病发生和免疫情况、免疫抗体水平和感染状况，后备猪全群传播风险。按照生产母猪群数量的10%、种公猪、连续抽检采样、待售种猪10%的比例抽检，每季度抽检一次，3次。1.2.2

采取不同的净化方案。根据针对不同野毒感染状况，

高风险群猪伪狂犬病毒野毒感染状况,将猪群分为：（野毒感染率≥10%）、中风险群（野毒感染率在1%~10%）和低风险群（野毒感染率≤1%）。如果连续3次抽检结果全部为gE抗体阴性，则将该猪群作为伪狂犬病野毒感染阴性群，直接进入免疫维持阶段。

基金项目：江苏省三新工程项目SXGC[2017]035

参考文献

等.F株鸡毒支原体疫苗对肉鸡生产性能的影响[J].中国[1]刘军军，

生物制品学杂志，2014,27(1):13~18.

[2]陆凤.鸡毒支原体、滑液支原体二联灭活苗的研究[D].甘肃农业大学，2015.

[3]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典,2015年版3部[M].北京:中国农业出版社,2015,附录22-23.

(单)通道移液器等。1.1.3

净化创建猪场的选择

徐州六马种猪科技有限公司

种猪场主要饲养长白、大白和杜洛克祖代原种猪，并常年对外提供优质种猪，目前有祖代原种公猪37头，生产母猪608头，后备种猪79头；待售种猪2366头，年可提供优质种猪4200余头。

批号：从2014年至今多个批次。因缺失，勃林格生产，（GB/T1864-2002）中规定的ELISA试验方法进行。猪伪狂犬（IDEXX）从2014年至今病gB病毒抗体检测试剂盒，批号：（IDEXX）批多个批次；猪伪狂犬病gE病毒抗体检测试剂盒，号：从2014年至今多个批次。1.1.3

监测设备

上海科华KHBST-360酶标仪和IKA多

1.2.2.1暂对高风险群（野毒感染率≥10%），采取以下措施：

[4]赵玉龙.一种提高疫苗生产中鸡毒支原体增殖能力的方法：中国，

102168073B[P].2013-03-20.

[5]王永录.等.切流式超滤技术及其在病毒学研究中的应用[J].

中国兽医科技,1997,27(6)：42~43.

[6]戎善东.等.超滤纯化工艺对口蹄疫灭活疫苗免疫效果的影响

分析[J].中国畜禽种业,2014,10（6）：43~46.

畜牧兽医科技信息2018年第3期

23