恩诺沙星残留对土壤微生物数量及群落功能多样性的影响_王加龙

2005-02-25

恩诺沙星残留对土壤微生物数量及

*

群落功能多样性的影响

王加龙

1**

刘坚真 陈杖榴 陈林

2

121

(华南农业大学1食品学院;动物医学院 广州 510642)

摘 要 对不同浓度恩诺沙星作用于土壤后三大类微生物数量及群落功能多样性进行了研究.结果表明,恩诺沙星残留对它们影响强弱顺序为:细菌>放线菌>真菌,其影响作用随浓度从每克土0.01Lg至10Lg的增加而加大,药物作用活性维持期为6~8d,但对真菌作用不明显.相对较低浓度的恩诺沙星残留(每克土中0.1Lg,1Lg)不影响土壤微生物群落功能多样性,而相对较高浓度的恩诺沙星残留(每克土中10Lg)则降低了其微生物群落功能多样性.图2表2参9

关键词 恩诺沙星残留;土壤微生物;数量;群落多样性CLC X171+S154

EFFECTSOFENROFIOXACINRESIDUEONNUMBERAND

*

COMMUNITYFUNCTIONDIVERSITYOFSOILMICROBES

WANGJialong

(1CollegeofFoodScience,

2

1**

,LIUJianzhen,CHENZhangliu&CHENLin

121

CollegeofAnimalMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou 510642,China)

Abstract Theeffectofenrofloxacinresidueonnumberandcommunityfunctiondiversityofsoilmicrobeswasstudied.It

showedthatduringthetermofdrugvalidity(6~8d),theeffectofenrofloxacinresidueon3kindsofmicrobeswas:bacteria>actinomyces>fung.iWhentheconcentrationofenrofloxacinresidueinsoilincreasedfrom0.01to10Lg/g,theeffectwasenhanced.Italsoindicatedthatrelativelylowconcentrationofenrofloxacinresidue(0.1Lg/g,1Lg/g)didnt'affectthefunc-tiondiversityofsoilmicrobecommunity,whilerelativelyhighconcentration(10Lg/g)reducedit.Fig2,Tab2,Ref9Keywords enrofloxacinresidue;soilmicrobe;number;communitydiversityCLC X171+S154

兽药在防治动物疾病,促进动物生长以及提高其品质方面起重要作用.随着畜牧业规模化、集约化发展,兽药被大量使用.动物摄入药物后,一部分药物以原形或代谢产物方式积累于动物的组织、器官及其产品(如蛋、奶)中;另一部分则随粪便排到周围土壤中,造成兽药在土壤环境中的残留.对于前者,国外关注较早,我国在这方面也制定了一系列法规.对于兽药在土壤环境中的残留问题,国外从20世纪七八十年代就已开始广泛研究,但我国目前基本缺乏这方面的研究[1~2].

恩诺沙星(Enrofloxacin)作为动物专用抗菌药,已广泛用于动物感染性疾病的预防和治疗;动物摄入药物后,一部分以原药及其代谢物形式随其排泄物进入到土壤环境中,造成恩诺沙星在土壤中的残留.Babich等[3]提出一种化学污染物对某一生态系统中微生物的影响,可以间接反映出该化学品对该生态系统的影响.本文主要研究恩诺沙星残留对土壤中代表性微生物数量及群落功能多样性的影响,评价其带来的后遗作用,为环境监测与保护、农业生产提供生态依据.

收稿日期:2003-12-08 接受日期:2004-04-05

*广州市科技攻关项目(No:20002-035-01) SupportedbytheSc-itech

KeyProjectofGuangzhou,China

**通讯作者 Correspondingauthor(E-mai:lwangjialong2000@163.

com)

1 材料与方法

1.1 试验药物

恩诺沙星为华南农业大学兽医学院提供,纯度为98.66%.

1.2 试验土壤

华南农业大学花园苗圃土,色深,质细,含水约为50%左右,阴干后过40目筛.

1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基,淀粉铵盐培养基,马丁氏培养基.

1.4 试验仪器

H-1微型漩涡混合器,电热恒温培养箱,SW-CJ-2FD净化工作台,菌落计数器,移液枪(1000LL、200LL),BIOLOGGN微平板、EL800酶标仪.

1.5 试验方法

1.5.1 土壤样品处理 土壤采集后,阴干,过筛后,分装到5个250mL三角瓶中,每瓶中含土100g,加入恩诺沙星,使5个三角瓶中药物浓度为每克土含药物:0Lg,0.01Lg,0.1Lg,1Lg,10Lg.把三角瓶放在30e培养箱中培养.1.5.2 土壤中细菌、放线菌、真菌数量测定试验 按文献[4~5]进行.

1.5.3 BIOLOGYGN平板试验 土壤样品处理同1.5.1,培养2d后,分别加入90mL无菌0.1molL-1磷酸缓冲溶液(K2HPO4/KH2PO4,pH7.0),塞好塞子.用振荡器振荡1min,冰浴1min,共重复3次(体积比1Ø10提取液).静置2min,取上清液5mL于含45mL无菌0.1molL-1磷酸缓冲溶液(pH7.0)的三角瓶中,振荡1min(体积比1Ø10提取液).重复以上步骤,直至稀释到BIOLOGGN系统所要求的接种浓度,为每毫升提取液大约为3@104~4@104个微生物.将BIOLOGGN平板从冰箱内取出,预热到25e.用200LL移液器取150LL土壤提取液,加入到孔中.将加好样的平板30e温育.酶标仪上630nm

处读数,打印出数据.每隔12h各测定一次,共10次.

1.6 数据处理方法

1.6.1 土壤微生物群落BIOLOGGN微平板反应颜色变化率 土壤微生物群落BIOLOGGN微平板在温育过程中的平均每孔颜色变化率(averagewellcolordevelopment,AWCD)计算方法:AWCD=〔E(A-ACK)〕/95,其中A指各反应孔在630nm波长下测定的吸光值,ACK指对照孔的吸光值.

1.6.2 土壤微生物群落功能多样性的分析 用于计算土壤微生物群落功能多样性的公式见表1,采用反应72h的数据计算.

表1 计算土壤微生物群落功能多样性指数的公式

Table1 Theequationsoffunctiondiversityindexesofsoilmicrobecommunity

多样性指数

DiversityindexesShannon指数ShannonindexShannon均匀度ShannonevennessSimpson指数SimpsonindexMcIntosh指数McIntoshindexMcIntosh均匀度McIntoshevenness

用途Purposes

评估群落丰富度和均匀度Evaluatingabundanceandevenness通过Shannon指数计算出的均匀度EvennesscalculatedbyShannonindex评估某些最常见种优势度指数Evaluatingsomemostfamiliarspecies

基于群落物种多维空间上的U=EniEuclidian距离的多样性指数

Euclidiandistanceofspeciesdiversityindex由McIntosh指数计算得出得均匀度E=(N-U)/(N-N/S)EvennesscalculatedbyMcIntoshindex

2公式EquationsH=-EpilnpiE=H/InS

D=N(N-1)/Eni(ni-1)

备注Remarks

pi为第i孔相对吸光值(C-R)pi:AbsorbanceofNo.iporeS为颜色变化孔的数目

S:Thenumberofcolorchangedporeni是第i孔的相对吸光值(C-R),N是相对吸光值总和

ni:RelativeabsorbanceofNo.iporeN:Summationofrelativeabsorbance

同上

ditto同上ditto

2 结果

2.1 恩诺沙星残留对土壤中细菌数量的影响

由图1A可见,不同浓度恩诺沙星作用于土壤后,随着药物浓度从每克土0.01Lg至10Lg的增加,在前6d内,细菌总数都有所降低且药物浓度越大细菌数量下降得越快,下降的幅度越大.6d后,不同处理土壤细菌数量略有回升并趋于稳定.

Lg药物样品,12.71%;1Lg,32.61%;10Lg,62.59%.经SAS统计软件t检验分析知,在24~120h间,不同浓度土壤微生物群落的AWCD差异极显著(每克土0Lg与0.1Lg间T=5.56,P=0.0005<0.01;0.1Lg与1Lg间T=5.86,P=0.0004<0.01;1Lg与10Lg间T=8.08,P=0.0001<0.01).说明恩诺沙星残留对土壤微生物碳源利用多样性影响极显著.

2.4.2 土壤微生物群落功能多样性的分析 由表2可知,恩诺沙星浓度为0.1Lg/g土和1Lg/g土的土壤各指数与CK相比,除Simpson多样性指数升高和McIntosh多样性指数降低外,其余各指数CK接近;浓度为10Lg/g土的土壤各指数中,除Simpson多样性指数与CK接近外,其余各指数均比CK低.

因此,相对较低浓度的恩诺沙星残留对土壤微生物群落多样性影响不明显,而相对较高浓度的恩诺沙星残留则降低了其微生物群落多样性.药物浓度越高,土壤微生物多样性就越低.

2.2 恩诺沙星残留对土壤中放线菌数量的影响

由图1B可见,随着药物浓度从每克土0.01Lg至1Lg的增大,在前2d内放线菌数量明显下降且降低的幅度随浓度的增大而增大.2~8d内稍有下降.8d后作用减弱,至12d菌数有所恢复.总之,就整体而言,恩诺沙星对放线菌的影响不如细菌大.

2.3 恩诺沙星残留对土壤中真菌数量的影响

由图1C可见,恩诺沙星作用于土壤后,不同浓度间真菌数量在不同时间内的变化规律不如细菌和放线菌明显,波动较大.在整个测定过程中,不同平板间数量差异较大.因此恩诺沙星残留对土壤真菌作用不明显.

3 讨论

3.1 恩诺沙星残留对土壤中细菌、放线菌、真菌数量

的影响

本试验研究发现,恩诺沙星残留对土壤微生物影响的强弱顺序为:细菌>放线菌>真菌.恩诺沙星抗菌机理是其能选择性地抑制细菌特别是革兰氏阴性菌的DNA解旋酶(该酶为DNA拓扑异构酶Ⅱ的一种)活力,使DNA无法复制,而恩诺沙星对真核生物拓扑异构酶Ⅱ作用微弱.至于放线菌,从生物学角度来看更接近革兰氏阳性细菌.因此,就这一点而言,本试验得出的结果与恩诺沙星的抗菌机理一致.

2.4 恩诺沙星残留对土壤微生物碳源利用及其群落

功能多样性的影响

2.4.1 恩诺沙星残留对土壤微生物碳源利用多样性的影响不同浓度恩诺沙星作用土壤2d,取其稀释液加入到BIOLOGGN微平板中温育,每隔12h测定一次,结果见图2,在药物作用24h内,不同浓度处理对土壤微生物群落AWCD影响不明显,在36h后影响加大且随浓度增加抑制明显增加,至120h各浓度AWCD比对照降低百分率分别为:浓度为每克土含0.1

图2 土壤微生物群落温育过程中AWCD变化Fig.2 AWCDvariationduringthewarmingcourseof

soilmicrobecommunity

恩诺沙星残留对细菌、放线菌影响的有效期分别为6d、8d,此后其数量略有回升并趋于稳定.原因很多,首先,土壤是一个复杂的生态体系,任何一个生态系统的发展变化都是多因素综合作用的结果.各种理化因子如土壤含水量、温度、pH、有机质、无机质含量等均能对恩诺沙星的稀释、水解、氧化等降解作用有一定影响.另外,土壤对药物的吸附作用致使土壤中实际药物浓度降低.

更重要的是,土壤中微生物种类繁多,有些微生物对恩诺沙星不敏感,甚至还有些微生物可能把其作为营养物质加以利用.所以,反过来微生物也能降解土壤中残留的恩诺沙星,即起解毒作用,从而使短期内土壤微生物生态能恢复平衡.但如果药物长期保持着高浓度则会降低土壤中细菌的数量,而土壤中微生物尤其是细菌的数量最多,约占土壤微生物总数70%

图1 恩诺沙星残留对土壤中微生物数量的影响

Fig.1 Effectofenrofloxacinresidueonnumberof

soilmicroorganisms

~90%,其数量和活性是土壤肥力的一个重要指标.因此,高

浓度恩诺沙星残留则会降低土壤肥力,对农业生产产生不利影响.

BIOLOGGN微平板是一种多底物的96孔平板,除了对照孔A1只装有四氮叠茂和一些营养物质外,其余95孔还装有

表2 土壤微生物群落功能多样性指数

Table2 Functiondiversityindexofsoilmicrobecommunity

药物浓度Drugconcentration(w/Lgg-1)

0(CK)0.1110

Shannon指数

Shannonindex

3.0353.2282.9862.454

Shannon均匀度

Shannonevenness

0.7760.7880.7600.570

Simpson指数Shannonindex47.31682.73564.55147.338

McIntosh指数

McIntoshindex

6.9516.1235.5963.178

McIntosh均匀度McIntoshevenness

0.8950.8990.8830.718

不同的单一碳底物.在BIOLOGGN微平板反应中土壤微生物利用碳底物,呼吸作用产生NADH,引起四氮叠茂发生氧化还原变色反应.每孔颜色变化程度(AWCD)可反映土壤微生物群落对95种不同单一碳源的代谢能力高低.微生物对碳源利用能力是表征土壤微生物生长情况的主要指标[6~9].Garland等(1991)认为,土壤微生物群落BIOLOGGN微平板显色反应速度和最终能达到的程度与群落内能利用单一碳底物的微生物的数目和种类有关,BIOLOGGN微平板技术可用于评估土

壤微生物群落代谢和功能多样性的研究.实验结果表明:土壤微生物群落的功能多样性指数差异明显,相对较低浓度的恩诺沙星残留不影响土壤微生物群落功能多样性,而相对较高浓度的恩诺沙星残留则降低了其微生物群落功能多样性.药物浓度越高,土壤微生物多样性就越低.

Referances

1 XuSX(徐示新).ResearchstatusofveterinaryresidueinChina.ChinAnimProt(中国动物保护),2000,10:105~107

2 ChenZL(陈杖榴),YangGF(杨桂芳),SUNYX(孙永学).Re-searchprogressoftoxicityandecologicaltoxicpricipleofveterinaryres-idue.JSouthAgricUniv(华南农业大学学报),2001,2(1):88~913 BabichE,StotG.Developingstandardforenvironmentaltoxicants:the

needtoconsiderabioticenvironmentalfactorsandmicrobemediatedeco-logicalprocesses.EnvironHealthPerspect,1983,49:345~3534 许光辉,郑洪元.土壤微生物分析方法手册.北京:农业出版社,

1986.205~209

5 李阜棣,喻子牛,何绍江.农业微生物学实验技术.北京:农业出版社,1996.186~191

6 GarlandJL,MillsAL.Classificationandcharacterizationofheterotroph-

icmicrobialcommunitiesonbasisofpatternsofcommunity-levelsole-carbon-sourceutilization.ApplEnvironMicrobiol,1991,57:2351~2359

7 HaackSK.Analysisoffactorsaffectingtheaccuracy,

terns.ApplEnvironMicrobiol,1995,61:1458~1468

8 StaddonWJ.Microbialdiversityandcommunitystructureofpostdistur-banceforestsoilsasteterminedbysole-carbon-utilizationpatterns.MicrobEcol,1997,34:125~130

9 SmallaK.AnalysisofBIOLOGGNsubstrateutilizationpatternsbym-i

crobialcommunities.ApplEnvironMicrobiol,1998,64:1220~1225

reproducibility,

andinterpretationofmicrobialcommunitycarbonsourceutilizationpa-t

稿 约一《应用与环境生物学报》 是有关应用生物学和环境生物学基础研究、应用基础研究和应用研究的全国性学术期刊.主要发表:1.生物学及其各分支学科在资源、能源、环境、农林、医药、轻化工、食品等领域的原始研究论文和简报;2.有关生物学新技术新方法的研究论文;3.本刊特约的综述或述评.

二来稿 本刊主要接受网上投稿,我部将在3个工作日内受理回复.打印稿请用计算机A4纸,正文字体不小于新五号(宋体),稿中未表示出的字体、符号等要求用铅笔标出;来稿一式3份;论文被接受后,作者须E-mail发送最后修回稿或寄送软盘至我部.受理稿件将酌收审稿费.欢迎优秀的英文稿件和国际论文,审稿通过拟接受的可以优先发表。

三格式、文字和计量单位等 要求应依国家有关标准、条例和法规.具体要求如下:1.按书写顺序,一篇论文应由题名、作者姓名、作者单位、中文摘要、中文关键词、中图法分类号、英文题名、英译作者名及作者单位、英文摘要、英文关键词、正文、文中图表、(致谢、)参考文献、图版及其中文、英文说明等部分组成.CLC(中图法分类号)作者可以留空.

2.题名应恰当、简明.作者应是论文内容的主要责任者;中国作者的英译用汉语拼音(见GB/T16159-1996).中文摘要应具有独立引用的价值,第三人称行文,400字左右;英文摘要内容可详于中文摘要.

3.关键词3~8个,应尽量使国家公布的规范词.图表应具/自明性0,内中文字用中、英文对照;图表插入文中适当位置;图也可另附,并在文中以方框示出位置,于方框下书写中、英文一致的图题和说明.图版照片要清晰,拼贴成小于21cm@14cm的版心,一式2份;墨线图用计算机绘制(或交原始绘图数据).

4.参考文献表用/顺序编码制0,即参考文献表中的各篇文献按其在正文中的标注序号依次列出.未公开文献不进入参考文献表,必要时可以脚注方式使用.各类参考文献着录格式示意如下:

a.专著类:著者.书名.版次(1版不著).出版地:出版者,出版年(.页码)b.期刊论文类:论文作者.论文题名.刊名,年,卷次(期):论文起止页码c.论文集类:论文作者.题名.见(In):编者(加/编0或/ed(s)0).文集名或书名.出版地:出版者,出版年.论文起止页码d.报纸中析出文献:作者.题名.报纸名,年-月-日(版次)e.专利文献:专利申请者.专利题名.专利国别,专利文献种类,专利号.出版日期

f技术标准:(起草责任者.)标准代号标准顺序号-发布年标准名称(.出版地:出版者,出版年).g.学位论文:作者.题名:[:学位论文].保存地:保存者,年份h.会议论文:作者.题名.会议名称,会址,会议年份i有关参考文献著录格式,需要注意的是:.

①文献作者全部列出(不再用/等0或/etal0省略);②引用国内期刊文献时,无论原文是中文还是英文,均用英文数据著录(但原文无英文数据者除外),同时用/()0著录作者中文姓名和中文刊名以与国外期刊相区别.例:

1 DengGB(邓光兵),MaXR(马欣荣),ZhangXP(张小萍),ChenJ(陈静),YuMQ(余懋群).Effectofph1bgeneonhybzidF1betweencommonwheatandHaynaldiavillosa.ChinJApplEnvironBiol(应用与环境生物学报),1998,4(3):211~215

5.论文应使用《GB3100~3102-93量与单位》规定的计量单位和符号.参见http://www.cib.jcom/tools/pdf/fdjn.pdf

四本刊特向作者约定 我部自收到稿件后的3个月内通知作者稿件处理情况;刊用稿件酌收发表费并酌付一次性稿费(不低于发表费的20%),同时赠送样刊2册,抽印本20份.凡投稿我刊且未作特别声明者,则同意其论文随《应用与环境生物学报》整体进入清华同方光盘、万方数据、《中国生物学文摘》和中国生物学文献数据库、中文科技期刊数据库(重庆维普)以及其他中外数据库。

五本刊地址 成都市人民南路4段9号,中国科学院成都生物研究所《应用与环境生物学报》编辑部,邮编610041;电话:(028)85238241,85229903,85237341;传真:85237341,85222753;E-mai:lbiojaeb@cib.ac.cn,biojaeb@mai.lsc.cninfo.net,biojaeb@21cn.com;网址:http://www.cib.jcom