肝癌细胞的研究进展

引言：据有关资料显示，全世界约有3亿乙型肝炎病毒感染者。中国占1亿人．且每年

新增患者3000万以上。据1992年全国病毒性肝炎流行性调查，中国有6亿人曾感染过乙型肝炎病毒，其中1．2亿是乙肝表面抗原携带者。据统计，肝癌患者中乙型肝炎相关者约占70～80％。一般认为部分乙肝患者转变为肝癌的进程为：乙型肝炎一慢性肝炎一肝硬化一肝 癌【1】。故了解乙肝的发病机理及防治方法，掌握肝癌细胞 cDNA 文库的构建及鉴定方法显得尤为重要。

关键词：肝癌细胞；发病机理；防治方法；cDNA文库 1、乙肝的发病机理及病因

1．1乙肝的发病机理

这是一个复杂的问题，迄今尚未完全阐明。国内外学者对此进行了大量研究。结果表明，乙型肝炎病人的肝脏受损并不是乙型肝炎病毒在肝细胞内繁殖的直接结果．而是机体的免疫反应造成的。乙型肝炎病毒感染人体后，可激发机体产生对乙型肝炎病毒的各种细胞免疫反应和体液免疫反应，并激发自身免疫反应引起免疫调节功能紊乱。机体的这些免疫反应，可清除已感染病毒的肝细胞．又可引起肝细胞的损伤，造成不同类型的病理变化及临床转归。幼儿时的感染，常常因免疫功能不健全而缺乏上述的免疫反应，造成乙型肝炎病毒携带状态或慢性肝炎。 1．2乙肝的病因

病毒感染：乙肝病毒具有传染性强，传播途径复杂，流行面广泛，发病率高等特点；酗酒：酒精及其代谢产物对肝细胞的损害能引起肝炎。据研究，如果每天摄人酒精1509以上，持续5年以上．90％的人可发生各种肝损害：10年以上则有约34％发生慢性肝炎．约25％发展为肝硬化：药物或化学毒物：许多药物和化学毒物都可引起肝损害。如四氯化碳、四环素、砷汞等，造成药物性肝炎或中毒性肝炎。肝损程度取决于药物的剂量、时间。以及个体差异。长期服用或反复接触，可致慢性肝炎，甚至肝硬化【2】。

2、乙肝细胞 cDNA 文库的构建及鉴定

2. 1 材料

人肝癌细胞株HHCC， E.cOli Y1090hsdR 株，gt11 噬菌体去磷酸化的左、右臂DNA。 质粒 Bluescr ipt SK 及感受态细菌 TG1，TRIZOL试剂，OligoteX mRNA kit ，UniVersal Riboclone cDNA Synthesis kit， EXpandTM ReVerse Transcriptase， Lambda Packaging kit， [ O-32P]dCTP.。 2、2 方法 1、培养HHCC 至旺盛生长期，倾去培养液后加入 TRIZOL试剂，裂解细胞并抽提出总 RNA; 用OligoteX mRNA kit 试剂从总 RNA 中纯化出含 polyA 的 mRNA 并用紫外分光光度计( Perkin Elmer 公司产品D 测定其纯度及含量。

2、 以 6 g 的 mRNA 为模 板，3ug Oligo ( dTD 15为引物， Expand TM ReVerse Transcriptase 为反转录酶 ，42C 60 min 合成 cDNA第 1 链; 然后向其中加入 10> 第 2 链缓冲液 再加入DNA 聚 合 酶 I 及 RNase~ 22C 保 温 60 min 合 成cDNA 第 2 链; 双 链 cDNA ( dscDNA D 合 成 后 加 入T4DNA 多 聚 酶 37C 保 温 10 min 削 平 双 链 cDNA的两端 以便于后续的连加人工接头反应. 在 cDNA第 1 2 链的合成过程

中均取出一小份反应体系 加入[ O-32P ] dCTP 以 示 踪 cDNA 合 成 的 效 果. 用T4DNA 连 接 酶 将 EOORI 人 工 接 头 与 削 平 后 的dscDNA 连接 用 Sephacryl-S400 柱去除小于 500 bp的 cDNA 片段及游离的 EOORI 人工接头. 3、用 T4 多核苷酸激酶对连接上 cDNA 的人工接头磷酸化 然后再与去磷酸化的 7gt11 噬菌体左~ 右臂相连 连接体加入到噬菌体体外包装系统中 22C 保温 3 h 包装成噬菌体. 混合多份包装产物建成重组 7gt11 噬菌体文库. 4、取出 1 pL 的包装噬菌体 按 1 = 1000 和 1 =10 000倍稀释后感染对数生长期的 E. OO z Y1090 铺平板 并在上层培养基中加入终浓度为 5 g/L的IPTG 和 11 g / L的 X-Gal 37C 培养过夜 , 次日数噬斑数目及蓝~ 白噬斑之比 计算出文库的大小; 为了验证插入的 cDNA 片段的平均大小 我们将与构建文库用的同一批 cDNA 加上 EOORI 人工接头后 与经内切酶 EOORI 酶切并去磷酸化的质粒载体 Bluescr iptSK 相连 并转化感受态细菌 TG1 同样铺平板加入IPTG 和 X-Gal 37C 培养过夜，次日挑出9个白色细菌斑 分别接种入 5 mL 液体 LB 培养基中培养，小量提取质粒 并用内切酶 EOORI 酶切后 进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定切出片段的大小【3】。 2 、3结果

1 、总 RNA 及 mRNA 的提取及纯化

总 RNA 提取出来之后经变性凝胶电泳[3]. 结果表明 总 RNA主要是 28S 和 18S rRNA 且 28S 带的亮度是 18S 带亮度的2倍以上，说明总RNA提取完好，未被降解( Fig 1)， 总 RNA 经过 OligoteX 纯化柱纯化后获得mRNA ，经测定约占总 RNA 量的 1. 84% 且 A260 nm与 A280 nm 的比值大于 2. 0 说明 mRNA 足够纯净。符合建库要求【4】。 2、cDNA 第 1 2 链的合成及鉴定 合成的 cDNA

第1、2 链的示踪物经14 g / L的碱性琼脂糖凝胶电泳[4] 并经放射自显影结果表明 cDNA 的第1链大小从约 300 bp 到 9 kb 片段集中区在 1. 5~ 3. 0 kb之间 cDNA 第 2 链分布与第1 链相似，只是影像更清晰两链黑度分布均匀为连续拖影没有特异带型，完全符合哺乳动物细胞 mRNA 的分布规律( Fig2)【5】。 3、文库的大小及重组子插入片段分析

合并多份包装体系后测得文库共含噬菌体 1. 2> 106个，其中，重组子( 白色噬斑> 与野生型( 蓝色噬斑> 之比为 12：1，重组子插入片段的大小是评价文库质量的重要标准。还由于质粒载体较噬菌体载体在提取~ 纯化~ 电泳等方面的易操作性 我们将与构建文库用的同一批cDNA 插入到质粒载体中然后酶切鉴定 应能间接但真实地反映出噬菌体文库中插入片段的大小。从 Fig3 看出 9 个重组质粒中均切出插入片段，且大小不一，平均大小约 1. 5 kb，达到了高质量文库的要求【6】。

3、乙肝的传播途径

乙肝病毒侵入机体会复制出繁殖能力与传染性更强的病毒颗粒。这样即使乙肝治疗趋于慢性化，仍使它的传染性不断扩大。另外乙肝病毒的抵抗力特别强，且对一般消毒剂不敏感，只有经过高压灭菌才能杀死病毒．而且乙肝病毒会利用各种途径侵入人体【7】： 3．1血液传播

由于乙肝病毒主要存在于病人的血液中，因此经血液传播是一重要途径。包括输血或血制品、血液透析、文身、扎耳眼儿、牙钻、被针头意外刺伤、共用刮脸刀及牙刷等。 3．2母婴传播

一般认为人群中的HBsAg携带者中约有1／3来源于母婴传播，HBsAg携带者的母亲在分娩的过程中染给新生儿。分娩过程中新生儿吸入母亲含有乙肝病毒的血、羊水、阴道分泌物、还可以通过婴儿破损的皮肤或黏膜而传染：新生儿在母亲的子宫内也容易被传染，主

要是通过胎盘传染。若胎儿在宫内已感染乙肝病毒．新生儿出生后再预防也已无效。 3．3密切接触传播

性接触传播HBsAg阳性男性精液肯定有传染性。在黑猩猩阴道内放入HBsAg阳性病人的精液，使其感染了乙肝的实验更直接证明了这一点。因此婚前检查乙肝病毒标志是非常重要。乙肝患者或携带者的血液、唾液、精液、阴道分泌物、乳汁都可能含有乙肝病毒，可污染器具、物品。当口腔黏膜(包括牙龈)破损时有可能经口感染，被污染了餐具未经消毒，再加上不良卫生习惯，为抵抗力极强的乙肝病毒的侵入创造了温床。

4、乙肝的危害

(1)感染率高：我国是高发区，人群感染率达60％，其中约lO％是慢性乙肝病毒携带者。 (2)预后差：在乙肝病毒携带者中约25％的病人最终转为慢性肝病，包括肝硬化和肝癌。 (3)无特效药物：到目前为止仍然没有特效药物杀灭人体的乙肝病毒。只能对症治疗。

(4)影响正常生活，不但影响了患者的身心健康，干扰了正常生活，影响了升学、入伍、就业、婚嫁、给家庭也带来了沉重的经济负担【8】。

5、预防乙肝最有效措施

乙肝的预防在采取加强血液及血制品管理、杜绝医源性感染(针头、针管、医疗操作时污染)及改善卫生条件、去除不良卫生习惯等综合措施的基础上。施行乙肝疫苗接种是保护易感人群、预防乙肝最有效的办法【9】。从1992年1月开始我国已在全国范围内有步骤地开始大规模地对新生儿和学龄前儿童进行乙肝疫苗接种，并纳入计划免疫管理。在我们这样一个人口众多的大国，实施这一战略是当前最有效的措施，近期的效果阻止了每年100万新生儿童受乙肝病毒的感染。50年以后，将使我国乙肝病毒携带者从10％降至O．5％，其社会效益是非常巨大的。发扬团队精神，及早做好应变措施，做到让病人住的舒适、安全，把护理工作的风险降到最低。

参考文献：

【1】 丁涵章．现代管理全书[M]．杭州：杭州出版社，1999，9

【2】戴良和．手术室护理工作的风险因素及对策．当代护士，2003，6

【3】汤钊猷. 我国肝癌研究的进展与展望[J]. 中国癌症杂志, 1997; 7( 3) : 151-1.

【4】 金冬雁, 黎孟枫译. 分子克隆实验指南[M]. 第2 版.北京: 科学出版社, 1992: 366-367. 【5】金冬雁, 黎孟枫译. 分子克隆实验指南[M]. 第 2 版. 北京: 科学出版社, 1992: 316-318. 【6】汤钊猷 我国肝癌研究的进展与展望 1997(03)

【7】.张业霞.罗霜.王宗军 乙肝的研究现状[期刊论文]-菏泽医学专科学校学报 2008(2) 【8】王荔．“移情”与护患关系．实用护理杂志，2001，17(1)：50

【9】阎成美，翁庐英，李妮．护理不安全因素分析与管理对策U]．中华护理杂志，2003，38(7)：7-9

引证文献：

【1】.王现华.HBV感染婴幼儿血清学调查及分析[期刊论文]-中国现代医生 2008(24) 【2】张业霞.罗霜.王宗军 乙肝的研究现状[期刊论文]-菏泽医学专科学校学报 2008(2)

【3】.汪磊.杜冰.吴淼.周忠良.钱旻 人肝癌细胞移植瘤cDNA表达文库的构建及鉴定[期刊论文]-华东师范大学学报（自然科学版） 2007(4) 【4】.陈刚.张.付杰.李福洋.刘新平.药立波 HMy2细胞cDNA表达文库的构建和鉴定[期刊论文]-第四军医大学学报2003(1)