第２４卷第２期 ２０１３年３月 化学 研究 中国科技核心期刊 ｈｘｙｊｉ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ 甲基橙皮苷和人血清白蛋白相互作用的光谱研究 李金华 ，王素敏 朱金花 ，（１．西安工业大学材料科学与化工学院，陕西西安７１００３２ ２。河南大学化学化工学院，河南开封４７５００４） 摘要：利用荧光光谱法和红外光谱法研究了甲基橙皮苷（ＭＨ）与人血清白蛋白（ＨＳＡ）的相互作用．结果表 明，ＭＨ对ＨＳＡ的荧光有较强的猝灭作用．在２９６、３０３、３１０ Ｋ温度下，ＭＨ与ＨＳＡ相互作用的结合常数分别 为１．７７×１０ ，２．６５×１０ ，３．５３×１０ Ｌ・ｍｏ１．热力学分析结果表明，ＭＨ与ＨＳＡ之间的结合过程是吸热的 并且是自发的；作用力以疏水作用为主，并伴随氢键作用． 关键词：甲基橙皮苷；人血清白蛋白；相互作用；荧光光谱；红外光谱 中图分类号：Ｏ ６５７．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００８—１０１１（２Ｏ１３）０２—０１７６～Ｏ４ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔｈｙｌ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ＬＩ Ｊｉｎ－ｈｕａＨ，ＷＡＮＧ Ｓｕ—ｍｉｎ ．ＺＨＵ Ｊｉｎ—ｈｕａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｘｉ’ａｎ ７１００３２，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏＪ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｘｉ’ａｎ ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ ４７５００４，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒａｅｔｈｙｌ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ（ＭＨ）ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＨＳＡ） ｕｎｄｅｒ ｓｉｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｆｌｕｏ— ｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ（ＦＴ—ＩＲ）ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌ ｔｈａｔ ＭＨ ｃａｎ ｗｅｌｌ ｑｕｅｎｃｈ ｔｈｅ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ＨＳＡ．Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ａｔ ２９６，３０３，ａｎｄ ３１０ Ｋ ａｒｅ １．７７×１０ ，２．６５Ｘ１０ ，ａｎｄ ３．５３×１０ Ｌ・ｍｏｌ～，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒ— ｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＨ ａｎｄ ＨＳＡ ｉｓ ｅｎｄｏｔｈｅｒｍｉｃ ａｎｄ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｓ ｄｏｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ ｈｙ— ｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｅｔｈｙｌ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ；ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ； ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ 血清白蛋白是循环系统中可溶性蛋白质的重要组成部分，是血浆中含量最丰富的蛋白质，具有很多生理 学上的功能＿１ ．蛋白质作为载体能和许多药物及其他具有生物活性的小分子、大分子相互作用．研究药物 与血清白蛋白相互作用对于医药化学和临床医学来说是非常重要的．从不同角度考察药物分子与蛋白质的 作用对于了解药物的转运和代谢过程以及阐明生物大分子与药物小分子相互作用的化学本质都有重要意 义Ｉ２ ］．中药是我国的传统医药，历史悠久，研究中药活性组分与蛋白质的作用可为中药的发展与更有效地 推广应用提供可靠的理论基础，为合理给药提供理论依据 ］． 黄酮类化合物具有抗心律失常、抗病毒、抗癌、抗菌、抗炎症、抗糖尿病并发症等功能口 ］．甲基橙皮苷 收稿日期：２０１２—０９—０７． 基金项目：陕西省教育厅专项科研计划项目（２０１０ＪＫ６０９）． 作者简介：李金华（１９７９一），女，讲师，博士，主要从事生物大分子与小分子相互作用的分析研究．Ｅ—ｍａｉ：ｌｉｊｈｕａ０９＠１６３．ＣＯＮ． 第２期 李金华等：甲基橙皮苷和人血清白蛋白相互作用的光谱研究 １７７ （ｍｅｔｈｙｌ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ，ＭＨ）是橙皮苷经甲基化而生成的一种黄酮类化合物，结构式见图１，其生物活性比橙皮 苷强，可增加毛细管的抵抗力，防止动脉硬化症引起的功能紊乱，与维生素ｃ共同使用可增加其药效 ． 关于ＭＨ和蛋白质的相互作用未见报道．作者利用光谱法研究了ＭＨ与ＨＳＡ的相互作用，求得不同温度 下药物与ＢＳＡ相互作用的结合常数及位点数，并根据热力学常数确定了ＭＨ与ＨＳＡ之间的作用力类型． ＯＨ ＯＨ Ｏ 图１ 甲基橙皮苷的结构图 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＭＨ １ 实验部分 １．１仪器和试剂 ＲＦ一５３０１ＰＣ（日本，Ｓｈｉｍａｄｚｕ）荧光光度计用于记录样品荧光光谱和荧光强度，使用１５Ｏ Ｗ氙灯与１ ｃｍ 石英比色池，狭缝宽度为５ ｒｉｍ．实验过程中用电子循环水浴（ＮＴＴ－２１００，ＥＹＥＬＡ，日本）控制样品温度． Ｎｅｘｕｓ６７０傅立叶变换红外光谱仪（美国Ｎｉｃｏｌｅｔ公司），衰减全反射附件（ＡＴＲ，ＺｎＳｅ晶体），ＤＴＧＳ检测器， ＯＭＮＩＣ５２数据处理软件． ＨＳＡ购于Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ（美国）生物技术公司，使用时未进一步纯化．ＭＨ标准品购于中国药品生物 制品检定所．氯化钠、盐酸、三（羟基甲基）氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水． １．２实验方法 荧光光谱测定：设置激发波长２８０ ｎｍ，在２．０ ｍＬ含有３．０ ｘ １０ ｍｏｌ／Ｌ ＨＳＡ的溶液中连续滴加ＭＨ 储备液，在３００￣５５０ ｎｍ范围内扫描ＭＨ－ＨＳＡ体系的发射光谱． 荧光滴定实验：在２．０ ｍＬ含有３．０×１０ ｍｏｌ／Ｌ ＨＳＡ的溶液中，以微量注射器逐次加入不同体积的 ＭＨ储备液，ＭＨ的最终浓度为５．０～４７．６ ｍｏｌ／Ｌ，每次滴加ＭＨ后反应２ ｍｉｎ．在ＨＳＡ最大发射波长 ３３７ ｎｍ处，记录２９６、３０３和３１０ Ｋ下体系的荧光强度，所得数据用于计算结合常数和结合位点数． 红外光谱的采集及谱图处理：分辨率为４ ｃｍ．。，取样次数为６０．同样条件下采集缓冲溶液的光谱，然后 从ＨＳＡ样品溶液光谱中减去缓冲溶液的吸收就得到ＨＳＡ溶液的红外光谱图． ２结果与讨论 ２．１ ＭＨ对ＨＳＡ的荧光猝灭 ＨＳＡ的内源荧光主要来源于色氨酸残基和酪氨酸残基［１１］．图２显示了ＨＳＡ与不同浓度的ＭＨ混合 后的荧光光谱图． 从图２可以看出，在激发波长为２８０ ｎｍ，发射波长为３３７ ｒｉｍ时，ＨＳＡ有很强的荧光（此荧光来源于色 氨酸残基），ＭＨ几乎没有荧光．随着ＭＨ的不断加入，ＨＳＡ的荧光强度逐渐下降，这种猝灭现象说明了 ＨＳＡ和ＭＨ之间发生了相互作用，改变了色氨酸残基周围的微环境，使得色氨酸残基的荧光强度下降． ２．２结合常数和结合位点数 根据荧光滴定数据，利用Ｓｃａｔｃｈａｒｄ方程（１）计算结合常数和结合位点数： ｒ／Ｄ ｒ—ｎＫ～ｒＫ （１） 其中ｒ是每摩尔ＨＳＡ结合ＭＨ的摩尔数，Ｄｔ是游离ＭＨ的浓度，Ｋ与 分别是结合常数与结合位点数． 图３为２９６、３０３和３１０ Ｋ下ＭＨ—ＨＳＡ体系的Ｓｃａｔｃｈａｒｄ图，可以看出在不同温度下，ｒ／Ｄｆ与ｒ都呈现 良好的线性关系，说明ＭＨ和ＨＳＡ之间只有一种键合位，这与所求得的结合位点数一致．从表１可以看 出，各个温度下的结合常数均达１×１０ Ｌ・ｍｏｌ 以上，说明了ＭＨ和ＨＳＡ之间有较强的结合，结合常数随 着温度的升高而升高． １７８ 化学研究 之、 ’弓； ．詈 盘 ８ ２ ｆ（ＨＳＡ） ３．０ ｍｏ１．Ｉ ～，从ａ到ｇ ｃ（ＭＨ）依次为：０，５．０ ｐＨ ７．４０，ｃ（ＨＳＡ） Ｋ；（▲）３１０ Ｋ． ３．０“ｍｏ１．Ｌ ；（●）２９６ Ｋ；（●）３０３ ９．９，１４．７，１９．６，２４．４，２９．１ ｔｔｍｏｌ・Ｌ一 ；ｈ为ＭＨ溶液 ｃ（ＭＨ）＝０．５／，ｍｏｌ・Ｌ一 ．激发波长２８０ ｎｍ ＝２８０ ｒｉｍ，Ａ ＝３３７ ｎｍ 图３ ＭＨ—ＨＳＡ体系的Ｓｃａｔｃｈａｒｄ图 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｐｌｏｔｓ ｏｆ ＭＨ—ＨＳＡ 图２ ２９６ Ｋ时ＭＨ—ＨＳＡ体系的荧光光谱图 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＭＨ～ＨＳＡ ｓｙｓｔｅｍ ａｔ ２９６ Ｋ 表１不同温度下ＭＨ—ＨＳＡ体系的结合参数和热力学参数 Ｔａｂｌｅ １ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ＭＨ—ＨＳＡ ２．３作用力类型的确定 小分子和蛋白质等生物大分子通常是通过疏水作用力、静电力、氢键和范德华作用力等结合形成超分子 复合物的［１引．根据反应的热力学参数（熵变、焓变等）可确定作用力类型，为此，采用荧光光谱技术测定了不 同温度下的结合常数（见表１）．当温度变化不太大时，反应的焓变可看作一个常数，此时的熵变和焓变可通 过Ｖａｎ ｔ Ｈｏｆｆ方程计算： １ｎ ＫＴ一一△Ｈ。／ＲＴ＋ＡＳ。／Ｒ （２） 式中，Ｋｒ为不同温度下的结合常数，Ｒ是气体常数．由ＩｎＫ对１／Ｔ作图，由斜率与截距分别可以计算出焓变 △Ｈ。、熵变ＡＳ。，再由下式 △Ｇ。一ＡＨ。一ＴＡＳ。 （３） 可以计算出反应的自由能变化ＡＧ。．所得的结果列于表１，从表１可以看出，结合反应的焓变△Ｈ。为正值， 自由能变△Ｇｏ为负值，说明ＭＨ与ＨＳＡ的结合是一个吸热过程，同时也是一个自发的过程．从热力学的角 度来考虑，正ＡＳ通常认为是疏水相互作用，而且，水溶液中离子间的静电作用一般是以正ＡＳ与负△Ｈ为 标志的，相反对于范德华力，△Ｈ以及△Ｓ却均为负值．负焓在静电作用中可能起一定作用，但在真正的静电 作用中焓变非常小几乎等于零［１ ．在ＭＨ和ＨＳＡ的相 互作用中，ＡＳ，△Ｈ均为正值说明疏水作用占主导地位， 但也不排除氢键作用的存在，因为在ＭＨ的分子中存在 氧原子． ２．４ ＭＨ对ＨＳＡ二级结构的影响 ＨＳＡ的红外光谱表现出９个特征谱带，反映ＨＳＡ 肽链不同的振动．其中酰胺Ｉ带（１ ６００～１ ７００ ＣｌＴＩ ）主 要是其氨基酸残基的Ｃ—Ｏ伸缩振动吸收，酰胺ＩＩ带 （１ ５００ １ ６００ ｃｍ ）则包含了Ｃ—Ｎ的伸缩振动和Ｎ— Ｈ的变形振动，因此这两个谱带与蛋白质的二级结构有 转角等不同结构振动峰的加合带）对ＨＳＡ二级结构的 变化的敏感程度优于酰胺ＩＩ带［】 ．图４为ＭＨ与ＨＳＡ ｐＨ ７．４Ｏ．ＭＨ ｔｏ ＨＳＡ（３．０×１０一 ｍｏｌ・Ｌ～ ）ｒａｔｉｏ：２：１ ＨＳＡ（ａ）和ＭＨ～ＨＳＡ体系（ｂ）的红外光谱图 着密切的关系．酰胺Ｉ带（为ａ一螺旋、 折叠、无规卷曲和 图４Ｆｉｇ．４ ＦＴ—ＩＲ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｆｒｅｅ ＨＳＡ（ａ）ａｎｄ ＭＨ—ＨＳＡ ｓｙｓｔｅｍ（ｂ） 第２期 李金华等：甲基橙皮苷和人血清白蛋白相互作用的光谱研究 １７９ 作用前后的红外光谱图．从图中可以看出，ＭＨ和ＨＳＡ的作用使得酰胺Ｉ带（１ ６４８．１ ＣｌＴＩ ）和酰胺ＩＩ带 （１ ５６０．１ ｃｍ ）最大吸收峰的位置及强度都发生了变化．这些结果说明了ＭＨ与ＨＳＡ的结合作用改变了 蛋白质的二级结构． ３ 结论 应用光谱技术对ＭＨ和ＨＳＡ的相互作用进行了研究．结果表明，ＭＨ与ＨＳＡ之间有很强的结合，改 变了ＨＳＡ的二级结构．键合模式结果表明二者之间的结合以疏水作用为主，但也不排除氢键作用的存在． 参考文献： ［１３ ＥＲＣＥＬＥＮ Ｓ，ＫＬＹＭＣＨＥＮＫＯ Ａ Ｓ，ＭＥＬＹ Ｙ．Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｗｏ～ｃｏｌｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ ＦＡ ｔｏ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ，２００５，３５（５）：２３１—２４２． ［２］缘萍，宋玉民，李清萍，等．铈配合物与人血清白蛋白相互作用的研究［Ｊ］．化学研究与应用，２０１０，２２（１０）：１２４８～１２５４． ［３］ＴＩＡＮ Ｊｉａｎ Ｎｉａｏ，ＬＩＵ Ｊｉａ Ｑｉｎ，ＸＩＥ Ｊｉａｎ Ｐｉｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｗｏｇｏｎｉｎ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ａ ｃｏｍｍｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ ｗｏｇｏｎｉｎ ｉｎ ｓｕｂｄｏｍａｉｎ ＩＩＡ［Ｊ］．Ｊ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ Ａ，２００４，７４（１）：３９—４５． ［４］张怀斌，丽英，荣先国．灯盏花素与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究［Ｊ］．化学研究，２０１２，２３（２）：１３～１６． ［５］马亚娣，张国文，刘钰红．乙基麦芽酚与牛血清白蛋白相互作用的光谱［Ｊ］．南昌大学学报，２０１１，３５（６）：５４５—５４９． ［６］余军平．荧光光谱法在药物分析及药物与生物分子作用中的应用研究［Ｄ］．武汉：武汉大学，２００４． ［７］龚盛昭．黄酮类化合物保健食品大有开发价值［Ｊ］．广州食品工业科技，２００７，１８（１）：６３～６４． ［８］宋慧，李勇．黄酮类化合物的保健作用［Ｊ］．中国食品与营养，２００４，４（１１）：４５～４７． ［９３马世昌．化学物质辞典［Ｍ］．陕西：陕西科学技术出版社，１９９９：２４６． ［１Ｏ］索志荣，郑建斌，朱小红．复方三维亚油酸胶丸Ｉ中甲基橙皮苷和维生素Ｃ的ＨＰＬＣ分析［Ｊ］．药物分析杂志，２００５，２５ （９）：１Ｏ１２—１０１４． ［１１３刘家琴，圈建，边清泉，等．马兜铃酸与牛血清白蛋白的相互作用研究［Ｊ］．光谱学与光谱分析，２００６，２６（４）：７１５—７１９． 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