病毒学检验

◼ 病毒 是一类光学显微镜下不可见，专性细胞内寄生的非细胞型微生物。

特点：①极小（10~300 nm）；②能与细胞受体结合；③酶系统缺失或不全；

④离体条件下以无生命的大分子形式存在；⑤通过复制进行增殖。

形态：多数呈球状或近似球状，少数为杆状、丝状、子弹状，细菌噬菌体呈蝌蚪状。 1. 病毒变异 包括遗传漂变和遗传转移。

◼ 遗传漂变 由于基因组复制时发生碱基变异所导致，其引起的抗原变异，称为抗原漂变。 ——持续渐进的 ◼ 遗传转移 由于基因组重组（如片段交换）引起。——快速变异（如流感病毒）

第一章 细胞培养技术

一、细胞培养技术

◼ 细胞培养技术 是模拟体内生理环境条件，提供细胞适宜的营养和温度条件，在无菌操作的基础上，使立

体组织细胞生长增殖并进行传代的技术。 1. 体外培养细胞的组织来源

（1）胚胎或成体组织；（2）正常或肿瘤组织 2. 体外培养细胞的生物学特性

（1）细胞异质性：来源于同一组织或不同组织的细胞之间均存在差异。 （2）细胞的增殖与分化 （3）细胞生长特征与形态

①贴壁型生长：形态贴壁依赖性，分为上皮样细胞型（呈不规则多角形）、成纤维细胞型（梭形三角形） 生长接触性抑制→单层生长；密度抑制→停止生长 贴壁过程：重力作用→细胞下沉至瓶底→分泌细胞外基质和黏附分子→贴壁 ②悬浮型生长：淋巴细胞、白细胞以及部分肿瘤细胞（黏附分子不表达） 适合于大规模细胞培养，便于细胞传代 3. 体外细胞培养生长增殖过程

（1）细胞周期：G1期（DNA合成前期）→S期（DNA合成期）→G2期（前期）→M期（前期） （2）细胞一代周期：两次传代接种间隔的时间，分为迟缓期、对数期、平衡期和衰亡期。 根据贴壁状况、细胞界限、折光率、胞内颗粒来判断。 （3）细胞的生命周期 原代培养期：从初次培养到第一次传代培养。异质性→单一性 传代培养期：中间 衰亡期：出现细胞凋亡，即细胞程序性死亡。 4. 体外培养细胞的基本条件

（1）细胞接种——对数期的细胞

（2）营养物质——天然营养液、合成培养基

①天然培养液——主要为血清（血浆去除纤维蛋白） 作用：提供基本营养与结合蛋白；提供激素及各类生长因子；提供促进细胞壁的蛋白；提供抗损害的保护性物质；提供蛋白酶抑制物质；提供pH缓冲物质。

②合成培养基——DMEM、MEM、RPMI10 ③无血清培养液

（3）酸碱度——7.0~7.4，主要为CO2-NaHCO3系统。 （4）气体——O2和CO2（5%） （5）温度——35~37℃

（6） 水 ——去离子水或三蒸水（电阻率达到18.2MΩ·cm）

（7）抗生素——青、链霉素或庆大霉素抑制细菌，两性霉素B抑制真菌，卡那霉素抑制支原体

（8）实验室——正压状态（避免外界微生物污染） （9）其他常用试剂

①平衡盐溶液（BSS）——Hanks、PBS，用于配制细胞生长液和含胰蛋白酶的基础溶液；洗涤组织和细胞。 ②消化液——胰蛋白酶、EDTA、胰酶-EDTA消化液（时间过短不能充分解离细胞，过长易损害细胞） ③指示剂——0.4%的酚红溶液 ④pH调整液——NaHCO3溶液 5. 实验流程

新鲜组织小块/单层细胞→ 单个细胞（→ ）→ 贴瓶→ 繁殖(5%CO2培养)→ 观察

6. 细胞的冻存、复苏和运输

（1）冻存：对数期细胞、缓慢冰冻避免细胞受到严重损伤。 （2）复苏：快速融化。 7. 污染来源

（1）组织：分离的组织本身可能存在潜伏感染的病毒。 （2）血清和消化液：由于多来源于

和

，潜伏病毒或支原体。

胰酶、EDTA

细胞活力检测

生长条件

（3）操作：周围环境或不规范操作。 （4）空气：空气微生物（如真菌孢子）。 （5）器材：要求无毒无害。

二、细胞培养技术在病毒学检验中的应用

1. 病毒的分离培养和鉴定

（1）敏感细胞——敏感性和可获得性——MDCK：狗肾细胞。 （2）标本前处理——无菌清液 （3）敏感细胞单层培养——生长液；标本接种——维持液。 （4）病毒鉴定方法 ①细胞病变CPE：指病毒侵染敏感细胞后，细胞出现聚集、脱落、融合等改变。 包括细胞圆缩、细胞聚合、细胞融合形成合胞体。 ②红细胞吸附试验 ③干扰试验：一种病毒感染细胞后，可以干扰另一种病毒在该细胞内的增殖。 ④中和试验：病毒被特异性标准血清中和。 2. 病毒定量检测 （1）空斑试验

第二章 鸡胚和动物接种技术

一、鸡胚接种技术

优点：鸡胚为一机体；组织分化程度低，易于病毒繁殖；来源充足，很少携带细菌和病毒，不产生抗体。

缺点：鸡胚本身可能有病毒；不能对所有病毒进行接种培养；除痘病毒外，不产生特异性的感染指征；鸡胚内可能存有抗生素，抑制立克次体及鹦鹉热等病原体。

1. 鸡胚来源：健康来亨鸡受精卵，病毒接种选择无特定病原体鸡群（SPF鸡群） 2. 孵育温度：38~39℃；湿度：40~70%。

3. 鸡胚接种程序：检卵→划记号→消毒→打孔或开口→接种→封口→培养→收获 4. 接种途径与方法

（1）羊膜腔接种——从临床材料中分离流感病毒。

（2）绒毛尿囊膜接种——牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离→肉眼可见的斑点或痘疱状病灶。 （3）尿囊腔接种——流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养。 （4）卵黄囊接种——虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离与繁殖。

5. 鸡胚死亡的情况 （1）病毒增殖的结果 （2）操作不当

（3）标本毒性——通过稀释去除

（4）细菌污染——尿囊液灰混、鸡胚无光泽。 6. 病毒的检测

（1）无菌试验——证实鸡胚收获物是否收到细菌的污染。（24小时内鸡胚死亡由于操作不当） （2）病毒检测 A. 直接观察法 特殊的增生性损害或痘疱；引起鸡胚死亡；胚胎生长迟缓。 B. 实验检测法 血凝试验、血凝抑制试验。

二、动物接种技术

◼ 实验动物 一般指经人工饲养，遗传背景明确、来源清楚，控制其携带的微生物，用于科学研究、教学、

生产、鉴定以及其他科学实验的所有动物。

优势：较好的敏感性，较好的重复性和反应的一致性。

1. 微生物等级分类 （1）普通动物（CV）； （2）清洁动物（CL）； （3）无特定病原体动物（SPF）； （4）无菌动物（GF）和悉生动物（GN）。 2. 遗传学控制分类

（1）近交系：指经过连续20代以上全同胞或亲自交配培育的动物品系。基因型相同，表现型一致。 （2）封闭群（远交群）：指在不从其内部引入新个体的条件下，以非近亲交配方式至少连续繁殖4代以上生产的一个实验动物种群。群体遗传特异性相对稳定，个体间具有很高杂合性。 （3）突变系：遗传基因发生突变而具有某种特殊性状表型的动物。

（4）杂交群动物：不同品系之间杂交产生的后代。实验结果重复性好，适应实验范围更大。 （5）转基因动物：外源性基因插入生殖细胞基因组并正常繁衍的动物。另外有基因缺陷动物。 3. 常用实验动物

（1）小鼠 近交系BALB/c、突变系nude（裸鼠）、封闭群KM。 （2）豚鼠 （3）家兔

4. 实验动物的标本选择 原则：（1）近，尽量取自病变部位或近病变部位。 （2）多，标本不能太少，病程急性期与恢复期均需采集。 （3）净，避免污染标本，特别在病毒分离和PCR时。 5. 动物选择的原则

3R原则：替代（replace）、减少（reduce）、优化（refine） 6. 动物实验设计原则

对照、重复、随机

第三章 病毒核酸检测与分析技术

一、核酸扩增技术

第四章 病毒类型与复制特点

1. 除双链RNA病毒（轮状病毒）吸附经膜内吞形成胞内体水解释放RNA，其余病毒均为吸附穿入脱壳释放核酸进入细胞。

（1）病毒核酸的复制与转录；（2）核酸翻译蛋白质；（3）核酸与蛋白质的组装。 2. 正链是指其核酸碱基排列顺序与mRNA相同的单链核酸。 3. 病毒结构包括核心（核酸）和衣壳（蛋白质，由壳粒组成），包膜病毒还包括包膜，其上有刺突（含致病性）。

第六章 呼吸道感染病毒

1. 多为-ssRNA病毒，有包膜和刺突，

腺病毒和疱疹病毒为dsDNA病毒，腺病毒和鼻病毒无包膜和刺突。 麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、风疹病毒可经呼吸道引发全身感染。 2. 临床表现：普通感冒症、咽炎、气管炎、肺炎、急性中耳炎等 3. 标本采集：鼻、咽拭子及含漱液（发病初始的三天）；痰液（晨痰）；支气管肺泡灌洗液；血液（双份血清，0~7天急性期及2~4周恢复期）；胸腔穿刺液。

一、正黏病毒（流感病毒）

1. 黏病毒：指对红细胞表面的黏蛋白有亲和性。

2. 正黏病毒：为-ssRNA，分节段，甲、乙8节段，丙7节段。

根据病毒基质蛋白（MP）和核蛋白（NP）分为甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。

甲流→人、哺乳动物和禽类 乙流、丙流→人

甲型流感病毒根据血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）分为若干亚型

乙型流感病毒不分亚型，但根据HA的抗原性分为Victoria和Yamagata两个系统。 丙型流感病毒不分亚型。

命名：型别/宿主/分离地点/毒株序号/分离年代（HA和NA亚型），宿主为人可不写。 如：甲型，A/京/1/68（H3N2）；乙型，B/京/1/87；丙型，C/猪/京/32/87。 3. 形态与结构

形态：初分离时形态多样，大多为球形或椭圆形，病毒核衣壳呈螺旋对称。 甲型流感病毒包膜上有约500个向外呈放射状排列的突起（糖蛋白）。 （1）血凝素（HA）：杆状突起，共16种，节段4编码。

功能：①吸附细胞；②介导包膜与细胞内涵体膜融合，释放核衣壳；③刺激机体产生中和抗体。

（2）神经氨酸酶（NA）：蘑菇状突起，共9种，节段6编码。 功能：①水解病毒颗粒及细胞表面糖蛋白末端的唾液酸，帮助病毒芽生释放，防止病毒颗粒凝集； ②液化呼吸道黏液，利于病毒扩散；③刺激产生抗体，抑制子代病毒的释放与扩散。 （3）基质蛋白（MP）：链接病毒包膜与病毒核心的结构蛋白。

其中M2蛋白有离子通道功能，影响病毒复制。金刚烷胺可作用于M2蛋白的穿膜结构域阻断离子通道功能抑制病毒复制。 4. 病毒的变异 （1）抗原漂移 HA和NA分子内的点突变，每年季节性流感反复发生的原因，一般不引起大流行。 （2）抗原转变 不同来源的流感毒株各节段之间重新组合形成新的流感病毒亚型，可引起大流行。 5. 流行病学特征

（1）传染源：患者及隐性感染者； （2）传播途径：空气飞沫传播；

（3）易感人群：普遍易感，与禽类相关感染接触人群为高暴露人群。

二、副黏病毒

1. 主要引起婴儿和儿童的感染。 2. 形态与结构

（1）一般呈球形，体积较正黏病毒更大，核衣壳呈螺旋对称。 （2）有包膜，其上有血凝素-神经氨酸酶（HN）、融合蛋白（FP）和基质蛋白（MP） 3. -ssRNA，不分节段。

三、冠状病毒

1. 病毒外膜呈皇冠状突起，包膜上有刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、血凝素-乙酰酯酶（HE）； 2. 病毒基因组为+ssRNA，不分节段。

3. 空气飞沫、接触传播。

四、实验室检测

1. 直接检测病毒 （1）显微镜观察；（2）免疫（荧光、酶）；（3）核酸检测技术 2. 病毒分离培养 主要使用细胞培养，而鸡胚培养大多用于疫苗生产。 （1）流感病毒：MDCK狗肾细胞； 3. 病毒鉴定与分型

（1）免疫学方法——血清型分型；（补体结合试验、中和试验、血凝素抑制试验、ELISA） （2）核酸检测方法——基因型分型。

第七章 胃肠道感染病毒

包括肠道病毒和急性胃肠炎病毒。

一、肠道病毒

小RNA病毒科，+ssRNA，球形，呈二十面体立体对称。经消化道感染，引起胃肠道和其他器官病变。 1. 分类命名：脊髓灰质炎病毒（PV）、柯萨奇病毒A/B组（CV-A/B）、埃可病毒（echovirus，ECHO）和新型EV。 2. 临床表现

（1）脊髓灰质炎（poliomyelitis）：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PV引起； （2）手足口病（HFMD）：CV-A16和EV-A71； （3）无菌性脑膜炎（aseptic meningitis）：大部分EV均可引起。 （4）无菌性脑炎（aseptic encephalitis）：CV-A5/9/16，ECHO4/6/9/16/30。 （5）病毒性心肌炎（viral myocarditis）：CV-B2~5为主。 （6）呼吸道感染 3. 标本采集

（1）粪便，发病7日内；（2）咽拭子，发病3日内；（3）血清，急性期0~7天，恢复期14~30天。 4. 脊髓灰质炎病毒 5. 实验室检测

（1）前处理：粪便样本需事先用三氯甲烷处理，咽拭子要在标本运输液中充分搅动。 （2）分离鉴定：常用人横纹肌肉瘤系、非洲绿猴肾细胞系、L20B等；CV-A→乳鼠。 （3）核酸检测；

（4）型别鉴定：血清中和试验、体外核酸扩增和基因测序等

（5）血清学检测：恢复期血清特异中和抗体的4倍或4倍以上升高作为EV感染的血清学诊断依据。

二、腹泻病毒

1. 临床表现：水样泻、呕吐、厌食、腹痛、无力、肌肉酸痛

2. 标本采集：粪便标本、呕吐物、血清，肛拭子含病毒颗粒较少，不如粪便直接。 3. 轮状病毒：dsRNA，呈节段状，根据VP6蛋白抗原表位分为A~G7组。 A组轮状病毒主要引起婴幼儿肠胃炎。粪-口传播，发病高峰为寒冷季节。 4. 杯状病毒：+ssRNA，引起人类感染的有札如病毒和诺如病毒。 粪-口传播、直接传播或空气传播。

5. 星状病毒：+ssRNA；肠道腺病毒：dsDNA。 6. 实验室检测

（1）前处理：粪便稀释成10%的悬液。

（2）直接检测病毒：电镜、抗原检测、核酸检测

（3）病毒分离与鉴定：分离培养条件极为苛刻，极少使用，较多使用免疫学或分子生物学鉴定。 （4）血清学诊断：间隔2~4周的急性期与恢复期的血清抗体有4倍或以上的升高，表明急性感染。

第十章 肝炎病毒

指一组主要侵犯肝脏引起病毒性肝炎的病原体，其中有些也可引起脑、肺和心脏的损害。

1. 除HBV为不完全双链环状DNA病毒，HDV为单负链环状RNA病毒，HAV、HCV和HEV均为+ssRNA病毒。

2. HAV与HEV为粪-口传播，引起急性肝炎；

HBV、HCV、HDV为血液及性传播，引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌。 3. 临床表现：急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎、淤胆型肝炎、肝炎后肝硬化。 4. 标本采集：血清、粪便（HAV、HEV）、肝脏活检和尸检标本、乳汁（HBV、HCV）、海产品（环境中）

一、甲型肝炎病毒（HAV）

1. +ssRNA，无包膜、二十面体立体对称，电镜下分为实心颗粒（完整病毒，有感染性和抗原性）和空心颗粒（无核酸，无感染性、有抗原性）。

2. 仅有1个血清型，有7个基因型。

3. 对外界环境抵抗力较强，对UV、70% EtOH、5~8% CH3OH敏感。 4. 流行病学特征

（1）传染源：急性期患者和隐性感染者 （2）传播途径：粪-口传播 （3）易感人群：儿童和青年

（4）流行特征：呈世界性流行，秋末冬初为发病高峰期。

二、乙型肝炎病毒（HBV）

1. 不完全双链环状DNA病毒，无包膜、电镜下分为大球形颗粒（Dane颗粒，完整的HBV颗粒，有感染性和抗原性）、小球形颗粒（病毒外衣壳，有抗原性、无感染性）和管型颗粒（小球形颗粒“串联”而成） 2. 大球形颗粒（Dane颗粒）

有双层衣壳，由双层脂质和蛋白质组成。 （1）HBsAg——脂双层内；（2）HBcAg——内衣壳即核衣壳；（3）HBcAg——经酶或去垢剂处理暴露出来。 HBsAg和HBeAg可由肝细胞分泌至血清，HBcAg仅存在于感染的干细胞中。 3. 病毒基因组：不完全环状双链DNA，分为S+和L-链。 4. HBV的复制

共价闭合环状DNA 以(-)DNA为模板 DNA聚合酶

HBV DNA 两种mRNA、亚基因组和全基因组

（cccDNA） RNA聚合酶Ⅱ S+延长修补 RNA）

3.5kb pgRNA 组装成熟 复制 逆转录出L- 翻译蛋白质，组装出核心颗粒 +

HBV S

DNA聚合酶 释放

5. 流行病学特征

（1）传染源：乙型肝炎患者和HBsAg携带者，传染性与HBV病毒载量有关； （2）传播途径：血液、母婴、性、密切接触传播；

（3）易感人群：乙肝高发区的各类人群，患者主要集中在青少年和30~40岁的成人； （4）流行特征：呈世界性流行，无季节性。

三、丙型肝炎病毒（HCV）

1. +ssRNA，有包膜和表面突起，对一般理化消毒剂均敏感。 2. 流行病学特征

（1）传染源：丙型肝炎患者和HCV阳性血制品； （2）传播途径：血液、母婴传播、性传播很少； （3）易感人群：普遍易感；

（4）流行特征：遍布全球，以印度次、中亚和东南亚为主。

四、丁型肝炎病毒（HDV）

1. 单负链环状RNA病毒，有包膜，缺陷病毒，不能复制，常与HBV联合感染或重叠感染。 2. 流行病学特征

（1）传染源：丁型肝炎患者和HDV携带者；

（2）传播途径：与HBV基本相同，主要经血液、亦可经体液、性传播； （3）流行特征：全球分布。

五、戊型肝炎病毒（HEV）

1. +ssRNA，无包膜，有实心与空心颗粒，对多种理化因素及消毒剂均敏感，可存在于肝内或胆汁内。 2. 2. 流行病学特征

（1）传染源：戊型肝炎患者和携带HEV的猪牛羊及啮齿类动物； （2）传播途径：粪-口传播；

（3）易感人群：青壮年，病死率位居所有病毒性肝炎的首位； （4）流行特征：全球分布，南亚及东南亚为高流行区。

六、实验室检测

1. 直接检测病毒

（1）固相免疫电镜；（2）检测抗原。 2. 病毒分离与鉴定

（1）实验动物：黑猩猩等灵长类动物； （2）细胞培养：人与猴肝、肾细胞；

（3）免疫电镜、RIA、ELISA、中和试验（HAV）、核酸检测、基因分型 3. 血清学诊断——HBV

（1）HBsAg：HBV感染的特异性标志； （2）抗-HBs：保护性抗体（重要）； （3）HBeAg：病毒复制和强感染性； （4）抗-HBe：保护性抗体（一定），预后良好的标志； （5）抗-HBc：表明存在感染。

大三阳 小三阳

HBsAg

抗-HBs

HBeAg

抗-HBe

抗HBc

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