大家好!我最近需要将一个基因的全长cDNA克隆. 我们打算:1.提RNA 2. 逆转录得到cDNA 3. 在cDNA的两端的非编码区设计引物
我们实验室技术不成熟,现在我想知道如何设计全长cDNA的引物, 我的cDNA长度是4000多bp,请高手帮忙.
或者哪个实验室是开放性的,并且在克隆全长cDNA 方面比较擅长,我想出去做,谢谢大家! 我是武汉的.
全长序列引物设计
1. 想要获得全长，那么需要将整个CDS(编码区)得到，那么上游引物可以加上起始密码子ATG，然后照抄全长前端20－22个碱基，而下游引物加上终止密码子TAA或是TAG(TAA是原核表达载体偏爱密码子，TAG是真核载体偏爱密码子)，如果要表达蛋白子作功能测定，那么最好使用TAG，建议使用TAG
2. 设计酶切位点，注意选择的载体酶切位点一定是目的片段中没有的（我的片断中只有HIDIII其余没有,所以可以选择EORI＆KNPI。（1）设计常用酶，可以完全切开的酶。（2）尽量避免目的片断前端有载体序列的插入，最好选择靠前的酶切位点，否则表达会影 \\ 其功能，而且要注意CG含量
3. 3。如果托载体序列中不含有ATG，那么上游引物设计应该还有ATG，如果载体序列中有ATG，那么会选择其向性设计引物。但是载体中只有接近T7启动子的ATG有起始作用， 4. HNP的结构信号太＋前蛋白＋成熟太 5. HNP-1(起始ATG,终止TGA) CDS 81..365
翻译蛋白质：MRTLAILAAILLVALQAQAEPLQARADEVAAAPEQIAADIPEVV atgaggaccc tcgccatcct tgctgccatt ctcctggtgg
121 ccctgcaggc ccaggctgag ccactccagg caagagctga tgaggttgct gcagccccgg 181 agcagattgc agcggacatc ccagaagtgg ttgtttccct tgcatgggac gaaagcttgg 241 ctccaaagca tccaggctca aggaaaaaca tggcctgcta ttgcagaata ccagcgtgca 301 ttgcaggaga acgtcgctat ggaacctgca tctaccaggg aagactctgg gcattctgct 361 gctga HNP-3
CDS86..370,翻译成蛋白就是MRTLAILAAILLVALQAQAEPLQARADEVAAAPEQIAADIPEVV atgag gaccctcgcc atccttgctg ccattctcct
121 ggtggccctg caggcccagg ctgagccact ccaggcaaga gctgatgagg ttgctgcagc 181 cccggagcag attgcagcgg acatcccaga agtggttgtt tcccttgcat gggacgaaag 241 cttggctcca aagcatccag gctcaaggaa aaacatggac tgctattgca gaataccagc 301 gtgcattgca ggagaacgtc gctatggaac ctgcatctac cagggaagac tctgggcatt 361 ctgctgctga
设计KNP1＆ECOR1的位点： KNP1:GGTACC,ECOR1:GAATTC CG计算含量：
（4×G/C+2*A/T-5） HNP-1
正向引物SP1：5'-ATGGAATTCGCCTGCTATTGCAGAATA-3'
反向引物AP1：5'- GTAGTCGACTCAGCAGCAGAATGCCC-3' 下划线为EcoRI（SP1），SalI（AP1） HNP-3
正向引物SP3: 5'- GCGGAATTCGACTGCTATTGCAGAATACC-3' 反向引物AP3: 5'- GATGACGACGCAGCAGAATGCCCAG-3'
5．设计引物的时候发现两个序列一致。然后下游引物是保护碱基＋酶切位点＋反相3‘末端，而且最好是22－23个
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