维普资讯 http://www.cqvip.com 苏州大学学报（医学版）２００２；２２（３） ２７５ 一氧化氮酶与神经生长因子对中枢神经细胞 保护作用的相关性研究 戴 德 （广东医学院附属医院耳鼻咽喉科，广东湛江５２４００１） 摘要：目的探讨一氧化氮酶（ＮＯＳ）与神经生长因子（ＮＧＦ）保护鼠小脑颗粒细胞（ｒＣＧＣ）作用机制的关系。方 法 向细胞培养仅２４ｈ的ｒＣＧＣ中，分别加入酒精、ＮＧＦ及一氧化氮酶抑制剂Ｎ 一硝基一Ｌ一精氨酸（ＮＡＭＥ）。 再经２４ｈ培养后，通过光学显微镜观察它们对细胞产生的影响。结果 ＮＧＦ能对ｒＣＧＣ产生保护作用，显著减少 酒精对细胞的杀死。但ＮＡＭＥ却能抑制ＮＧＦ的作用。结论 一氧化氮酶在ＮＧＦ保护ｒＣＧＣ抵抗酒精的神经毒 性过程中起着关键的作用。 关键词：神经生长因子；一氧化氮酶；小脑颗粒细胞；酒精；小鼠 中图分类号：Ｒ５９５．６文献标识码：Ａ文章编号：１０００—５７４９（２００２ｌ０３—０２７５—０３ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｎｅｕｒ０ｐｒ０ｔｅｃｔｉ０ｎ ｔｏ Ｒａｔ Ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ Ｇｒａｎｕｌｅ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＡＩ Ｄｅ （Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｔｏ Ｇｕａｎｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｚｈａｎｇｊｉａｎｇ， Ｇｕａｎｄｏｎｇ ５２４００ １，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＮＯＳ）ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｒｅｌａｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）ｏｎ ｒａｔ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｇｒａｎｕｌｅ ｃｅｌｌ（ｒＣＧＣ）ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｅ－ ｔｈｏｄｓ ｒＣＧＣ ｃｕｌｔｕｒｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓ ｂｅｆｏｒｅ ａｄｄｉｎｇ ｅｔｈａｎｏ１．ＮＧＦ ａｎｄ ＮＡＭＥ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｋｅｐｔ ｉｎ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ｉｎ ｓｅａｌｅｄ ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ ｆｏｒ ａｎｏｔｈｅｒ ２４ ｈｏｕｒｓ．Ａｆｔｅｒ ｔｈａｔ．ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｕｎｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＮＧＦ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｈａｖｅ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆ— ｆｅｃｔ ｏｎ ｒＣＧＣ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｉｎｃｅ ｉｔ ｍｉｇｈｔ ｒｅｄｕｃｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ．ＮＡＭＥ，ａ ＮＯＳ ｉｎ— ｈｉｂｉｔｏｒ，ｃｏｕｌｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ＮＧＦ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＮＯＳ ｍａｙ ｐｌａｙ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＮＧＦ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｒＣＧＣ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｇｒａｎｕｌｅ ｃｅｌｌ；ｅｔｈａｎｏｌ；ｒａｔ 孕妇酗酒可导致胎儿中枢神经系统发育障碍， 但酒精的毒性作用机制未明。研究表明一氧化氮 （ＮＯ）与神经细胞的存活有关，现已知小脑颗粒细胞 上含有ＮＭＤＡ（Ｎ—Ｍｅｔｈｙｌ—Ｄ—ａｓｐａｒｔａｔｅ）受体，当 其被激活后可令Ｃａ２ 大量进入细胞，转而激活一氧 化氮酶（ＮＯＳ），产生ＮＯ。由于神经生长因子 （ＮＧＦ）能通过维持细胞内Ｃａ２ 浓度的平衡而对中 １材料和方法 １．１ 细胞模型及分组 由于出生时间较久（如 １６ｄ）的小鼠ｒＣＧＣ对酒精的耐受性较高，因而本文 选用出生１０ｄ、健康Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ小白鼠１２只， 体重１２～１５ｇ，ｒＣＧＣ的提取和培养物的设置按照 Ｐａｎｔａｚｉｓｌ２ Ｊ的方法。实验分为２组（无酒精组和酒精 组），每组又分为４小组（空白对照组、ＮＧＦ组、 ＮＡＭＥ组和ＮＧＦ＋ＮＡＭＥ组）。细胞被置于９６孔 型培养皿中，每孔加入０、３ｍｌ培养液，含有细胞４．６ 枢神经细胞提供保护作用…，故我们观察了ＮＧＦ 和酒精对鼠小脑颗粒细胞（ｒＣＧＣ）存活的影响，并就 ＮＯＳ与ＮＧＦ作用之间的联系进行了讨论。 收稿日期：２００２—０１—３０作者简介：戴￣（１９６５一），男，湖南常德人，主治医师，医学硕士，从事与一氧化氮有关的神经病理学研究 维普资讯 http://www.cqvip.com ２７６ ＳＵＺＨＯＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００２；２２（３） ×１０ 个／ｍｌ，为避免血清中所含物质对实验结果的 １．３ 统计学处理 采用ＳＡＳ／ＳＴＡＴ Ｍｉｘｅｄ软件的 潜在影响，选择非血清性培养液。 三因素方差分析和组间Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ检验进行显著性 １．２ 方法 细胞培养物置于３７℃恒温箱内２４ｈ 检验。 后．向酒精组中加入９５％酒精ｌＯ，ｕｌ（使标本酒精浓 ２结果 度达４００ｍｇ／Ｌ），尽管低浓度的酒精（１００ ｍｇ／Ｌ和 ２００ ｍｇ／Ｌ）亦能杀死ｒＣＧＣ（程度略低于高浓度酒 ２．１ 在无酒精组中，无论是浓度３０ｕｇ／Ｌ ＮＧＦ或 精），但为减少实验次数，简化实验操作，故选用高浓 １００ ｍｏｌ／Ｌ的ＮＡＭＥ均对细胞的生存无显著影 度酒精。将浓度１０００￣ｇ／Ｌ的ＮＧＦ（购自Ｐ＆Ｄ Ｓｙｓ— 响。 ｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）１０“ｌ和浓度为３４００ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ的ＮＯＳ抑制 ２．２在酒精组中，２４ ｈ的酒精作用可减少空白对 剂Ｎ。一硝基一Ｌ一精氨酸（Ｎ。一ｎｉｔｒｏ—Ｌ—ａｒｇｉｎｉｎｅ 照组中的细胞数（较相应无酒精空白对照组减少 ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ，ＮＡＭＥ；购自Ｓｉｇｍａ）１０ ｌ同时分别 ２６．９％），提示酒精对ｒＣＧＣ具有神经毒性作用。 加入各相应实验组。随后，将所有细胞培养物存放 ＮＧＦ可限制这种损害作用，使细胞损失减少至仅占 于密封容器中，再留置于３７℃恒温箱内２４ｈ。 相对应的无酒精组细胞数的９．１％，明显低于空白 细胞收集步骤按既往的方法 Ｊ，细胞计数采用 对照组２６．９％的细胞损失率（Ｐ＜０．０１），提示ＮＧＦ 红细胞计数器和台盼蓝（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ）染色法。 具有神经保护作用（见附表）。 附表ＮＧＦ、ＮＡＭＥ和酒精对ｒＣＧＣ存活的影响（ｎ：７，；±Ｓ） ＊＊与空白对照组比较。Ｐ＜０．０１ ３讨论 活性并阻碍了ＮＭＤＡ对神经元的营养作用，因而促 进了细胞的凋亡。虽然在我们的另一项实验研究中 ｒＣＧＣ上存在着ＮＭＤＡ受体，该受体对Ｎａ 、 发现细胞凋亡现象存在于仅１天的ｒＣＧＣ培养物 Ｋ 和Ｃａ２ 均有通透性，当被激活后可导致大量 中，但对细胞核的荧光标记检验却显示酒精并不能 Ｃａ 进入细胞，从而激活ＮＯＳ，产生ＮＯ。近来的报 增加凋亡细胞的比例。相反，在酒精组标本内所观 道显示ＮＯ是一种作用广泛的内源性物质，它参与 察到的大量破碎、固缩的细胞核提示酒精是造成细 机体生理调节，影响多种疾病的病理生理过程，并能 胞坏死（而非凋亡）的重要原因。因此我们认为 产生不同的结果。ＮＯ的这种复杂表现被认为是因 ＮＧＦ的神经保护作用可能是由于对抗了这种细胞 细胞的种类及成熟程度的不同而异，并且与ＮＯ的 坏死的过程。 作用浓度相关。 ． 由于ｒＣＧＣ在培养过程中并不增殖，空白对照 本实验中选用了低Ｋ （５ｍｍｏｌ／Ｌ）、不含谷氨 组在酒精的作用下产生约２７％的细胞损失，ＮＧＦ能 酸和天冬氨酸（两者均为ＮＭＤＡ受体的激活物）的 将这种损失显著性地降低至９，１％，从而拮抗了酒 非血清性培养液。因此，ＮＧＦ的作用可以排除是由 精对ｒＣＧＣ的神经毒性作用。ＮＡＭＥ则能消除 于高Ｋ 所引起 Ｊ，而酒精的毒性作用则可排除是 ＮＧＦ的神经保护作用，表明ＮＧＦ有可能是通过 因阻碍细胞培养液中的ＮＭＤＡ受体活化物与受体 ＮＯＳ生成ＮＯ而保护了细胞。有报道酒精可抑制 相结合所产生。鉴于单独加入ＮＡＭＥ并不能影响 ＮＭＤＡ受体的活性，引起细胞内Ｃａ 的降低而导 或加重细胞的损失，提示酒精的毒性作用似乎并非 致细胞死亡 Ｊ。ＮＧＦ可能因纠正了Ｃａ 的失衡而 因抑制了ＮＯＳ所造成的。 保护了细胞…。我们认为ＮＧＦ的神经保护作用有 酒精对神经元细胞的毒性作用机制尚未清楚。 可能是作用于ＮＭＤＡ受体，使Ｃａ 进入细胞，从而 Ｂｈａｖｅ等 Ｊ认为酒精可能是抑制了ＮＭＤＡ受体的 激活ＮＯＳ，生成ＮＯ而产生的。 维普资讯 http://www.cqvip.com 苏州大学学报（医学版）２００２；２２（３） ２７７ ＮＧＦ能保护ＰＣ１２细胞抵抗酒精的杀灭作用， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ— 其机制可能与ＮＧＦ促ＰＣ１２细胞分化成熟有关。 然而我们发现培养了４天的细胞（较成熟）自备抵抗 酒精毒性的能力，当ＮＯ生成被抑制时，抵抗力则消 ｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｌｅｖｅｌｓ［Ｊ］．ＡＩｃｏｈｏｌ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｅｓ，１９９６，２０： １３８５——１３９４ ［２］Ｐａｎｔａｚｉｓ ＮＪ，Ｏｏｈｒｍａｎ ＤＰ，Ｌｕｏ Ｊ，ｅｔ １．Ｎ—ｍｅｔａｈｙｌ—Ｄ —ａｓｐａｒｔａｔｅ（ＮＭＤＡ）ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｌｃｏｈｏｌ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ 失。显示细胞信息传导物质，而非细胞分化成熟在 此保护作用中扮演了重要角色。 ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｇｒａｎｕｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｈｕｒｅ［Ｊ］．Ａｌｃｏｈｏｌ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｅｓ，１９９５，１９：８４６～８５３ 活体动物实验发现，ＮＯＳ抑制剂能加重酒精导 致的鼠大脑神经元退化 ６ Ｊ。认为ＮＯ能对抗酒精的 毒性而具有神经保护作用。同样，我们发现通过 ＮＡＭＥ对ＮＯＳ的抑制，结果能消除ＮＧＦ拮抗酒精 对神经元细胞毒性影响的保护作用，表明ＮＯＳ在 ＮＧＦ的保护过程中发挥了重要的作用。而ＮＧＦ的 作用是否通过一氧化氮一环鸟苷酸通路（ＮＯ— ［３］ Ｋｕｂｏ Ｔ，Ｎｏｎｏｍｕｒａ Ｔ，Ｅｎｏｋｉｄｏ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｂｒａｉｎ—ｄｅ— ｐｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）ｃａｎ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｒａｔ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｇｒａｎｕｌｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｃｕｈｕｒｅ［Ｊ］．Ｄｅｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，１９９５，８５：２４９～２５８ ［４］Ｂｈａｖｅ ＳＶ，Ｈｏｆｆｍａｎ ＰＬ．Ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｇｒａｎｕｌｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒｏｐｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＮＭＤＡ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，１９９７，６８：５７８～５８６ ［５］Ｌｏｖｉｎｇｅｒ ＤＭ，Ｗｈｉｔｅ Ｇ，Ｗｅｉｇｈｔ ＦＦ．Ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＭＤＡ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｃＧＭＰ通路）而得到体现，尚待进一步的研究。 （美国爱荷华大学医学院解剖及细胞生物系Ｎ． Ｊ．Ｐａｎｔａｚｉｓ教授提供实验药品及动物，谨致感谢） 参考文献： ［１】Ｗｅｂｂ Ｂ，Ｓｕａｒｅｚ ＳＳ，Ｈｅａｔｏｎ ＭＢ，ｅｔ ａ１．Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｉｘ）ｓｔｎａ— ｔａｌ ｒａｔ ｍｅｄｉａｌ ｓｅｐｔａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ａｃｕｔｅ ｅｔｈａｎｏｌ ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４３：１７２１～１７２４ ［６］Ｚｏｕ ＪＹ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＤＢ，Ｎｅａｆｓｅｙ ＥＪ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｎｇｅ ｅｔｈａｎｏｌ ——ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｒａｔｓ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｎｉ— ｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ［Ｊ］．Ａｌｃｏｈｏｌ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｅｓ，１９９６，２０： １４０６～１４１１ ｃ ｃ、 一 ｃＥ、 ： ’ （上接第２７４页） １．３处理对所有围手术期梅毒患者均在手术前请皮肤性 病科医师会诊并给予苄星青霉素臀部肌注治疗。３８例患者 均在一边抗梅治疗的同时一边进行手术，术后均恢复良好， 痊愈出院。患者出院后继续定期到性病防治专业机构或皮 肤科复查随访，直至梅毒痊愈。 ２讨论 术中和术后的医疗和护理过程中，加强医护人员的防护措 施，严格消毒程序，从而控制了医源性传染。到目前为止，我 院尚未发现因医源性接触而感染梅毒的医护人员和患者。 可见，我们通过对围手术期患者进行梅毒血清学检测，一方 面加强院内感染的预防，另一方面，可以使一些无症状和症 状不明显的梅毒患者，及时发现，尽早治疗，一定程度上也遏 制了性病的流行与蔓延。 通过我院对３８例梅毒患者术前和术后的监测比较，可 以得出一个结论，早期梅毒患者可以在一边治疗的情况下一 边进行手术，而不必等到抗梅转阴后再手术，早期梅毒对术 后的恢复没有很大影响。另外，对检测出的梅毒阳性患者， 均做出提示标记，提醒医护人员加强防范措施，同时使手术 室对用过的器械加强消毒工作，从多途径控制了梅毒的医源 性传染可能。因此，我们认为对围手术期患者开展梅毒血清 学监测，应该成为外科术前一项很重要的常规检测。 参考文献： 梅毒的传播途径主要是通过性接触而感染，其次为经胎 盘引起胎儿的先天性感染，但少数也可发生医源性感染，包 括医务工作者自身感染和感染患者。该途径主要由以下原 因造成：（１）防护不严格：检查和处置性病患者时应做必要的 防护，如穿工作服、带手套等。否则如果手部有皮肤损伤直 接接触患者更加危险，所以一定要做好防护。（２）消毒不严 格：性病患者用过的注射器和针头或其他医疗器械，如消毒 不彻底也易造成传染。（３）医源性外伤：在为性病患者注射、 换药、手术或检查时不慎重，带有病原体的器械损伤操作者， 容易造成医务工作者自身感染…。对此，我院外科对围手术 期患者开展梅毒血清学监测，尽早发现一些无症状和症状不 明显的梅毒患者，对这类手术患者术前积极实施抗梅治疗， ［１］赵辨．临床皮肤病学［Ｍ］．第３版，南京：江苏科学技 术出版社，２００１：５１３～５１４
