(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112342261 A(43)申请公布日 2021.02.09
(21)申请号 202011272773.7(22)申请日 2020.11.12
(71)申请人 湖南新合新生物医药有限公司
地址 415400 湖南省常德市津市市嘉山工
业新区(72)发明人 吴亚克 孟浩 刘喜荣 曾春玲
靳志忠 刘家贝 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理
有限公司 44224
代理人 隆前进(51)Int.Cl.
C12P 33/10(2006.01)C12P 33/02(2006.01)C12P 33/00(2006.01)C12P 39/00(2006.01)
权利要求书2页 说明书12页
C07J 5/00(2006.01)C12R 1/66(2006.01)C12R 1/645(2006.01)C12R 1/845(2006.01)C12R 1/06(2006.01)C12R 1/365(2006.01)
(54)发明名称
醋酸泼尼松的制备方法(57)摘要
本发明涉及一种醋酸泼尼松和泼尼松的制备方法，以孕甾‑4‑烯‑17α,21‑二醇‑3,20‑二酮‑21‑醋酸酯(RSA)为原料依次经过发酵羟化反应、发酵脱氢反应和氧化反应制得醋酸泼尼松，该制备方法采用生物发酵技术替代化学合成，无需经过上碘再置换的步骤，合成路线短，转化率高，经济环保，成本低，可有效提高收率和纯度，适合于工业化生产，具有很高的工业化价值。
CN 112342261 ACN 112342261 A
权 利 要 求 书
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1.一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以式(Ⅰ)化合物为原料经过第一生物发酵发生羟化反应，制备式(Ⅱ)化合物；将式(Ⅱ)化合物进行第二生物发酵发生脱氢反应，制备式(Ⅲ)化合物；将式(Ⅲ)化合物进行氧化反应，制备式(IV)化合物醋酸泼尼松；所述式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物、式(Ⅲ)化合物和式(IV)化合物的结构如下：
2.如权利要求1所述的醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，所述第一生物发酵使用的菌选自赭曲霉菌、金龟子绿僵霉菌和黑根霉菌中的一种。
3.如权利要求2所述的醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，所述第一生物发酵包括如下步骤：
第一斜面培养：将菌在第一斜面划线接种，培养；第一种子培养：将斜面孢子洗下，制成孢子悬液，按接种量8％～12％接种，置于25℃～35℃，180rpm～200rpm摇床培养36h～48h；所述孢子悬液浓度为2～3×107个/ml；
第一菌体预培养：在发酵罐内加入发酵液，按接种量4％～6％接种，培养12h～20h；培养条件为：温度25℃～35℃，空气流量0.3m3/h～0.5m3/h，罐压0.03MPa～0.07MPa，转速280rpm～320rpm；
第一转化：火圈保护下，将式(Ⅰ)化合物加入到培养好的菌液中转化72h～120h；培养条件为：25℃～35℃，空气流量0.3m3/h～0.5m3/h，罐压0.03MPa～0.07MPa，转速280rpm～320rpm。
4.如权利要求3所述的醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，所述第一斜面培养的培养基组分为土豆150g/L～250g/L和葡萄糖15g/L～25g/L，pH值为6.5±0.2；
所述第一种子培养和所述第一菌体预培养的培养基组分均为玉米浆8g/L～12g/L和葡萄糖25g/L～35g/L，pH值为7.2±0.2。
5.如权利要求4所述的醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，所述第一斜面培养的培养基组分为土豆200g/L和葡萄糖20g/L，pH值为6.5；
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权 利 要 求 书
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所述第一种子培养和所述第一菌体预培养的培养基组分均为玉米浆10g/L和葡萄糖30g/L，pH值为7.2。
6.如权利要求1～5任一项所述的醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，所述第二生物发酵使用的菌选自简单节杆菌和诺卡氏菌中的一种。
7.如权利要求1～5任一项所述的醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，所述第二生物发酵包括第二斜面培养、第二种子培养、第二菌体预培养和第二转化，所述第二种子培养包括一级种子培养和二级种子培养，具体步骤如下：
第二斜面培养：将菌在第二斜面划线接种，培养；一级种子培养：半支斜面入培养基，180rpm～200rpm，25℃～35℃培养18h～30h；二级种子培养：在180rpm～200rpm、25℃～35℃条件下培养16h～24h；第二菌体预培养：在发酵罐内加入发酵液，按接种量4％～6％接种，培养12h～24h；培养条件为：温度25℃～35℃，空气流量0.1m3/h～0.3m3/h，罐压0.03MPa～0.07MPa，转速280rpm～320rpm；
第二转化：火圈保护下，将式(Ⅱ)化合物加入到培养好的菌液中转化72h～120h；转化条件为：温度25℃～35℃，空气流量0.1m3/h～0.3m3/h，罐压0.03MPa～0.07MPa，转速280rpm～320rpm。
8.如权利要求1～5任一项所述的醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，所述第二斜面培养的培养基组分为葡萄糖1.1％～1.5％、酵母膏1.1％～1.5％和琼脂1.5％～2.5％，pH值为7.0±0.2；
所述一级种子培养的培养基组分为牛肉膏0.1％～0.5％和蛋白胨0.3％～0.7％，pH值为6.8±0.1；
所述二级种子培养的培养基组分为葡萄糖0.65％～0.69％、玉米浆0.8％～1.2％、蛋白胨0.65％～0.69％和磷酸二氢钾0.01％～0.02％，pH值为7.0±0.1；
所述第二菌体预培养的培养基组分为葡萄糖0.65％～0.69％、玉米浆0.8％～1.2％、蛋白胨0.65％～0.69％和磷酸二氢钾0.01％～0.02％，pH值为7.2±0.2。
9.如权利要求1～5任一项所述的醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，所述第二斜面培养的培养基组分为葡萄糖1.3％、酵母膏1.3％和琼脂2％，pH值为7；
所述一级种子培养的培养基组分为牛肉膏0.3％和蛋白胨0.5％，pH值为6.8；所述二级种子培养中的培养基组分为葡萄糖0.67％，玉米浆1％，蛋白胨0.67％和磷酸二氢钾0.01％，pH值为7.0；
所述第二菌体预培养的培养基组分为葡萄糖0.67％，玉米浆1％，蛋白胨0.67％和磷酸二氢钾0.01％，pH值为7.2。
10.如权利要求1～5任一项所述的醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
乙酸乙酯与式(Ⅲ)化合物混合，在-10℃～0℃加入琼斯试剂，于≤5℃反应2h～3h，反应完毕加亚硫酸钠猝灭反应。
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说 明 书醋酸泼尼松的制备方法
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技术领域
[0001]本发明涉及药物合成技术领域，特别是涉及一种醋酸泼尼松的制备方法。背景技术
[0002]醋酸泼尼松是一类重要的肾上腺皮质激素类药，具有抗炎、抗过敏、抗风湿、免疫抑制作用，主要用于各种急性严重细菌感染、严重过敏性疾病、胶原性疾病、风湿病、类风湿性关节炎、肾病综合征，严重支气管哮喘、血小板减少性紫癜、粒细胞减少症、急性淋巴性白血病、各种肾上腺皮质功能不全症、剥脱性皮炎、天疱疮、神经性皮炎、湿疹等。老年患有带状疱疹者发病早期可加用少量醋酸泼尼松，以缩短病程和防止后遗神经痛的发生。[0003]传统的醋酸泼尼松的制备方法分为生物转化和化学合成。其中，生物转化是通过可的松醋酸酯生物发酵脱氢得到，而叶松林等主编的《全国原料药工艺汇编》中公开了可的松醋酸酯由醋酸妊娠双烯醇酮经由8步反应合成，这种传统工艺路线长，收率低，而且可的松醋酸酣生物发酵脱氢难以完全转化，又与醋酸泼尼松性质接近，精制时很难除去，影响了产物的纯度和质量。化学合成步骤繁琐，起始原料成本较高，且通常都涉及上碘再置换的过程，而碘单质成本偏高，还会产生三废的问题，在工业上逐渐被淘汰。[0004]因此，开发一种原料廉价易得，合成路线短，转化率高，经济环保的醋酸泼尼松的制备方法具有重要意义。
发明内容
[0005]基于此，有必要提供一种醋酸泼尼松的制备方法，该合成方法起始物料廉价易得，合成路线短，转化率高，经济环保，适合于工业化生产。一种醋酸泼尼松的制备方法，包括以下步骤：
[0006]以式(Ⅰ)化合物为原料经过第一生物发酵发生羟化反应，制备式(Ⅱ)化合物；[0007]将式(Ⅱ)化合物进行第二生物发酵发生脱氢反应，制备式(Ⅲ)化合物；[0008]将式(Ⅲ)化合物进行氧化反应，制备式(IV)化合物醋酸泼尼松；[0009]所述式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物、式(Ⅲ)化合物和式(IV)化合物的结构如下：
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说 明 书
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[0010]
在其中一些实施例中，所述的醋酸泼尼松的制备方法中，所述第一生物发酵使用
的菌选自赭曲霉菌、金龟子绿僵霉菌和黑根霉菌中的一种。[0012]在其中一些实施例中，所述的醋酸泼尼松的制备方法中，所述第一生物发酵包括如下步骤：
[0013]第一斜面培养：将菌在第一斜面划线接种，培养；[0014]第一种子培养：将斜面孢子洗下，制成孢子悬液，按接种量8％～12％接种，置于25℃～35℃，180rpm～200rpm摇床培养36h～48h；所述孢子悬液浓度为2～3×107个/ml；[0015]第一菌体预培养：在发酵罐内加入发酵液，按接种量4％～6％接种，培养12 h～20h；培养条件为：温度25℃～35℃，空气流量0.3m3/h～0.5m3/h，罐压0.03 MPa～0.07MPa，转速280rpm～320rpm；[0016]第一转化：火圈保护下，将式(Ⅰ)化合物加入到培养好的菌液中转化72h～120 h；培养条件为：25℃～35℃，空气流量0.3m3/h～0.5m3/h，罐压0.03MPa～0.07 MPa，转速280rpm～320rpm。
[0017]在其中一些实施例中，所述的醋酸泼尼松的制备方法中，所述第一斜面培养的培养基组分为土豆150g/L～250g/L和葡萄糖15g/L～25g/L，pH值为6.5± 0.2；[0018]所述第一种子培养和所述第一菌体预培养的培养基组分均为玉米浆8 g/L～12g/L和葡萄糖25g/L～35g/L，pH值为7.2±0.2。[0019]在其中一些实施例中，所述的醋酸泼尼松的制备方法中，所述第一斜面培养的培养基组分为土豆200g/L和葡萄糖20g/L，pH值为6.5；
[0020]所述第一种子培养和所述第一菌体预培养的培养基组分均为玉米浆10g/L 和葡萄糖30g/L，pH值为7.2。
[0021]在其中一些实施例中，所述的醋酸泼尼松的制备方法中，所述第二生物发酵使用的菌选自简单节杆菌和诺卡氏菌中的一种。[0022]在其中一些实施例中，所述的醋酸泼尼松的制备方法中，所述第二生物发酵包括
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第二斜面培养、第二种子培养、第二菌体预培养和第二转化，所述第二种子培养包括一级种子培养和二级种子培养，具体步骤如下：[0023]第二斜面培养：将菌在第二斜面划线接种，培养；[0024]一级种子培养：半支斜面入培养基，180rpm～200rpm，25℃～35℃培养18 h～30h；[0025]二级种子培养：在180rpm～200rpm、25℃～35℃条件下培养16h～24h；[0026]第二菌体预培养：在发酵罐内加入发酵液，按接种量4％～6％接种，培养12 h～24h；培养条件为：温度25℃～35℃，空气流量0.1m3/h～0.3m3/h，罐压0.03 MPa～0.07MPa，转速280rpm～320rpm；[0027]第二转化：火圈保护下，将式(Ⅱ)化合物加入到培养好的菌液中转化72h～120 h；转化条件为：温度25℃～35℃，空气流量0.1m3/h～0.3m3/h，罐压0.03 MPa～0.07MPa，转速280rpm～320rpm。
[0028]在其中一些实施例中，所述的醋酸泼尼松的制备方法中，所述第二斜面培养的培养基组分为葡萄糖1.1％～1.5％、酵母膏1.1％～1.5％和琼脂1.5％～2.5％，pH 值为7.0±0.2；
[0029]所述一级种子培养的培养基组分为牛肉膏0.1％～0.5％和蛋白胨0.3％～0.7％， pH值为6.8±0.1；
[0030]所述二级种子培养的培养基组分为葡萄糖0.65％～0.69％、玉米浆 0.8％～1.2％、蛋白胨0.65％～0.69％和磷酸二氢钾0.01％～0.02％，pH值为7.0±0.1；[0031]所述第二菌体预培养的培养基组分为葡萄糖0.65％～0.69％、玉米浆 0.8％～1.2％、蛋白胨0.65％～0.69％和磷酸二氢钾0.01％～0.02％，pH值为7.2±0.2。[0032]在其中一些实施例中，所述的醋酸泼尼松的制备方法中，所述第二斜面培养的培养基组分为葡萄糖1.3％、酵母膏1.3％和琼脂2％，pH值为7；
[0033]所述一级种子培养的培养基组分为牛肉膏0.3％和蛋白胨0.5％，pH值为6.8；[0034]所述二级种子培养中的培养基组分为葡萄糖0.67％，玉米浆1％，蛋白胨 0.67％和磷酸二氢钾0.01％，pH值为7.0；
[0035]所述第二菌体预培养的培养基组分为葡萄糖0.67％，玉米浆1％，蛋白胨0.67％和磷酸二氢钾0.01％，pH值为7.2。[0036]在其中一些实施例中，所述的醋酸泼尼松的制备方法中，包括以下步骤：[0037]乙酸乙酯与式(Ⅲ)化合物混合，在-10℃～0℃加入琼斯试剂，于≤5℃反应 2h～3h，反应完毕加亚硫酸钠溶液猝灭反应。[0038]与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：[0039]式(Ⅰ)化合物(RSA)已经工业化生产，但现在应用较少，式(Ⅰ)化合物RSA 逐渐被淘汰，导致其生产设备被搁置。发明人经过大量的研究发现，式(Ⅰ)化合物(RSA)可以制备泼尼松。本发明以式(Ⅰ)化合物(RSA)为原料依次经过发酵羟化反应、发酵脱氢反应和氧化反应制得醋酸泼尼松。因此，本发明利用式(Ⅰ) 化合物(RSA)制备重要的肾上腺皮质激素类药泼尼松，用上了已有的、被搁置的生产RSA的设备，避免了现有设备的浪费，达到废物利用的作用。本发明制备方法采用生物发酵技术替代化学合成，无需经过上碘再置换的步骤，合成路线短，转化率高，经济环保，成本低，可有效提高收率和纯度，适合于工业化生产，具有很高的工业化价值。
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具体实施方式
[0040]以下结合具体实施例对本发明的化合物及其制备方法与应用进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。[0041]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0042]本发明一实施方式提供了一种醋酸泼尼松的合成方法，包括以下步骤 S10～S30。[0043]步骤S10：以式(Ⅰ)化合物为原料经过第一生物发酵发生羟化反应，制备式(Ⅱ) 化合物；其中，式(Ⅰ)化合物和式(Ⅱ)化合物的结构如下：
[0044]
步骤S20：将式(Ⅱ)化合物进行第二生物发酵发生脱氢反应，制备式(Ⅲ)化合物，式(Ⅲ)化合物的结构如下：
[0045]
[0046]
[0047]
步骤S30：将式(Ⅲ)化合物进行氧化反应，制备式(IV)化合物醋酸泼尼松，式(IV)
化合物的结构如下：
[0048]
[0049]
式(Ⅰ)化合物(RSA)已经工业化生产，但现在应用较少，式(Ⅰ)化合物RSA 逐渐被淘
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汰，导致其生产设备被搁置。发明人经过大量的研究发现，式(Ⅰ)化合物(RSA)可以制备泼尼松。本发明以式(Ⅰ)化合物(RSA)为原料依次经过发酵羟化反应、发酵脱氢反应和氧化反应制得醋酸泼尼松。因此，本发明利用式(Ⅰ) 化合物(RSA)制备重要的肾上腺皮质激素类药泼尼松，用上了已有的、被搁置的生产RSA的设备，避免了现有设备的浪费，达到废物利用的作用。本发明制备方法采用生物发酵技术替代化学合成，无需经过上碘再置换的步骤，合成路线短，转化率高，经济环保，成本低，可有效提高收率和纯度，适合于工业化生产，具有很高的工业化价值。
[0050]在其中一些实施例中，步骤S10中，第一生物发酵使用的菌选自赭曲霉菌、金龟子绿僵霉菌和黑根霉菌中的一种。[0051]在其中一些实施例中，步骤S10中，第一生物发酵使用的菌选自赭曲霉菌或金龟子绿僵霉菌。
[0052]优选地，第一生物发酵使用的菌为赭曲霉菌。[0053]在其中一些实施例中，步骤S10中，包括步骤S11～S14。[0054]步骤S11：第一斜面培养。[0055]在其中一些实施例中，步骤S11中，在25℃～35℃培养6～7天。[0056]优选地，在30℃下培养。[0057]在其中一些实施例中，步骤S11中，第一斜面培养的培养基组分为土豆150 g/L～250g/L和葡萄糖15g/L～25g/L，pH值为6.5±0.2。[0058]在其中一些实施例中，步骤S11中，培养基组分土豆经过如下处理：将土豆煮沸30分钟，四层纱布过滤取滤液。[0059]可选地，第一斜面培养的培养基组分为土豆200g/L和葡萄糖20g/L，pH 值为6.5。[0060]步骤S12：第一种子培养：将斜面孢子洗下，制成孢子悬液；按接种量8％～12％接种，置于25℃～35℃，180rpm～200rpm摇床培养36h～48h。[0061]优选地，接种量10％，30℃，180rpm摇床培养。[0062]在其中一些实施例中，步骤S12中，孢子悬液浓度为2～3×107个/ml。[0063]在其中一些实施例中，步骤S12中，将斜面孢子洗下的试剂为0.05％吐温-80 无菌水。
[0064]在其中一些实施例中，步骤S12中，接种量为8％～12％。[0065]优选地，接种量为10％。[0066]在其中一些实施例中，步骤S12中，第一种子培养中的培养基组分为玉米浆8g/L～12g/L和葡萄糖25g/L～35g/L，pH值为7.2±0.2。[0067]优选地，第一种子培养中的培养基组分为玉米浆10g/L和葡萄糖30g/L，pH 值为7.2。
[0068]步骤S13：第一菌体预培养：在发酵罐内加入发酵液，按接种量4％～6％接种，培养12h～20h；培养条件为：温度25℃～35℃，空气流量0.3m3/h～0.5m3/h，罐压0.03MPa～0.07MPa，转速280rpm～320rpm。[0069]优选地，接种量5％，温度为30℃，空气流量0.4m3/h，罐压0.05MPa，转速为300rpm。[0070]在其中一些实施例中，步骤S13中，第一菌体预培养的培养基组分为玉米浆8g/L～12g/L和葡萄糖25g/L～35g/L，pH值为7.2±0.2。
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优选地，第一菌体预培养的培养基组分为玉米浆10g/L和葡萄糖30g/L， pH值为
7.2。
步骤S14：第一转化：火圈保护下，将式(Ⅰ)化合物加入到培养好的菌液中转化72h
～120h；培养条件为：25℃～35℃，空气流量0.3m3/h～0.5m3/h，罐压0.03 MPa～0.07MPa，转速280rpm～320rpm。[0073]优选地，温度为30℃，空气流量0.4m3/h，罐压0.05MPa，转速为300rpm。[0074]在其中一些实施例中，步骤S14中，式(Ⅰ)化合物包括预处理步骤：粉碎至 200目，加入无菌水，80℃灭活1小时。[0075]在其中一些实施例中，步骤S10中，还包括后处理步骤S15～S16。[0076]步骤S15：产物的分离。[0077]在其中一些实施例中，步骤S15中，产物的分离包括步骤S151～S154。[0078]步骤S151：灭活。
[0079]在其中一些实施例中，步骤S151中，灭活温度为80℃。[0080]步骤S152：抽滤。
[0081]在其中一些实施例中，步骤S152中，抽滤温度为25℃。[0082]步骤S153：洗涤。
[0083]在其中一些实施例中，步骤S153中，抽滤后得到的滤饼层用二氯甲烷洗涤。[0084]可以理解，为了使滤饼洗涤的更加充分，可加入二氯甲烷常温搅拌30分钟，过滤，滤饼再用二氯甲烷淋洗并抽滤。[0085]可以理解，为了保证收率，还可以收集二氯甲烷滤液，减压浓缩干溶剂，加水，常温搅拌，抽滤。
[0086]步骤S154：干燥。
[0087]在其中一些实施例中，步骤S154中，将得到的滤饼烘干，得式(Ⅱ)化合物粗品。[0088]步骤S16：粗品精制。[0089]在其中一些实施例中，步骤S16中，向式(Ⅱ)化合物粗品中加入甲苯，搅拌，过滤，得式(Ⅱ)化合物。[0090]优选地，在80℃下搅拌，40～45℃过滤。[0091]在其中一些实施例中，步骤S20中，第二生物发酵使用的菌选自简单节杆菌和诺卡氏菌中的一种。[0092]优选地，第二生物发酵使用的菌为简单节杆菌。[0093]在其中一些实施例中，步骤S20中，包括步骤S21～S24。[0094]步骤S21：第二斜面培养。[0095]在其中一些实施例中，步骤S21中，第二斜面培养包括将菌在第二斜面划线接种的步骤。
[0096]在其中一些实施例中，步骤S21中，在25℃～35℃培养。[0097]在其中一些实施例中，步骤S21中结束后，将斜面培养基放入4℃保存。[0098]在其中一些实施例中，步骤S21中，第二斜面培养的培养基组分为葡萄糖 1.1％～1.5％、酵母膏1.1％～1.5％和琼脂1.5％～2.5％，pH值为7.0±0.2。[0099]优选地，第二斜面培养的培养基组分为葡萄糖1.3％、酵母膏1.3％和琼脂2％， pH
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[0072]
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值为7。
步骤S22：第二种子培养。
[0101]在其中一些实施例中，步骤S22中，第二种子培养包括步骤S221～S222。[0102]步骤S221：一级种子培养。[0103]在其中一些实施例中，步骤S221中，一级种子培养包括如下步骤：半支斜面入培养基，180rpm～200rpm，25℃～35℃培养18h～30h。[0104]优选地，180rpm，30℃培养24h。[0105]在其中一些实施例中，步骤S221中，一级种子培养的培养基组分为牛肉膏 0.1％～0.5％和蛋白胨0.3％～0.7％，pH值为6.8±0.1。[0106]优选地，一级种子培养的培养基组分为牛肉膏0.3％和蛋白胨0.5％，pH值为6.8。[0107]步骤S222：二级种子培养。[0108]在其中一些实施例中，步骤S222中，二级种子培养在180rpm～200rpm， 25℃～35℃条件下培养16h～24h。[0109]优选地，180rpm，30℃培养16h。[0110]在其中一些实施例中，步骤S222中，二级种子培养的培养基组分为葡萄糖 0.65％～0.69％、玉米浆0.8％～1.2％、蛋白胨0.65％～0.69％和磷酸二氢钾 0.01％～0.02％，pH值为7.0±0.1。[0111]优选地，二级种子培养中的培养基组分为葡萄糖0.67％，玉米浆1％，蛋白胨0.67％和磷酸二氢钾0.01％，pH值为7.0。[0112]步骤S23：第二菌体预培养。[0113]在其中一些实施例中，步骤S23中，第二菌体预培养包括如下步骤：在发酵罐内加入发酵液，按接种量4％～6％接种，培养12h～24h；培养条件为：温度 25℃～35℃，空气流量0.1m3/h～0.3m3/h，罐压0.03MPa～0.07MPa，转速280 rpm～320rpm。[0114]优选地，接种量5％，培养条件为,温度30℃，空气流量0.2m3/h，罐压0.05 MPa，转速300rpm。
[0115]在其中一些实施例中，步骤S23中，第二菌体预培养的培养基组分为葡萄糖0.65％～0.69％、玉米浆0.8％～1.2％、蛋白胨0.65％～0.69％和磷酸二氢钾 0.01％～0.02％，pH值为7.2±0.2。[0116]优选地，第二菌体预培养的培养基组分为葡萄糖0.67％，玉米浆1％，蛋白胨0.67％和磷酸二氢钾0.01％，pH值为7.2。[0117]在其中一些实施例中，步骤S23中，第二菌体预培养的培养基在121℃实消 30分钟，冷却到30℃时使用。[0118]步骤S24：第二转化。[0119]在其中一些实施例中，步骤S24中，第二转化包括如下步骤：火圈保护下，将式(Ⅱ)化合物加入到培养好的菌液中转化72h～120h；转化条件为：温度25℃～35℃，空气流量0.1m3/h～0.3m3/h，罐压0.03MPa～0.07MPa，转速280 rpm～320rpm。[0120]优选地，转化温度30℃，空气流量0.2m3/h，罐压0.05MPa，转速300rpm。[0121]在其中一些实施例中，步骤S24中，式(Ⅱ)化合物包括预处理步骤：粉碎至 200目，加入无菌水，80℃灭活1小时。
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在其中一些实施例中，步骤S20中，还包括后处理步骤S25～S26。
[0123]步骤S25：产物的分离。[0124]在其中一些实施例中，步骤S25中，产物的分离包括步骤S251～S253。[0125]步骤S251：发酵液固液分离，不灭活，直接过滤，用清水洗涤滤饼。[0126]步骤S252：滤饼中加入氯仿，搅拌，过滤，滤饼用氯仿淋洗，滤液减压浓缩。[0127]步骤S253：加水搅拌均匀，过滤，烘干，得式(Ⅲ)化合物粗品。[0128]步骤S26：粗品精制。[0129]在其中一些实施例中，步骤S26中，粗品精制包括步骤S261～S264。[0130]步骤S261：将式(Ⅲ)化合物粗品、二氯甲烷、甲醇和水混合，升温至微回流溶清。[0131]步骤S262：加入活性炭，微回流，过滤，滤饼用二氯甲烷淋洗，收集滤液。[0132]步骤S263：加水，5℃过滤，滤饼用水淋洗。[0133]步骤S264：滤饼55℃～60℃干燥，得式(Ⅲ)化合物。[0134]在其中一些实施例中，步骤S30中，包括以下步骤：[0135]乙酸乙酯与式(Ⅲ)化合物混合，在-10℃～0℃加入琼斯试剂，于≤5℃反应2 h～3h，反应完毕加亚硫酸钠溶液猝灭反应。[0136]在其中一些实施例中，步骤S30中，琼斯试剂的制备步骤如下：[0137]42g铬酐加入107g水中溶解，-5℃滴加66.7g浓硫酸，即得。[0138]在其中一些实施例中，步骤S30中，猝灭反应完成后还包括后处理步骤 S31～S37。[0139]步骤S31：45℃～50℃浓缩，水置换，抽滤，水洗，滤饼干燥，得醋酸泼尼松粗品。[0140]步骤S32：将二氯甲烷、甲醇、水、醋酸泼尼松粗品混合搅拌，35℃～37℃溶清，再依次加入冰乙酸，吉拉尔特试剂T，35℃～40℃，回流8h～10h。[0141]可选地，式(Ⅲ)化合物：二氯甲烷：甲醇：水的质量比为1:5:2:0.1。[0142]可选地，式(Ⅲ)化合物：冰乙酸：吉拉尔特试剂T的质量比为1:0.1:0.25。[0143]步骤S33：加活性炭，搅拌，过滤。[0144]步骤S34：控制温度≤8℃，加水，搅拌，抽滤，得醋酸泼尼松湿品。[0145]步骤S35：将二氯甲烷、甲醇和醋酸泼尼松湿品混合，升温至35～37℃溶清。[0146]步骤S36：加入活性炭，微回流，过滤，收集滤液，控温≤50℃，负压浓缩至糊状无馏分，35℃加入乙酸乙酯，回流搅拌3h～4h。[0147]步骤S37：0℃～5℃过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，干燥，得醋酸泼尼松精品。[0148]本发明一实施方式提供了一种泼尼松的合成方法，包括以下步骤S40。[0149]步骤S40：将醋酸泼尼松、二氯甲烷、甲醇、水和碱混合，发生水解反应，制备式(V)化合物，式(V)化合物的结构如下：
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在其中一些实施例中，步骤S40中，碱选自氢氧化钾和氢氧化钠中的至少一种。
[0152]在其中一些实施例中，步骤S40中，碱选自氢氧化钾和氢氧化钠中的至少一种，和碳酸钠、碳酸钾中的至少一种混合。[0153]可以理解，碳酸钠和碳酸钾碱性较弱，单独使用时醋酸泼尼松不足以反应完全，原料有剩余，发明人经过大量的实验发现，使用混合碱可以反应的更加彻底，得到的产物外观良好，颜色白，收率高。
[0154]在其中一些实施例中，步骤S40中，水解反应包括步骤S41～S46。[0155]步骤S41：将醋酸泼尼松、二氯甲烷和甲醇在氮气条件下搅拌，控温0℃～10℃。[0156]步骤S42：加入碱和水的混合溶液，搅拌。[0157]步骤S43：水解反应完成后，调节pH＝6～7，浓缩，用水置换，过滤。[0158]步骤S44：将泼尼松龙粗品和甲醇混合，升温至微回流溶清。[0159]步骤S45：加入活性炭，微回流，过滤，收集滤液，45℃～50℃浓缩。[0160]步骤S46：5℃过滤，55℃～60℃干燥。[0161]本发明以式(Ⅰ)化合物(RSA)为原料依次经过发酵羟化反应、发酵脱氢反应和氧化反应制得醋酸泼尼松，其中发酵羟化反应和发酵脱氢反应转化率高达 95％，以式(Ⅰ)化合物为原料制得的醋酸泼尼松HPLC面积归一含量高达99.4％。该制备方法采用生物发酵技术替代化学合成，无需经过上碘再置换的步骤，合成路线短，经济环保，成本低，可有效提高收率和纯度，适合于工业化生产，具有很高的工业化价值。[0162]具体实施例
[0163]这里按照本发明的醋酸泼尼松的制备方法及泼尼松的制备方法举例，但本发明并不局限于下述实施例。[0164]实施例1
[0165]1)式(Ⅱ)化合物的制备[0166]1.1斜面培养
[0167]采用赭曲霉菌Aspergillus ochraceus ATCC 18500为生产菌种，斜面培养基为土豆培养基：土豆200g/L(煮沸30分钟，四层纱布过滤取滤液)，葡萄糖20g/L， pH值为6.5，将保存的菌株在斜面上划线接种，30℃培养6天。[0168]1.2种子培养[0169]孢子悬液制备：取一支培养6天新鲜斜面，用0.05％吐温-80无菌水将斜面孢子洗下，制成孢子悬液，镜检计数孢子浓度为2～3×107个/ml。[0170]摇瓶种子培养：种子培养基组分为玉米浆10g/L和葡萄糖30g/L，pH值为 7.2，接种量10％，30℃，180rpm培养40h。[0171]1.3菌体预培养[0172]10升发酵罐，发酵液体积7升，培养基组分为玉米浆10g/L和葡萄糖30g/L，pH值为7.2，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。按接种量5％接种，在30℃，空气流量0.4m3/h，转速300rpm，罐压0.05MPa培养16小时。[0173]1.4转化[0174]式(Ⅰ)化合物预处理：35g式(Ⅰ)化合物，粉碎至200目，加入200毫升无菌水，加热到80℃，灭活1小时。
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火圈保护下，将预处理好的式(Ⅰ)化合物加入到培养好的菌液中，空气流量
0.4m3/h，转速300rpm，罐压0.05MPa条件下转化72h，转化率95％。[0176]1.5后处理
[0177]转化产物的分离：发酵转化完毕，80℃灭活，冷却到25℃，抽滤。滤饼层用二氯甲烷提取2次，每次加入底物量20倍体积的二氯甲烷，常温搅拌30分钟，过滤，滤饼用2倍体积的二氯甲烷淋洗，抽滤。收集二氯甲烷滤液，减压浓缩干溶剂，加少量水，常温搅拌均匀，抽滤，滤饼50℃烘干，得到式(Ⅱ)化合物粗品。[0178]粗品精制：向式(Ⅱ)化合物粗品中加入5倍体积的甲苯，升温到80℃，搅拌 4小时，冷却到40℃，趁热过滤，滤饼用少量甲苯淋洗，得式(Ⅱ)化合物，收率为95％，纯度为99％。[0179]式(Ⅱ)化合物收率＝式(Ⅱ)化合物的质量/式(Ⅰ)化合物的质量×100％[0180]式(Ⅱ)化合物MS(ES):405.3[M+H]+[0181]2)式(Ⅲ)化合物的制备[0182]2.1斜面培养
[0183]采用简单节杆菌为生产菌种，斜面培养基为1.3％葡萄糖、1.3％酵母膏和琼脂2％，pH值为7.0，将保存的菌株在斜面上划线接种，30℃培养3天，培养结束入4℃保存。[0184]2.2一级种子培养
[0185]培养基成分为牛肉膏0.3％和蛋白胨0.5％，pH值为6.8，将斜面培养基半支入100毫升一级种子培养基中，控制摇床转速为180rpm，在30℃培养24h。[0186]2.3二级种子培养
[0187]培养基成分为葡萄糖0.67％、玉米浆1％、蛋白胨0.67％和磷酸二氢钾0.01％，pH值为7.0，控制摇床转速为180rpm，在30℃培养16h。[0188]2.4菌体预培养[0189]10升发酵罐，发酵液体积7升，培养基组分为葡萄糖0.67％、玉米浆1％、蛋白胨0.67％和磷酸二氢钾0.01％，pH值为7.2，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。按接种量5％接种，在30℃，空气流量0.4m3/h，转速300rpm，罐压0.05MPa 培养16小时，转化率95％。[0190]2.5转化
[0191]式(Ⅱ)化合物预处理：70g式(Ⅱ)化合物，粉碎至200目，加入200毫升无菌水，加热到80℃，灭活1小时。[0192]火圈保护下，将预处理好的底物加入到培养好的菌液中，在30℃，空气流量0.2m3/h，转速300rpm，罐压0.05Mpa条件下转化72h。[0193]2.6后处理
[0194]转化产物的分离：发酵液固液分离，不灭活，直接过滤，滤饼用清水淋洗至滤出液无色。滤饼不烘干，加入底物量20倍体积的氯仿，搅拌溶解2h，过滤，滤饼用少量氯仿淋洗，滤液减压浓缩干，加入少量水搅拌均匀，过滤，烘干，得到式(Ⅲ)化合物粗品。[0195]粗品精制：将二氯甲烷420mL、甲醇210mL、水35mL和式(Ⅲ)化合物粗品投入反应瓶中，升温至微回流溶清。加入3.5g活性炭，微回流0.5h过滤，滤饼用少量二氯甲烷淋洗，收集滤液。滤液加水，5℃过滤，滤饼用少量水淋洗。滤饼55～60℃干燥，得式(Ⅲ)化合物，收率为94％，纯度为99％。
[0196]式(Ⅲ)化合物收率＝式(Ⅲ)化合物的质量/式(Ⅱ)化合物的质量×100％
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式(Ⅲ)化合物MS(ES):403.2[M+H]+
[0198]3)醋酸泼尼松的制备
[0199]42g铬酐加入107g水中溶解彻底降温滴加66.7g浓硫酸，控温-5℃，配成琼斯试剂。将乙酸乙酯500mL与式(Ⅲ)化合物100g混合，在-5℃条件下将琼斯试剂缓慢滴加，滴加完毕控温5℃以下反应2h，TLC监测，反应完全后加入亚硫酸钠溶液(42g的亚硫酸钠溶于157.5mL的水)淬灭30min，淬灭完成后， 45℃浓缩，水置换，抽滤，水洗至滤液无色透明，滤饼60℃干燥。
[0200]溶解釜中投入二氯甲烷500g，甲醇200g，饮用水10g，投入醋酸泼尼松粗品搅拌，升温至35～37℃，溶清，确定溶清后先加入冰乙酸10g，再加入吉拉尔特试剂T 25g。加料完毕后，控制温度35℃～40℃，回流8h～10h。加活性炭10g，搅拌35min，然后把体系通过过滤器过滤至水析釜中。过滤完毕后，控制温度T≤8℃，开始向水析釜中滴加饮用水350g，170min滴加完毕，加完后搅拌60min，抽滤，水洗，再次抽滤，得醋酸泼尼松湿品。[0201]将二氯甲烷500g、甲醇200g和醋酸泼尼松湿品投入反应瓶中，升温至35～ 37℃溶清。加入5g活性炭，微回流1h，过滤，收集滤液。控温≤50℃，负压浓缩至糊状无馏分，35℃加入100g乙酸乙酯，回流搅拌3h，0℃过滤，滤饼用少量乙酸乙酯淋洗，55～60℃干燥，得醋酸泼尼松精品，收率为98％，纯度为 99.4％。
[0202]醋酸泼尼松收率＝醋酸泼尼松的质量/式(Ⅲ)化合物的质量×100％[0203]醋酸泼尼松MS(ES):415.2[M+H]+[0204]4)泼尼松的制备[0205]氮气保护下，将醋酸泼尼松龙1.0g、二氯甲烷8mL和甲醇6mL加到反应瓶中，搅拌至溶清；控温0℃～10℃，将配置好的含有氢氧化钠0.02g、碳酸钾 0.03g和水1mL的混合溶液滴加到反应体系中，搅拌2h；TLC监测至无原料剩余，冰醋酸调节pH＝6～7，减压浓缩至糊状，2mL水置换一次，5℃～10℃过滤，滤饼用水淋洗，得泼尼松粗品。[0206]将甲醇15mL和泼尼松龙粗品投入反应瓶中，升温至微回流溶清。加入0.05 g活性炭，微回流0.5h，过滤，滤饼用少量甲醇淋洗，收集滤液。45℃～50℃浓缩，5℃过滤，滤饼用少量甲醇淋洗，55～60℃干燥,得泼尼松白色固体，收率为 84％，纯度为99.5％。[0207]泼尼松＝泼尼松的质量/醋酸泼尼松的质量×100％[0208]泼尼松MS(ES):373.2[M+H]+[0209]实施例2
[0210]实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于，实施例2的步骤1)中将赭曲霉菌替换成金龟子绿僵霉菌，其它步骤与工艺参数与实施例1相，得到的式(Ⅱ) 化合物收率为94％，纯度为98.9％。[0211]实施例3
[0212]实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于，实施例3的步骤1)中将赭曲霉菌替换成黑根霉菌，其它步骤与工艺参数与实施例1相同，得到的式(Ⅱ)化合物收率为90％，纯度为98.3％。
[0213]实施例4
[0214]实施例4与实施例1基本相同，不同之处在于，实施例4的步骤2)中将简单节杆菌替换成诺卡氏菌，其它步骤与工艺参数与实施例1相同，得到的式(Ⅲ) 化合物，收率为90％，
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纯度为98.5％。
[0215]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0216]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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