一、探究酵母菌的呼吸方式【C】
（一）、实验原理：
1. 酵母菌是兼性厌氧型生物，无氧和有氧呼吸都产生CO2，无氧呼吸还能产生酒精。 2. 检测产生CO2：→可使用澄清石灰水；或溴麝香草酚蓝溶液（现象：蓝→变绿→变黄）。 3．检测酒精产生：→用酸化的重铬酸钾。实验现象：溶液由橙色变为灰绿色。
（二）、实验设计（及方法步骤）：→设计如下图装置进行对照实验：
1. 设计成有氧条件（甲组）与无氧 条件（乙组）进行对照实验。 2. NaOH溶液的作用是：
→除去空气中CO2，排除对实验干扰。
3. 培养液要进行灭菌，灭菌后的培养液
要冷却后才能接种酵母菌。
4. 进行乙组实验时，必须让B瓶密封放置反应一段时间，才能将导管连通到澄清石灰水瓶中。
★其目的是：→消耗掉瓶内氧气，防止酵母菌进行有氧呼吸对实验结果的干扰。 5. 实验中要观察甲、乙组澄清石灰水的变化，并检测A和B瓶中有无酒精产生。
★检测酒精时，要将重铬酸钾溶于浓硫酸溶液中进行酸化处理，再加入到被检测溶液中。
（三）、实验结果（现象）及其分析：
1. 甲、乙两组的澄清石灰水都变浑浊，甲组变浑浊快和程度大；说明酵母菌有氧和无氧条件下
都产生CO2，有氧条件下比无氧条件下产生的CO2多。注意：据该实验现象不能确定呼吸方式。 2. 检测酒精时，若A瓶中无酒精产生（检测时不变灰绿），则说明A瓶酵母菌只进行有氧呼吸； 若B瓶中有酒精产生（检测时变灰绿）；则说明B瓶中酵母菌进行了无氧呼吸。
二、探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化【C】
（一）、实验原理：
1. 液体培养酵母菌时，种群的增长受培养液营养成分、空间（含氧量）、温度和pH等因素的影响。 2. 在理想条件下，酵母菌种群的增长呈“J”型曲线；在各种资源有限或者存在环境阻力的情况下， 酵母菌种群增长呈“S”型曲线。◆酵母菌种群数量变化表现为：增长→保持稳定→衰减。 3. 对酵母菌进行观察计数，需要用到血球计数板和显微镜。★血球计数板构造如下图：
（二）、实验设计（方法和步骤）：
1. 将10mL无菌的5%的葡萄糖溶液加入试管。 2. 将酵母菌（干酵母）接种到试管培养液中， 将试管在 28℃条件下连续培养7天。
3. 采用抽样检测法，每天取样测定酵母菌数目， 每天抽测3次，取平均值。 【取样计数的操作方法】
盖玻片下液体高度
计数室（2个）
正面 每个小格的面积
侧面 （1）先将盖玻片盖在血球计数板计数室上，再用吸管吸取培养液滴于盖玻片边缘。
★特别提醒：→吸取培养液前，要振荡几下试管，摇匀培养液（否则数据会偏差较大）。
（2）让培养液自行渗入计数室内，用滤纸吸去多余的培养液。
（3）待酵母菌全部沉降到计数室底部时，将计数板放在载物台中央进行观察计数。
★计数区域： 25（中）×16（小）型计数室为四顶角和中央的5个中格。→ ★对于压在小方格界线上的酵母菌，应取两邻边及其顶角计数。 （4）计算出1mL培养液中酵母菌，换算后记录在设计的表格中。
1mL培养液中酵母菌数目＝ 4×10× 每小格酵母菌数 ×稀释倍数
=400×（每小格的面积1/400mm）每小格酵母菌数×10×稀释倍数
2
4
6
（三）、实验结果及其分析：——将记录在表格中的数据转换成曲线图，分析实验结果并得出结论。
★特别提醒1：→每天的计数时间要相同；培养至中后期时，要对培养液进行稀释后再计数。 ★特别提醒2：→若视野中有气泡，应重新制片计数。要对酵母菌进行染色后计数，否则数据偏大。 ★特别提醒3：→清洗血球计数板时，应采用浸泡和冲洗方法，不能刷洗和擦拭。
三、固定化酵母细胞的制备与应用【B】
1. 制备固定化细胞常用凝胶包埋法。
①★制备固定化酵母细胞常用海藻酸钠凝胶包埋法。
②★凝胶是多孔载体，调节凝胶溶液的浓度，可以改变凝胶的孔径大小。 2. 制备固定化酵母细胞的方法步骤：→关键步骤：配制海藻酸钠溶液。 （1）活化酵母细胞：→目的：→使酵母菌从休眠状态恢复到正常生活状态。
①操作：→将1克干酵母和10ml蒸馏水放在50ml烧杯中混合并搅拌均匀，放置1小时。 ②注意事项：→容器要大一些，以防活化液溢出；混合后要进行搅拌。 （2）配制0.05mol/L的CaCL2 溶液：
①操作：→将0.83克无水CaCL2和150mL蒸馏水，放在200ml烧杯中使其充分溶解。 ②★CaCL2溶液的作用：→（起凝胶聚沉作用）促使凝胶珠的形成。 （3）配制海藻酸钠溶液（最关键）：
①操作：→将0.7g海藻酸钠和10ml蒸馏水加入50ml小烧杯中，小火间断加热至
完全溶化，加蒸馏水定容至10ml。
②注意事项：→★应采用小火间断加热，以防焦糊；海藻酸钠浓度不宜过高过低。 ③★海藻酸钠溶液浓度过高时：→难以形成凝胶珠或凝胶珠形态异常。 ④★海藻酸钠浓度过低时：→凝胶珠中包埋的细胞数量少，凝胶珠色浅呈白色。 （4）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：
★应将海藻酸钠溶液冷却至室温后，再加入已活化的酵母细胞；并充分搅拌均匀。 （5）固定化酵母细胞：
①操作：→用注射器吸取混合液，以恒定的速度缓慢地滴加到CaCL2溶液中，并不
断搅拌（磁力搅拌器搅拌），将凝胶珠在CaCL2溶液中浸泡30分钟。
②注意事项：→注射器距液面距离不能太近、凝胶珠浸泡时间不能过短。 ③★注射器距液面距离过近时：→凝胶珠会出现拖尾现象。
④★凝胶珠浸泡时间过短时：→凝胶珠不能形成稳定结构，容易裂开。 （6）冲洗：→取出凝胶珠后，要用蒸馏水冲洗2～3次。
★冲洗的目的：→洗去凝胶珠表面的氯化钙溶液和杂菌。
（7）发酵实验：→将10%的葡萄糖溶液150ml加入200ml的锥形瓶中，加入固定化酵母
细胞在25℃下发酵24h。观察气泡产生（CO2）和闻酒味，并用重铬酸钾检测酒精。
3. 实验结果分析：——酵母细胞凝胶珠质量检测。 （1）合格凝胶珠的标准：
①乳白色，圆形或椭圆形。②摔打容易弹起。③挤压不易破裂、无液体流出。 （2）凝胶珠异常的原因：
①色浅呈白色：→海藻酸钠溶液浓度偏低，此种凝胶珠中包埋的酵母细胞数量少。 ②不呈圆形或椭圆形：→海藻酸钠溶液浓度偏高。
★此种凝胶珠为制作失败，不能使用；需要重新制作。
③拖尾现象：→混合液浓度低，或注射器距氯化钙溶液液面距离太近。
④凝胶珠漂浮：→混合溶液中含气泡。
⑤★凝胶珠容易裂开：→凝胶珠在氯化钙溶液中浸泡时间过短。
四、腐乳的制作【A】
1. 制作腐乳的原理： →利用毛霉等微生物分泌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶将豆腐中的 蛋白质、脂肪和淀粉分解为多种氨基酸、有机酸等；使腐乳鲜香可口，易消化吸收。 （1）在腐乳制作中，多种微生物参与了豆腐的发酵，但起主要作用的是毛霉。
①毛霉是丝状真菌，其代谢类型属于异养需氧型；适宜生长温度：15℃～18℃。
②毛霉孢子分布广泛，空气中含有大量毛霉孢子。
（2）家庭和实验制作腐乳时，将豆腐坯暴露在空气中接种毛霉孢子。
（3）工业生产腐乳时，在严格无菌条件下接种优良毛霉菌种孢子。★腐乳品质好。
①工业上生产腐乳步骤：→①接种孢子。→②培养和晾花。→③压坯与装坛 ②“晾花”的目的：→增强酶的作用，散失霉味。
（4）醉方（添加黄酒制成）、红方（添加红曲制成）、青方（不加调料制成）。 2. 腐乳制作的基本流程：→见下图：
让豆腐上长出毛霉 ◆直接接种或利用空气中 毛霉孢子，15℃～18℃培养。 加盐腌制 ◆逐层加盐，随层数增高而增加盐量；近瓶口处铺厚些。 加卤汤装瓶 密封腌制 ◆卤汤由酒和 香辛料配成。 ◆用酒精灯对瓶口 灭菌后密封。 （1）让豆腐上长出毛霉：
①将豆腐切成小块（4cm×4cm×1.5cm），用沸水消毒后微微晾干，制成腐乳坯。 在晾干过程中空气中毛霉孢子落到腐乳坯上，完成接种过程。 ★所用豆腐含水量应控制在70%左右，含水过多腐乳不成形。
②将腐乳坯竖立放在清洁容器内彼此间隔1cm，将温度控制在15～18℃，并保持 一定湿度让毛霉生长；当菌丝变成淡黄色，有大量灰褐色孢子形成时停止发酵。 ★若某些豆腐上长出青霉，应剔除这种豆腐或重新制作。
（2）加盐腌制：→将长满毛霉的豆腐块用食盐水清洗后整齐地摆放在瓶中，用食盐腌制10天。
①★加盐方法：→逐层加盐，加盐量逐层递增，接近瓶口的表面盐要铺厚一些。②盐量：腐乳坯量= 5 ：1。★加盐过多会影响继续发酵，过少豆腐会腐败变质。 【加盐目的】→①析出豆腐中水分，使豆腐变硬，防止过早酥烂。 ②抑制微生物生长，防止豆腐腐败变质。 ③调节口味。
（3）配制卤汤：→用食盐、水和料酒及各种香辛料等进行配制。
①卤汤中酒含量控制在12%左右。
◆酒的作用：→抑制微生物的生长，并使腐乳具有独特酒香味。
★酒用量过多会抑制蛋白酶活性和影响腐乳风味；酒用量过少豆腐会腐败。 ②香辛料的作用：→调味、防腐杀菌。
（4）加卤汤装瓶，密封腌制：→将配制好的卤汤加入瓶中，将瓶口通过酒精灯火焰，再用胶带密封
瓶口，密封腌制6个月。
★装瓶时要迅速，瓶口要通过酒精灯的火焰，再密封。 2. 腐乳品质鉴定及有关提醒：
（1）评价腐乳品质：→应从形状、色、香、味、质地等方面进行评价。 （2）影响腐乳品质的因素：→盐、酒、香辛料和发酵温度。
◆前期发酵温度为：15℃～18℃；后期发酵温度（腌制时）为常温或30℃。 ★在腌制过程中，毛霉等微生物（酶的作用）仍可继续发酵一段时间。 （3）腐乳外表的皮是附着在豆腐上的毛霉菌丝形成的，可使腐乳成形。
（4）用于腌制的玻璃瓶洗刷干净后要用沸水消毒，装瓶、密封等环节要无菌操作。
五、果酒和果醋的制作【B】
（一）果酒制作：→果酒中酒精含量应控制在10%～20%。 1. 果酒制作方法步骤（及注意事项）：
（1）对发酵瓶、纱布、榨汁机等进行清洗和消毒：
★发酵瓶要用温水反复清洗后，再用75%酒精擦拭消毒，晾干。 （2）取葡萄500克，先冲洗干净，再去除枝梗和腐烂籽粒，再次冲洗。
①冲洗目的：→去除葡萄表面污物杂物。★不能先去枝梗再冲洗。 ②不能反复冲洗，否则会冲洗掉附着在葡萄表面的野生型酵母菌。 （3）用榨汁机榨取葡萄汁，之后将葡萄汁装入发酵瓶中，并盖好瓶盖：
【注意】→果汁不能装满（装入量不超过发酵瓶总体积的2/3）。★目的是： ①让酵母菌有氧呼吸大量繁殖，保证发酵时有较大起始数量。 ②防止发酵时发酵液溢出。
（4）将发酵瓶放置在18℃～25℃条件下发酵10～12天： （5）每天定期排气1～2次（排CO2），以防瓶爆裂。 ①为了防止发酵瓶爆裂，最好选用塑料瓶。
②排气时要防止杂菌污染，常拧松瓶盖排气，不能打开瓶盖。
③★右图发酵装置中排气管设计成长而弯曲状，既能排气，又能防止杂菌污染。
（6）取样检测酒精（10天后）：→用酸化重铬酸钾检测；也可闻酒味、镜检酵母菌。
【检测方法】→①取两支试管编号1、2，分别装入2mL酒精、2mL发酵液。 ②向两试管中分别滴加3滴3mol/L的硫酸溶液，并振荡混匀。
③再向两试管中各加入饱和重铬酸钾溶液3滴，振荡后观察溶液颜色变化。 2.★制作果酒和果醋中防止杂菌污染的措施：
（1）对用具清洗并用酒精消毒。 （2）葡萄先清洗后除枝梗。 （3）排气管设计为长而弯曲状。 （4）无菌操作。 （二）果醋制作：
1. 利用葡萄汁等果汁制作果醋：
（1）要向果汁中接种醋酸菌，并置于30℃～35℃条件下进行有氧发酵。 （2）发酵时需要不断通入无菌空气，同时也需要定期排气（排CO2）。
（3）反应式：C6H12O6 ＋2O2 酶 2 CH3 COOH ＋2CO2＋2 H2O＋能量
2. 利用果酒制作果醋的方法步骤：
（1）将醋酸菌（醋曲或醋酸菌膜）接种到制作好的果酒中，并通入无菌空气。 （2）将发酵装置放在30℃～35℃环境中，不断通入无菌空气进行有氧发酵7～8天。 （3）检测果醋是否制作成功，并对发酵液（果醋）进行过滤、灭菌：
【检测方法】→①pH测定、②观察醋酸菌膜形成、③闻酸味、品尝、镜检等。 【提醒】→①变酸的果酒表面白色菌膜是由醋酸菌形成的。 ②泡菜坛内表面白色菌膜是由酵母菌形成的。
（4）果酒制果醋反应式： C2H5OH ＋O2 酶 CH3 COOH ＋ H2O ＋能量
（三）★果酒制作与果醋制作的比较： 发酵菌种 最适发酵温度 对氧气需求 pH 发酵时间 方法与流程 果酒制作 酵母菌 18℃～25℃ 前期需氧，后期不需氧 4.0～5.8 10～12天 果醋制作 醋酸菌 30℃～35℃ 一直需要氧 5.4～6.3 7～8天 挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵（果酒）→醋酸发酵（果醋）
六、微生物的分离和培养【B】
（一）分离纯化大肠杆菌：
1. 配制牛肉膏蛋白胨培养基：→包括：计算→称量→溶化（含调pH）→灭菌→倒平板。 2. 分离纯化大肠杆菌的接种方法：→划线平板法和稀释涂布平板法。 3. 接种后的培养基的培养：→置于恒温箱中37℃培养1～2d。 4. 挑取大肠杆菌菌落多次进行接种培养可以纯化大肠杆菌菌种。
5. 菌种保存方法：→临时保藏（4℃保存）和长期保存（甘油管藏：－20℃保存）. （二）土壤中分解尿素的微生物的分离与计数： 1.筛选原理及方法：
（1）原理：→尿素分解菌能合成脲酶，能利用脲酶分解尿素，因此可以尿素为氮源。（2）筛选方法：→用以尿素为唯一氮源的培养基培养土壤微生物进行筛选。 2. 实验方法步骤：→本实验采用稀释涂布平板法和活菌计数法。
（1）土壤取样：→从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先
准备好的信封中。
【注意】→取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌。 （2）制备培养基：→按下列配方制备以尿素为唯一氮源的培养基。
KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 尿素 10.0g 1.0g 琼脂 pH调至7.0～7.2， 15.0g 加蒸馏水定容至1000ml ★需要设置无尿素培养基作空白对照，即：表中尿素用等量的无菌水替换。
（3）土壤样品稀释：→制备不同稀释度的土壤悬液。方法如下：
①称取0.5g土壤，倒入盛有50mL无菌水的锥形瓶，振荡20min，充分打散土壤，
制成10g/mL的土壤悬液。
②用无菌移液管吸取0.5mL（10g/mL）的土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的 1号试管，配制成10g/mL的土壤悬液。
③取另一支无菌移液管吹吸1号管3次，使悬液均匀，再吸取0.5mL注入盛有 4.5mL无菌水的2号试管，配制成10g/mL的土壤悬液.。依此类推，配制 10、10、10、10g/mL的等浓度的土壤悬液。
★每次吸取土壤悬液前都要用移液管吹吸悬液3次的目的：→使土壤悬液均匀。 ④分离不同的微生物采用不同稀释度（因不同微生物在土壤中含量不同）。见下表： 稀释度 目的 4－5
－6
－7
－8
－4
－3
－2
－2
细菌 10、10、10 563放线菌 10、10、10 452霉菌 10、10、10 34保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板 【提醒】→人教版是配制10mL不同浓度的土壤悬液，其方法与上述方法相同。 （4）接种：→采用（稀释）涂布平板法。◆具体操作如下：
→从最低浓度（10g/mL）土壤溶液开始，分别用无菌移液管吸取1mL（人教版
为0.1mL）加入到相应编号的培养基中，每个浓度设置至少3个重复（三个平板），再用涂布器（玻璃刮铲）涂布均匀。
①每次吸取土壤悬液前都要将土壤悬液充分振荡，混合均匀；每一步都应做到
无菌操作。★操作时，移液管和试管口应在离火焰1～2cm处。
②实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
（5）培养与观察：→将已标明培养基种类、培养日期和样品稀释度的培养皿，倒置放在37℃的恒温
箱培养1～2d，观察细菌菌落。
（6）计数菌落：→每隔24h统计菌落一次，选取菌落数目稳定时的数据作结果，以防
止培养时间不足而遗漏某些菌落。
①★计算时应选择菌落数为30～300的平板上进行计数，要计算平均数。 ②★每克样品菌落数（用液1mL）＝某一稀释度重复培养菌落平均数×稀释倍数。 ③★统计的菌落数比活菌的实际数目少。
原因是：→当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是1个菌落。
4. 结果分析与评价：→ ★同一土样的重复组统计的结果应相近。
（1）若未接种的培养基中没有菌落，说明培养基未被杂菌污染，反之，则被污染。
（2）若空白对照组培养基上有菌落生长，原因可能是被固氮微生物污染或培养基中混入了其他氮源。 （3）若实验中得到2个或2个以上菌落数在30～300的平板，表明稀释操作成功，可以进行计数统
计。
（4）若同一稀释度的3个重复的菌落数相差悬殊，表明试验不精确，需要重新实验。 【知识拓展】
1．土壤中微生物数目的统计方法：→包括：直接计数法和间接计数法（活菌计数法）。 （1）直接计数法：→用血球计数板制片后在显微镜下观察计数。 ①取样计数方法与培养液中酵母菌计数方法类似。
②土壤微生物的稀释要求：→以达到每小格内有5～10个菌体为宜。
③经稀释的土壤样品应重复计数3次，取其平均值。
－8
④★1mL土壤悬液中菌体总数 = 4×10×每小格中的菌体数×土壤悬液稀释倍数。 （2）间接计数法（活菌计数法）→采用稀释涂布平板法，统计菌落数进行计数。
①要设置对照和重复，每个稀释度土壤悬液至少设置3个重复。 ②选择菌落数为30～300的平板上进行计数，并计算平均数。 ③每克土壤样品中菌落数＝菌落数 × 稀释倍数 ÷ 涂布体积。 2. 鉴定能分解尿素的微生物的方法：→脲酶检测法。
（1）原理：→尿素经脲酶分解后形成氨，使pH升高，会使酚红指示剂变红。 （2）方法：→在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红，若酚红指示剂变红，则
说明该微生物能分解尿素。
（三）分离土壤中能分解纤维素的微生物： 1.基础知识和原理：
（1）能分解纤维素的微生物都能分泌纤维素酶，该类微生物能以纤维素为唯一碳源。 （2）纤维素酶：→是一种复合酶，包括：C1酶（外切酶）、CX酶（内切酶）和葡萄糖苷酶。
（3）刚果红：→能与纤维素形成红色复合物，不能与纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 ★在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，能分解纤维素的微生物形成的菌落
周围由于纤维素被分解，因此不呈红色，而是形成透明圈。
2.操作步骤：
（1）土壤取样：→应从富含纤维素的环境中进行土壤取样。如：树林中多年落叶形成
的腐殖土等。▲若找不到合适的环境，可将滤纸埋在土壤中（深10cm）再取样。 （2）选择培养：→★目的：→增加纤维素分解菌的浓度（即：浓缩所需要微生物）。 ①按下表配方制备液体选择培养基： 纤维素粉 NaNO3 KCL MgSO4·7H2O 5g 1g 0.5g 0.5g Na2HPO4·7H2O KH2PO4 酵母膏 水解酪素 1.2g 0.9g 0.5g 0.5g 溶解后加蒸馏水定容至1000mL 6
纤维素 C1酶、CX酶 纤维二糖 葡萄糖苷酶 葡萄糖 【提醒】→该培养基为液体培养基，属于选择培养基。 ★原因是：→该培养基中
虽然含有其他碳源（酵母膏），但含量很少，培养基中的主要碳源还是
纤维素；在此种培养基中只有能分解纤维素的微生物才能大量繁殖。 ★水解酪素：→提供氮源和生长因子。
②设计对照组培养基时，用葡萄糖代替该配方中纤维素粉。
【操作】→称取20g土样加入装有30mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一
定温度下（30℃），振荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。
（3）梯度稀释：→将选择培养后的培养基进行等梯度稀释10～10倍。 （4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上： ①制备鉴别培养基：→按下表配方制备鉴别培养基。
CMC—Na （水溶性羧甲基纤维素钠） 5～10g 酵母膏 1g KH2PO4 0.25g 土豆汁 100mL 琼脂 15g 溶解后加蒸馏水 定容至1000ml 1
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②涂布平板：→将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，
30℃倒置培养。
（5）刚果红染色法：→★目的：→挑选产生透明圈的菌落（筛选出纤维素分解菌）。 ①方法一：→先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。 ②方法二：→在倒平板时就加入刚果红。
★方法一中要使用NaCl溶液，其作用是：→漂洗作用。
即：洗去与纤维素结合不牢的刚果红，使透明圈更清晰。
★透明圈越大的菌落，产纤维素酶能力越强，分解纤维素的能力越强。
③两种染色鉴定方法的优缺点比较： 染色法 方法一 方法二 （6）纯化培养：
→在产生明显透明圈的菌落中，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30℃～37℃培养，可获得纯化培养。
3. 确定纤维素分解菌：→进行发酵产纤维素酶实验： （1）纤维素酶的发酵方法：→包括：液体发酵和固体发酵。
（2）纤维素酶测定方法：→对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的葡萄糖含量测定。
优点 颜色反应基本上是 纤维素分解菌的作用 操作简便， 不存在菌落混杂问题 缺点 操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂。 ◆产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈 ◆有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。
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