维生素D诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用

维生素Ｄ诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用

万春辉　杜先智　（重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆４０００１０）

　　中图分类号　Ｒ３９２．１２　　文献标志码　Ａ　　文章编号　１０００－４８４Ｘ（２０１５）０４－０４５６－０６

①

［摘　要］　目的：探讨维生素Ｄ诱导巨噬细胞产生自噬并清除巨噬细胞内结核分枝杆菌（Ｍｔｂ）的作用。方法：使用豆蔻酰佛波醇乙酯（ＰＭＡ）诱导Ｕ９３７细胞分化使之具有吞噬能力，分化后的Ｕ９３７细胞随机分为阴性对照组、维生素Ｄ组、自噬抑制剂（３－ＭＡ）＋维生素Ｄ组、阳性对照（雷帕霉素）组，以Ｍｔｂ感染Ｕ９３７细胞６ｈ。感染后第４天，利用半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测自噬相关基因ＡＴＧ５、Ｂｅｃｌｉｎ－１及ＬＬ－３７、ＬＣ３ＢｍＲＮＡ的表达，流式细胞术检测ＬＣ３Ｂ－Ⅱ和／或结核分枝杆菌抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）的细胞。结果：与对照组相比，维生素Ｄ组ＡＴＧ５、Ｂｅｃｌｉｎ－１、ＬＬ－３７、ＬＣ３ＢｍＲＮＡ的表达增强（Ｐ＜０．０１），ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－细胞增多，Ａｇ８５Ａ－细胞减少，且ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－Ａｇ８５Ａ－细胞增加（维生素Ｄ组３８．０％比阴性对照组１．０８％）。与维生素Ｄ组相比，在自噬抑

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制剂３－ＭＡ＋维生素Ｄ组中，不但ＡＴＧ５、Ｂｅｃｌｉｎ－１、ＬＣ３Ｂ的ｍＲＮＡ表达受到抑制，ＬＬ－３７的ｍＲＮＡ表达较维生素Ｄ组减少，而且

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３－ＭＡ抑制了细胞ＬＣ３Ｂ－Ⅱ的表达，同时抑制了１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－Ａｇ８５Ａ－细胞增加的作用。结论：维生素Ｄ能够诱导巨噬细胞产生自噬作用，并进一步有助于巨噬细胞清除结核分枝杆菌。

［关键词］　维生素Ｄ；自噬；结核分枝杆菌；巨噬细胞

ＲｏｌｅｏｆｖｉｔａｍｉｎＤ－ｉｎｄｕｃｅｄａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｇａｉｎｓｔＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ－ｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ

ＷＡＮＣｈｕｎ－Ｈｕｉ，ＤＵＸｉａｎ－Ｚｈｉ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００１０，Ｃｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｖｉｔａｍｉｎＤ－ｉｎｄｕｃｅｄａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｇａｉｎｓｔＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＩｎｄｕｃｅＵ９３７ｃｅｌｌｓｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｗｉｔｈｐｈａｇｏｃｙｔｉｃｃａｐａｃｉｔｙｂｙｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）．Ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｖｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ，ａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（３－ＭＡ）＋ｖｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ，ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）ｇｒｏｕｐ．ＩｎｆｅｃｔａｌｌｇｒｏｕｐｓｗｉｔｈＭｔｂｆｏｒ６ｈｏｕｒｓ．Ｉｎｔｈｅ４ｔｈｄａｙａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓＡＴＧ５，Ｂｅｃｌｉｎ－１ａｎｄＬＬ－３７，ＬＣ３Ｂｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ．ＬＣ３Ｂ－Ⅱａｎｄ／ｏｒ

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Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｎｔｉｇｅｎ８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）－ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏｕｎｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＡＴＧ５，Ｂｅｃｌｉｎ－１，ＬＬ－３７ａｎｄＬＣ３Ｂｗｅｒｅｅｎｈａｎｃｅｄ（Ｐ＜０．０１），ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆＬＣ３Ｂ－Ⅱ－ｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅ

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ｎｕｍｂｅｒｓｏｆＡｇ８５Ａ－ｃｅｌｌｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆＬＣ３Ｂ－Ⅱ－Ａｇ８５Ａ－ｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ（ｖｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ３８．０％ｖｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ１．０８％）．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｖｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＡＴＧ５，Ｂｅｃｌｉｎ－１ａｎｄＬＣ３Ｂｗｅｒｅｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅ

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ａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（３－ＭＡ）＋ＶｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＬＬ－３７ｗｅｒｅｒｅｄｕｃｅｄ，ａｎｄ３－ＭＡｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＣ３Ｂ－ⅡｉｎｃｅｌｌｓｗｉｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＬＣ３Ｂ－Ⅱ－Ａｇ８５Ａ－ｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅａｓｗｅｌｌ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＶｉｔａｍｉｎＤｃａｎｉｎｄｕｃｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｓｃａｖｅｎｇｉｎｇＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ＶｉｔａｍｉｎＤ；Ａｕｔｏｐｈａｇｙ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ

　　结核病（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）是由结核分枝杆菌（Ｍｙ－ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍｔｂ）引起的慢性传染性疾病，也是单一病原体感染导致死亡率仅次于艾滋病

［１］

的世界性传染病。然而，多药耐药结核的流行及

［２］

艾滋病的联合感染，结核病相关的免疫重建炎症

①本文为国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０８７２２６１）。

作者简介：万春辉（１９７８年－），女，主要从事肺部疾病与免疫的研究。通讯作者及指导教师：杜先智（１９６４年－），男，教授，硕士生导师，主

要从事肺部疾病与免疫的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｘｚｄｊｙ８６８＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。

综合征（ＴＢ－ＩＲＩＳ）带来的损伤，使结核病现有的

治疗方案正面临着的巨大挑战。维生素Ｄ是类固醇类激素超家族中的重要一员，１α，２５－二羟基维生素Ｄ［１，２５（ＯＨ）２Ｄ３］是维生素Ｄ的生理活性形式。研究发现，血清２５－羟基维生素Ｄ缺乏症与易患肺

［４］

结核和活动性病变的风险增加相关。本研究拟通过体外实验观察１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对巨噬细胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，Ｍφ）感染Ｍｔｂ后产生自噬及对清除Ｍｔｂ的作用。

［３］

万春辉等　维生素Ｄ诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用　第４期６

－１

・４５７・

１　材料与方法

１．１　材料

１．１．１　细胞系、菌株　人单核巨噬细胞系Ｕ９３７细胞购自中国典型培养物保藏中心。Ｍｔｂ标准人型毒力株Ｈ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ９３００９）由武汉市医疗救治中心实验室提供。１．１．２　主要试剂　１，２５（ＯＨ）２Ｄ３购自美国Ｓｉｇｍａ公司；豆蔻酰佛波醇乙酯（ＰＭＡ）、雷帕霉素、３－甲基腺嘌呤（３－ＭＡ）购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；ＴｒｉｚｏｌＲＮＡ提取试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＲＮＡ反转录试剂盒购自Ｔｈｅｒｍｏ公司；ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ等ＰＣＲ试剂购自ＴａＫａＲａ公司；ＰＣＲ引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；兔抗ＬＣ３Ｂ抗体购自Ｔｈｅｒｍｏ公司；鸡抗结核分枝杆菌抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）抗体购自Ｓｉｇｍａ公司；ＦＩＴＣ结合－驴抗兔ＩｇＧ、ＡＭＣＡ结合－驴抗鸡ＩｇＧ购自Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ公司；ＲＰＭＩ１６４０、胎牛血清购自ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司。１．２　方法１．２．１　细菌的培养　在生物安全柜中，按法国梅里埃公司米氏７Ｈ９液体培养基说明，将Ｈ３７Ｒｖ菌株接种于米氏７Ｈ９液体培养基，接种后的培养瓶置于法

溎

国梅里埃公司ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴＭＰ处理系统进行快速液体培养，取３周培养物以ＰＢＳ稀释成菌悬液，用生物梅里埃细菌浓度比浊仪测定其浊度，配制成

８

浓度为２×１０ＣＦＵ／ｍｌ的菌悬液，备用。１．２．２　细胞的培养、诱导分化　人单核巨噬细胞系Ｕ９３７细胞在含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基中培养，该培养基还含青霉素１００Ｕ／ｍｌ、链霉素１００Ｕ／ｍｌ，将细胞置于３７℃、５％ＣＯ２培养箱内培养。收集对数生长期的Ｕ９３７细胞接种于４个６孔板上，用不含抗生素的１０％ＲＰＭＩ１６４０培养基培养，细胞生

表１　ＰＣＲ引物

Ｔａｂ．１　Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆａｓｓａｙｅｄｇｅｎｅｓ

ＰｒｉｍｅｒＡＴＧ５长至浓度为２×１０ｍｌ时，分别加入１００ｎｇ／ｍｌＰＭＡ

孵育２４ｈ，诱导Ｕ９３７细胞分化使之具有吞噬能力。１．２．３　细胞的分组、感染　在生物安全柜中，将４个６孔板中已分化的Ｕ９３７细胞随机分为４组，分别为：①阴性对照组：以与维生素Ｄ组中加入的１，２５（ＯＨ）２Ｄ３等体积的ＲＰＭＩ１６４０培养基加入各孔；②维生素Ｄ组：１，２５（ＯＨ）２Ｄ３以１００ｐｍｏｌ／Ｌ加入各孔，作用６ｈ；③自噬抑制剂（３－ＭＡ）＋维生素Ｄ组：３－ＭＡ以１０μｍｏｌ／Ｌ加入各孔预处理２ｈ后，１，２５（ＯＨ）２Ｄ３以１００ｐｍｏｌ／Ｌ加入各孔，作用６ｈ；④阳性对照（雷帕霉素）组：雷帕霉素以５０μｇ／ｍｌ加入各孔，作用３ｈ。上述各组处理后，ＰＢＳ洗涤细胞４次

７

终止处理，再分别加入Ｍｔｂ悬液，浓度为２×１０ＣＦＵ／ｍｌ，感染６ｈ，未被吞噬的Ｍｔｂ以ＰＢＳ洗涤４次除去，不含抗生素的１０％ＲＰＭＩ１６４０培养基培养，感染第４天收集细胞。１．２．４　半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡＴＧ５、Ｂｅｃｌｉｎ－１、ＬＬ－３７、ＬＣ３ＢｍＲＮＡ表达　参照ＲＮＡ提取试剂盒说明

７

进行，１×１０细胞中加入１ｍｌＴｒｉｚｏｌ裂解细胞，移液枪反复吹吸，室温静置５ｍｉｎ，然后加入２００μｌ的氯仿，混匀，快速剧烈振荡３０ｓ，４℃静置５ｍｉｎ后１２０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１５ｍｉｎ；小心将上清液移至１．５ｍｌ离心管中，加入５００μｌ预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置１５ｍｉｎ后１２０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ，小心弃去上清液，再在离心管中加入预冷的７５％乙醇１ｍｌ，振荡片刻，１２０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心５ｍｉｎ，弃去上清液，室温静置干燥２～５ｍｉｎ，去ＲＮａｓｅ水溶解沉淀。用紫外分光光度计测总ＲＮＡ含量和纯度，以２μｇ总ＲＮＡ为模板，用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８为引物，按照说明书介绍的方法反转录合成ｃＤＮＡ。ＡＴＧ５、Ｂｅｃｌｉｎ－１、ＬＬ－３７、ＬＣ３Ｂ、ＧＡＰＤＨ引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表１）。将制取

Ｂｅｃｌｉｎ－１ＬＬ－３７ＬＣ３ＢＧＡＰＤＨ

Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＧＡＡＣＣＴＣＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＴＧＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧ－３′Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＣＣＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＧＣ－３′Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＣＣＴＴＡＴＣＡＣＡＡＣＴＧＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧ－３′

Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＴＣＴＴＴＧＴＴＣＧＡＡＧＧＴＧＣＧＧ－３′Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＡＴＣＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＴ－３′Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＡＧＧＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＣ－３′

Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＴＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＣＧ－３′

Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＡＡＧＡＴＧＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＴ－３′Ｓｅｑｕｅｎｃｅ１４５ｂｐ５１０ｂｐ２９１ｂｐ５９ｂｐ２５９ｂｐ

ＳｉｚｅＲｅｖｅｒｓｅ：５′－ＡＧＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴ－３′Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＡ－３′

・４５８・中国免疫学杂志２０１５年第３１卷２＋

的ｃＤＮＡ照下列条件扩增：１０×ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇｐｌｕｓ）５μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５μｍｏｌ／Ｌ）５μｌ、ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）２μｌ、ＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）２μｌ、模板ＤＮＡ２μｌ、ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、无核酸酶水调整总量至５０μｌ。然后设置９４℃预变性３ｍｉｎ、９４℃变性３０ｓ、５８℃退火３０ｓ、７２℃延伸３０ｓ、３５个循环后再７２℃延伸５ｍｉｎ，即得ＰＣＲ扩增产物，将ＰＣＲ产物４μｌ与５×ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ１μｌ混匀后，２％琼脂糖凝胶电泳胶３０Ｖ／ｃｍ电压进行电泳约２０ｍｉｎ。应用美国图１。

２．１．２　自噬相关基因Ｂｅｃｌｉｎ－１ｍＲＮＡ的表达水平　通过半定量ＲＴ－ＰＣＲ法观察各组在诱导Ｍｔｂ感染的Ｍφ后Ｂｅｃｌｉｎ－１表达的变化，阴性对照组、维生素Ｄ组、３－ＭＡ＋维生素Ｄ组、阳性对照组Ｂｅｃｌｉｎ－１ｍＲＮＡ相对表达量分别是０．１１０±０．０１９、０．７５０±０．０９０、０．１５２±０．０３６和０．５２９±０．０５９。维生素Ｄ组、阳性对照组Ｂｅｃｌｉｎ－１ｍＲＮＡ相对表达量明显多于阴性对照组（Ｐ＜０．０１），而３－ＭＡ＋维生素Ｄ组Ｂｅｃｌｉｎ－１ｍＲＮＡ相对表达量与阴性对照组无显著差ＢＩＯ电泳条带分析－ＲＡＤ凝胶成像系统摄影及图像分析软件进行。

１．２．５　流式细胞术检测ＬＣ３Ｂ－Ⅱ＋和／或Ａｇ８５Ａ＋

的细胞　收集、洗涤细胞并用含１０％胎牛血清、１％叠氮钠的冰冷ＰＢＳ将细胞重悬成５×１０６

细胞／ｍｌ，每管中加入１００μｌ冰冷的细胞悬液，每个样品加４％多聚甲醛１００μｌ，固定１５ｍｉｎ，用含０．２％吐温－２０的ｍｉｎＰＢＳｍｉｎ，然后每管加入洗涤细胞４０．次，每次２４００ｒ／ｍｉｎ，离心５含０．，通透细胞并除去不耐皂甙的２％皂甙１００μｌ，４℃静置１５２％吐温－２０的ＰＢＳ洗涤细胞ＬＣ４次后３Ｂ－Ⅰ，，用然后用５％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）封闭３０ｍｉｎ，再次洗涤细胞４次，加入兔抗ＬＣ３Ｂ的多克隆抗体、鸡抗Ａｇ８５Ａ抗体（３％ＢＳＡ稀释），４℃避光孵育３０ｍｉｎ，洗涤细胞４次，再加入ＦＩＴＣ结合－驴抗兔ＩｇＧ、ＡＭＣＡ结合－驴抗鸡ｍｉｎＩｇＧ钠的冰冷，洗涤细胞后的荧光二抗ＰＢＳ将细胞重悬，用（３％１ｍｌＢＳＡ含稀释），４℃避光孵育３０，３００１０％目的尼龙网过滤后胎牛血清、１％叠氮，立即上流式细胞仪进行检测。１．３　统计学处理　利用ＳＰＳＳ１３．０统计分析软件，实验数据以ｘ±ｓ表示，组与组之间采用ｔ检验，α＝０．０５。

２　结果

２．１　１，２５（ＯＨ）２Ｄ３诱导自噬相关基因ＡＴＧ５、Ｂｅｃｌｉｎ２．１．１　－１自噬相关基因及ＬＬ－３７、ＬＣ３ＢＡＴＧｍＲＮＡ５ｍＲＮＡ的表达水平

的表达水平　通过半定量Ｍ组φ、３－后ＭＡＡＴＧＲＴ－ＰＣＲ法观察各组在诱导Ｍｔｂ感染的＋维生素５表达的变化Ｄ组、阳性对照组，阴性对照组ＡＴＧ、５维生素ｍＲＮＡ相Ｄ对表达量分别是０．０９２±０．０１０、０．７９１±０．０６５、０．１２４±０．０１６和０．９３７±０．０５３。维生素Ｄ组、阳性对照组ＡＴＧ５ｍＲＮＡ相对表达量明显多于阴性对照组（Ｐ＜０．０１），而３－ＭＡ＋维生素Ｄ组ＡＴＧ５ｍＲＮＡ相对表达量与阴性对照组无显著差异（Ｐ＞０．０５）。见

异（Ｐ＞０．０５）。见图２。２ＰＣＲ．１．３达的变化法观察各组在诱导　ＬＬ－３７ｍＲＮＡ的表达水平Ｍｔｂ感染的　通过半定量Ｍφ后ＬＬ－ＲＴ－０．Ｄ组１６６±、阳性对照组，阴性对照组、维生素Ｄ组、３－ＭＡ＋维生素３７表０．０１８、１．６４５±ＬＬ－０．３７１０３、０．ｍＲＮＡ４８０±相对表达量分别是０．０５３和１．７０５±０．１２２。维生素Ｄ组、阳性对照组ＬＬ－３７ｍＲＮＡ相对表达量明显多于阴性对照组（Ｐ＜０．０１），３－ＭＡ＋维生素Ｄ组ＬＬ－３７ｍＲＮＡ相对表达量与阴性对照组比较有增加，但结果无显著性（Ｐ＞０．０５）。见图３。２ＰＣＲ．１．４表达的变化法观察各组在诱导　ＬＣ３ＢｍＲＮＡ的表达水平，阴性对照组、Ｍｔｂ维生素感染的　通过半定量Ｄ组、３－ＭＭＡφ后ＲＴ－＋维生素

ＬＣ３Ｂ图１　ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡＴＧ５的表达

Ｆｉｇ．１　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＡＴＧ５ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ

Ｎｏｔｅ：Ｍｇｒｏｕｐ．ＤＬ；３．１０００３－ＭＡＤＮＡ＋Ｖｉｔａｍｉｎｍａｒｋｅｒ；１．ＤＮｅｇａｔｉｖｅｇｒｏｕｐ；４．ｃｏｎｔｒｏｌＰｏｓｉｔｉｖｅｇｒｏｕｐｃｏｎｔｒｏｌ；２．ｇｒｏｕｐＶｉｔａｍｉｎ．❉．

Ｄ

Ｐ＜０．０１．

图２　ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｂｅｃｌｉｎ－１的表达

Ｆｉｇ．２　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＢｅｃｌｉｎ－１ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ

Ｎｏｔｅ：Ｍｇｒｏｕｐ．ＤＬ１０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；２．ＶｉｔａｍｉｎＤ

Ｐ＜０．０１．

；３．３－ＭＡ＋ＶｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ；４．Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．❉．

万春辉等　维生素Ｄ诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用　第４期・４５９・

图３　ＲＴ－ＰＣＲ检测ＬＬ－３７的表达

Ｆｉｇ．３　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＬＬ－３７ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ

Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＬ１０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；２．ＶｉｔａｍｉｎＤ

Ｐ＜０．０１．

ｇｒｏｕｐ；３．３－ＭＡ＋ＶｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ；４．Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．❉．

图４　ＲＴ－ＰＣＲ检测ＬＣ３Ｂ的表达

Ｆｉｇ．４　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＬＣ３ＢｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ

Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＬ１０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；２．ＶｉｔａｍｉｎＤ

Ｐ＜０．０１．

ｇｒｏｕｐ；３．３－ＭＡ＋ＶｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ；４．Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．❉．

图５　流式细胞术检测ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－细胞和／或Ａｇ８５Ａ－细胞

Ｆｉｇ．５　ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－ｃｅｌｌｓａｎｄ／ｏｒＡｇ８５Ａ－ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏｕｎｔｅｄｂｙＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ

＋

＋

＋＋

Ｎｏｔｅ：Ａ．Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；Ｂ．ＶｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ；Ｃ．３－ＭＡ＋ＶｉｔａｍｉｎＤｇｒｏｕｐ；Ｄ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．

Ｄ组、阳性对照组ＬＣ３ＢｍＲＮＡ相对表达量分别是０．０９７±０．０２３、１．１３０±０．０５７、０．０２８±０．００６和１．０８２±０．０５６。维生素Ｄ组、阳性对照组ＬＣ３ＢｍＲＮＡ相对表达量明显多于阴性对照组（Ｐ＜０．０１），而３－ＭＡ＋维生素Ｄ组ＬＣ３ＢｍＲＮＡ相对表达量与阴性对照组无显著差异（Ｐ＞０．０５）。见图４。２．２　１，２５（ＯＨ）２Ｄ３诱导ＬＣ３Ｂ－Ⅱ蛋白表达对感染细胞内结核分枝杆菌Ａｇ８５Ａ的影响　各组在诱导

＋

Ｍｔｂ感染的Ｍφ后，流式细胞术计数ＬＣ３－ⅡＢ－细胞

＋

和／或Ａｇ８５Ａ－细胞。在感染Ｍｔｂ灭活菌４ｄ后，阴

＋＋

性对照组ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－细胞占２８．３８％，Ａｇ８５Ａ－细胞

＋

占８８．３％。相比之下，维生素Ｄ组ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－细胞增多（７１．５％），Ａｇ８５Ａ－细胞减少（４３．４８％），且

＋－

ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－Ａｇ８５Ａ－细胞增加（维生素Ｄ组３８．０％比阴性对照组１．０８％）。与维生素Ｄ组表现一致，阳

＋＋

性对照组ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－细胞增多（７３．６％），Ａｇ８５Ａ－细胞减少（３８．１２％）。与维生素Ｄ组相比，在自噬抑制剂３－ＭＡ＋维生素Ｄ组中，３－ＭＡ抑制了细胞ＬＣ３Ｂ－Ⅱ的表达（１０．９１７％），同时抑制了１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－Ａｇ８５Ａ－细胞的增加（３－ＭＡ＋维生素Ｄ组０．６１７％比维生素Ｄ组３８．０％）。见图５。

＋

－

＋

３　讨论

我国是世界结核病高负担国家之一，结核病仍然是影响国民健康、制约经济发展的重大传染病。

机体的抗结核免疫主要是通过Ｔ淋巴细胞介导的Ｍφ的细胞免疫反应，Ｍφ是机体主动防御系统的一线细胞，也是Ｍｔｂ在体内主要的效应细胞和储存宿主。Ｍφ的自噬（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ）是指细胞通过双层膜包裹部分胞质和细胞内需要降解的细胞器、病原微生物等成分形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并降解其所包裹的内容物的过程。自噬是一种重要的免疫防御机制，Ｍφ可通过自噬作用清除进入胞内的多种病毒和细菌。在结核免疫机制中，Ｍφ通过吞噬入侵的Ｍｔｂ，经溶酶体等加工处理后，进行抗原呈递，致敏、活化淋巴细胞。进入胞内的Ｍｔｂ通过抑制自噬体与溶酶体的融合，以抑制Ｍφ对Ｍｔｂ的降解，导致Ｍｔｂ可长期存在于活的Ｍφ内、逃避机体免疫杀伤，并进行细菌生长

［５］

。在感

染的初始阶段，Ｍφ与Ｍｔｂ的相互作用处于中心地位，它们之间的抗衡决定了疾病进一步发展的方向。因此，细胞免疫功能低下者为结核病的高危人群；而

・４６０・中国免疫学杂志２０１５年第３１卷控制Ｍφ效应功能，如ＩＦＮγ（Ｍφ的活化因子），可增强Ｍφ抗微生物活性。一方面，利用雷帕霉素、ＩＦＮ－γ、脂多糖可通过不同的机制诱导Ｍφ发生自噬，促

［６，７］

进Ｍφ内Ｍｔｂ的清除。另一方面，Ｍｔｂ感染的Ｍφ的抗原呈递功能，可通过雷帕霉素诱导自噬而显著增强，并可通过自噬抑制剂３－甲基腺嘌呤（３－

［８］

ＭＡ）或ｓｉＲＮＡ干扰Ｂｅｃｌｉｎ抑制自噬而明显减弱。

这些分子及干预措施对Ｍφ效应功能的精确调控是通过自噬信号通路实现的，如ＰＩ３Ｋ－Ⅰ／ＡＫＴ－

２＋

ｍＴＯＲ信号转导通路、Ｃａ／ＣａＭＫＫβ－ＡＭＰＫ－ｍＴＯＲ

［９－１１］

过ＬＬ－３７诱导自噬作用，从而加强炎症反应；另

一方面，ＬＬ－３７可通过增强ｍＴＯＲ（Ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ，哺乳动物雷帕霉素靶点）的磷酸化，减少炎性细胞因子的分泌，以刺激线粒体生物合成和维持线

［１６］

粒体内稳态的方式发挥减弱炎症损害的能力。ＬＬ－３７的这些作用机理提示，１，２５（ＯＨ）２Ｄ３不仅能通过ＬＬ－３７诱发自噬作用，增强抗菌能力，而且还可能通过ＬＬ－３７的免疫调节作用，减少结核病相关的免疫重建炎症综合征（ＴＢ－ＩＲＩＳ）带来的损伤。

本实验结果显示，生理浓度的１，２５（ＯＨ）２Ｄ３可诱导Ｍｔｂ感染的Ｍφ产生自噬作用，并以自噬的方［１７］

信号转导通路、ＰＩ３Ｋ－Ⅲ／Ｂｅｃｌｉｎ－ＡＴＧ信号通路。值得注意的是，维生素Ｄ对于诱导Ｍφ自噬以及自噬溶酶体的成熟发挥关键调节作用Ｔｏｌｌ达，－ＣＹＰ样受体２７Ｂ１２／使１激动剂可上调２５（ＯＨ）ＤＭφ内。ＣＹＰＭｔｂ２７Ｂ来源的１的表３羟化为１，２５（ＯＨ）２Ｄ３，后者Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ激活并上调噬通量的诱发，ＶＤＲ维生素Ｄ受体（ＶｉｔａｍｉｎＤ［１２］

）的表达。目前的技术手段虽然不能测量，导致抗菌肽（ＬＬ－３７）和自

自噬通量本身，但可以通过相关的分子标志反映自噬的ｌｉｇｈｔ饰状态ｃｈａｉｎ水平。，ＬＣ３３ＢＬＣ３Ｂ（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１Ｂ）－Ⅰ蛋白存在具有可溶性ＬＣ３Ｂ，－不耐皂甙Ⅰ和ＬＣ３Ｂ，－主要在自Ⅱ两种修噬的初期表达，ＬＣ３Ｂ－Ⅱ作为监测自噬溶酶体形成的唯一的分子标志，其表达水平的增高能够反映自噬的诱导，而且此变化主要是由ＬＣ３Ｂ－Ⅰ经磷脂酰乙醇胺修饰活化为ＬＣ３Ｂ－Ⅱ所致，因此是以ＬＣ３Ｂ－Ⅱ／内参作为评价ＬＣ３Ｂ－Ⅱ表达水平的指标，而非

ＬＣ３Ｂ－Ⅱ／ＬＣ３Ｂ－Ⅰ［１３］

。此外，ＡＴＧ５、Ｂｅｃｌｉｎ－１（ＡＴＧ６）也都参与自噬溶酶体的形成。在自噬体的演变过程中，ＡＴＧ５与ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６Ｌ在自噬体膜上形成复合物，继而具有泛素蛋白连接酶（Ｅ３）样活性，并特

异性地促进蛋白与脂质的结合［１４］

。Ｂｅｃｌｉｎ－１与催化亚基Ｖｐｓ３４（ＣｌａｓｓⅢＰＩ３Ｋ，Ⅲ类磷脂酰肌醇３磷酸激酶）、蛋白激酶Ｖｐｓ１５一起成为ＰＩ３Ｋ复合物的核

心组分，参与自噬体的形成［１１］

。而ＰＩ３Ｋ抑制剂３－ＭＡ，可干扰或阻断自噬体的形成ｐｅｐｔｉｄｅ人抗菌肽（ｔｈｅｈｕｍａｎｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ。

ｍｉｃｒｏｂｉａｌ基酸组成的小分子碱性多肽，ＣＡＭＰ）在细胞核糖体合成，具有较强的阳离子特，为１２～６０个氨征和两亲性结构。目前，唯一明确的人类抗菌肽被称为人类阳离子抗微生物蛋白（ｈＣＡＰ－１８），ＬＬ－３７是作为有活性的Ｃ－末端肽从ｈＣＡＰ－１８裂解所得的［１５］

，具有广泛的免疫活性，发挥既亲炎又抗炎的

效应［１６］

。一方面，ＬＬ－３７在依赖１，２５（ＯＨ）２Ｄ３的自噬信号通路中位于Ｂｅｃｌｉｎ－１上游，１，２５（ＯＨ）２Ｄ３通

式清除胞内的Ｍｔｂ。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３的处理，在显著增强Ｍφ内自噬相关基因及自噬分子标志ＬＣ３Ｂ－Ⅱ

表达的同时，减少了Ａｇ８５Ａ＋

－细胞，提示胞内Ｍｔｂ发生降解的细胞增多；同时可以看到１，２５（ＯＨ）２加ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－Ａｇ８５Ａ－

－细胞这一突出表现，即Ｄ３增

＋

１，２５（ＯＨ）２Ｄ３可以增强Ｍφ对Ｍｔｂ的降解，而且这种作用的发生是伴随ＬＣ３Ｂ－Ⅱ的表达而实现的。ＬＣ３Ｂ－Ⅱ－－Ａｇ８５Ａ－－细胞数量无明显改变，也说明在ＬＣ３Ｂ－Ⅱ表达阴性时，Ｍφ对Ｍｔｂ的降解作用不能发挥。因此，采用３－ＭＡ抑制ＰＩ３Ｋ、继而抑制下游ＬＣ３Ｂ－Ⅱ表达时，１，２５（ＯＨ）２Ｄ３诱导自噬的作用被抑制，同时也抑制了自噬对Ｍｔｂ的清除。实验还发现，３－ＭＡ抑制ＰＩ３Ｋ的同时，ＬＬ－３７的表达较维生素Ｄ组减少，但并未被完全抑制。产生这种现象的原因可能是ＭＡ：３－噬后减少了对胞内并不能直接抑制ＭＡ抑制的ＰＩ３ＫＭｔｂＬＬ位于的杀灭－３７的表达ＬＬ－３７的下游，因此３－，较多的；但由于抑制自Ｍｔｂ在胞内

生长繁殖并诱导Ｍφ发生凋亡［１８］

，以致产生ＬＬ－３７的细胞减少。

一个有趣的发现是，雷帕霉素作为本实验自噬的阳性对照，有新的研究表明其通过下调ｍＴＯＲ而激活Ｆｏｒｋｈｅａｄ转录因子（ＦＫＨ），进而直接上调果蝇

抗菌肽的表达［１９］

，与之一致的是，在本实验中雷帕霉素的诱导增强了ＬＬ－３７的表达，这是首次发现雷帕霉素诱导增强人抗菌肽的表达。

综上所述，本实验研究表明，１，２５（ＯＨ）２并进一步有助于巨噬细Ｄ３诱导巨噬细胞产生自噬作用，胞清除Ｍｔｂ，并对其分子机制及进行了阐述，１，２５（ＯＨ）２新的可行的方法Ｄ３可能成为结核病治疗和预防领域的一个。但１，２５（ＯＨ）２Ｄ３在维持免疫动态平衡，抑制病原微生物的生长和避免机体过度反应造成免疫损伤中的调节机制还有待深入的研究。

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（编辑　张晓舟）

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（编辑　许四平）

维生素D诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

万春辉， 杜先智， WAN Chun-Hui， DU Xian-Zhi重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆,400010中国免疫学杂志

Chinese Journal of Immunology2015(4)

引用本文格式：万春辉.杜先智.WAN Chun-Hui.DU Xian-Zhi 维生素D诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用[期刊论文]-中国免疫学杂志 2015(4)