Ａ Ｃ Ｔ ＾ ＾日ＲＩＣＵＬＴＵＲｎＥ 华北农学报矗０ＲＥｎＬＩ－ＳＩｎＩＣ＿ ・２０１０，２５（增刊）：５．８ 花生Ｃｌｐ蛋白酶基因（ＡｈＣｌｐＰ）的克隆与序列分析 纪鸿飞 ，彭振英 ，马 敬 ，毕玉平 （１．山东师范大学生命科学学院，山东济南２５００１４；２．山东省农业科学院 ２５０１００；３．农业部黄淮海作物遗传 高新技术研究中心，山东省作物与畜禽品种改良生物技术重点实验室，山东济南改良与生物技术重点实验室，山东济南２５０１００） 摘要：Ｃｌｐ蛋白酶通过蛋白质水解作用来清除细胞内由逆境引起的异常和具有潜在毒性的蛋白或多肽，从而保证 细胞正常的生理功能。从优质大花生鲁花ｌ４种子不同发育时期混合ｅＤＮＡ文库中发现一条序列，全长为１ ２１２ ｂｐ，３ 端含有ｐｏｌｙＡ尾，通过ｂｌａｓｔｘ搜索得知其为Ｃｌｐ蛋白酶基因。该序列与ＧｅｎＢａｎｋ中ＥＺ７３６３９０．１的序列相似性达到 ９９％。以该花生ｃＤＮＡ序列为模板设计引物，以花生幼嫩种子ｅＤＮＡ为模板克隆得到花生Ｃｌｐ蛋白酶基因。序列分 析表明，ＡｈＣｌｐＰ基因的开放阅读框长度为８４３ ｂｐ．编码２８０个氨基酸，预测其分子量为３０．９ ｋＤａ，等电点为９．０７，编码 的蛋白包含Ｓ１４一ＣｌｐＰ一２保守结构域，无信号肽，定位于线粒体。通过与其他植物Ｃｌｐ蛋白酶的氨基酸序列比对，发现 与拟南芥、蓖麻的Ｃｌｐ蛋白酶同源性较高。花生ＡｈＣｌｐＰ基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。 关键词：花生；Ｃｌｐ蛋白酶；克隆；序列分析 中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００—７０９１（２０１０）增刊一０００５—０４ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｏｆ Ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ Ｌ． ＪＩ Ｈｏｎｇ—ｆｅｉ‘，ＰＥＮＧ Ｚｈｅｎ—ｙｉｎｇ ，ＭＡ Ｊｉｎｇ‘，ＢＩ Ｙｕ—ｐｉｎｇ ’ ’ （１．Ｃｏｌｌａｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ ２５００ １４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｈｉ—Ｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｏｕｌｔｒｙ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｊｉｎａｎ ２５０ １ ００，Ｃｈｉｎａ；３．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｎｇｈｕａｉｈａｉ，Ｍｉｎｉｓｔｙ ｏｆｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｊｉｎａｎ ２５０１００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｌｐ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｏｒｄｉｎａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｂｙ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ａｂｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｔｏｘｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｓｔｒｅｓｓ．Ｂｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ ｓｅｅｄｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ｃｕｈｉｖａｒ Ｌｕｈｕａ １４，ｗｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ １ ２１２ ｂｐ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙＡ ｉｎ ３ ｅｎｄ．Ｂｙ ｂｌａｓｔｘ ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｗａｓ ａ ＣｌｐＰ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｈａｄ ９９％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ＥＺ７３６３９０．１ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｂａｎｋ．Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｅｎｄｅｒ ｐｅａｎｕｔ ｓｅｅｄ ｃＤＮＡ，ｗｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ＡｈＣｌｐＰ ｇｅｎｅ．Ｓｅ— ｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｏｆ ＡｈＣｌｐＰ ｇｅｎｅ ｈａｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｌａｍｅ ｏｆ ８４３ ｂｐ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ２８０ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｓ ａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ３０．９ ｋＤａ ａｎｄ ａｎ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ９．０７．Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ Ｓ１４ＣｌｐＰ２ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ，ｈａｓ ｎｏ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｓｕｂｌｏｃａｔｅｓ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｔｒｉａ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ——＿ｏｔｈｅｒ ＣｌｐＰ ｍｅｍｂｅｒｓ，ＡｈＣｌｐＰ ｈａｓ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｎｄ Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ． Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＡｈＣＩｐＰ ｇｅｎｅ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ Ｌ．；Ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ；Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｃｌｐ蛋白酶广泛存在于各种生物体内并且具有 非常重要的生理功能。Ｃｌｐ蛋白酶参与错误折叠蛋 中发挥重要作用…。在逆境条件刺激下，细胞会产 生一些不可逆损伤的蛋白或多肽，而这种不可逆损 伤的蛋白会对细胞产生某种毒害作用或者干扰正常 白降解、短命蛋白调控和错误功能蛋白移除，调节代 谢途径中限速酶的水平来控制代谢过程的进行，从 而保证细胞正常生理功能，在生物蛋白质代谢调控 代谢过程的进行，在这种情况下会有许多Ｃｌｐ蛋白 酶产生，通过蛋白质水解作用清除非正常和具有潜 收稿日期：２０１０—１０—２４ 基金项目：国家自然科学基金（３０８７１５４１） 作者简介：纪鸿飞（１９８５一），女，Ｉ【ｊ东即墨人，硕士研究生，主要从事发育生物学研究。 通讯作者：毕玉平（１９６１一），男，ｌＩＪ东青州人，研究员，博士生导师，主要从事植物分子生物学研究。 ｎ Ｃ Ｔ ＾—— 矗目Ｒ１０ＵＬＴＵ舟Ａ￡ ６ ＵＯＲＥＡＬＩ－－ＳｌｌｆｌＩ￣Ａ－－・——— 华北农学报 ２５卷 在毒性的蛋白或多肽 。 相似性达到９９％。以该序列为模板利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０ 花生是我国重要的油料和经济作物之一，种植 面积约５０２．５万ｋｍ ，总产量居世界首位 。花生 软件设计上游引物ＡｈＣｌｐ—ｓ（５ 一ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴ— ＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＧＴＡ—Ｔ一３ ，划线处为Ｂａｍ Ｈ Ｉ酶切 位点）和下游引物ＡｈＣｌｐ・Ａ（５ 一ＣＣＧＧＡＡＴ— ＴＣ ＡＣＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＡＴ３ ，划线处为ＥｃｏＲ Ｉ 在其生长过程中经常会遭受到不同程度的生物和非 生物逆境胁迫，这些胁迫严重影响植物的生长发育， 并对农业生产造成极大的负面影响 。研究发现， 酶切位点），由华大公司合成。ＰＣＲ扩增反应程序 为：９４℃预变性５ ｍｉｎ，９４℃变性３０ ｓ，５２ ｏＣ退火３０ Ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，３５个循环后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。 在长期的生物进化过程中，植物自身已经发展了多 种抵抗胁迫的机制，以通过调节自身生理和代谢变 化来抵御逆境。其中Ｃｌｐ蛋白酶通过蛋白质水解作 ＰＣＲ产物用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测。将与目标 用清除由逆境引起的不可逆损伤蛋白或多肽，是非 常重要的一项机制 。同时Ｃｌｐ蛋白酶通过控制代 谢过程中关键酶的稳定性而调节其含量，从而保证 代谢过程的正常进行。如Ｃｌｐ类蛋白组成的复合体 是一个逆境协调蛋白，它通过对叶绿体内非正常状 态蛋白的水解作用来维持细胞蛋白的动态平衡，从 而适应环境条件的变化 。 本试验从优质大花生鲁花ｌ４种子不同发育时 期混合ｃＤＮＡ文库中获得了ＡｈＣｌｐＰ基因，利用ＰＣＲ 获得目的片段，对其进行生物信息学分析，为今后的 转基因工作奠定基础。 １ 材料和方法 １．１试验材料 １．１．１植物材料试材料为优质出口型大花生鲁 花ｌ４，种植于山东省农业科学院实验农场。 １．１．２试验试剂ＲＮＡ的ＣＴＡＢ提取液由本实验 室配制，ＤＮＡ回收试剂盒（ＴＩＡＮＧＥＮ），反转录试剂 盒（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ），ＬａＴａｑ酶（Ｔａｋａｒａ），其他常规化学试 剂均为国产分析纯。 １．１．３载体及菌株ｐＭＤ１ ８－Ｔ克隆载体（Ｔａｋａｒａ）， 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ）ＤＨ５ｃ￣由本实验室保存。 １．２ 方法 １．２．１ 花生种子总ＲＮＡ的提取、纯化及反转录 称取０．２ ｇ花生幼嫩种子加入液氮研磨，用ＣＴＡＢ— ＬｉＣ１法提取总ＲＮＡ。按照Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司的反转录 试剂盒操作程序进行反转录，得到完整的ｃＤＮＡ第一 条链。所有ｅＤＮＡ样品均保存于一２０℃冰箱中备用。 １．２。２ 目的基因的获得与克隆 通过构建优质大 花生鲁花１４种子不同发育时期混合ｅＤＮＡ文库，随 机挑取１０ ０００余个克隆进行５ 端测序，部分序列进 行３ 端测序。向ＧｅｎＢａｎｋ注册了７ ４５４个ＥＳＴ序列 （ＥＥＩ２３３４０一ＥＥ１２７７４５、ＥＧ３７２４７３一ＥＧ３７４２７０、 ＥＧ５２９４５４一ＥＧ５３０７０５）。在尚未提交的序列中发 现一条双向测序、拼接后长度为１ ２１２ ｂｐ的序列，含 有３ ＰｏｌｙＡ尾，其与ＧｅｎＢａｎｋ中ＥＺ７３６３９０．１的序列 基因大小一致的ＰＣＲ产物回收。回收的目的片段 连入ｐＭＤ１８一Ｔ克隆载体测序。 １．２．３ 目的基因的序列分析 目的基因序列是采 用ＮＣＢＩ数据库ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ． ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍ１）在线分析获得开放阅读框， 使用Ｐｒｉｍｅｒ５．０翻译获得氨基酸序列，登陆网站ｈｔ－ ｔｐ：∥ＷＷＷ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ—ｔｏｏ１．ｈｔｍｌ推测目的基 因编码蛋白的分子量和理论等电点。蛋白质的保守 结构域通过ｈｔｔｐ：∥ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃ— ｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｄ．ｃｇｉ网站获得；信号肽预测分析通过 ｈｔｔｐ：∥ＷＷＷ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｔａ ｇｅｔＰ和ｈｔｔｐ：／／ ＷＷＷ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｓｉｇｎａｌＰ获得；跨膜区预测 分析利用ｈｔｔｐ：∥ＷＷＷ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ 一２．０获得；亚细胞定位预测分析通过ｈｔｔｐ：∥ＷＷＷ． ｂｉｏｉｎｆｏ．ｔｓｉｎｇｈｕａ．ｅｄｕ．ｃｎ／ＳｕｂＬｏｃ获得。将推测的氨 基酸序列与ＧｅｎＢａｎｋ中其他物种Ｃｌｐ氨基酸序列用 ＤＮＡＭＡＮ软件进行比对分析，获得系统发生树。 ２ 结果与分析 ２．１ ＡｈＣｌｐＰ基因的克隆 利用特异性引物ＡｈＣｌｐ—Ｓ和ＡｈＣｌｐ—Ａ，以花生 幼嫩种子ｃＤＮＡ为模板扩增后得到约１ ｋｂ的产物， 与预期目的片段大小一致（图１．Ａ）。目的片段与 ｐＭＤ１８．Ｔ载体连接转化后，经蓝白斑筛选。挑取白斑 菌落，做菌落ＰＣＲ验证，扩增出来的片段大小与目的 片段大小一致（图１一Ｂ）。经测序得知，序列长度为 ９９１ ｂｐ。用ＤＮＡＭＡＮ软件比对后，发现与优质大花 生鲁花１４不同种子发育时期混ｃＤＮＡ文库中已知序 列完全符合，初步断定成功克隆出ＡｈＣｌｐＰ基因。 ２．２ ＡｈＣＩｐＰ基因序列分析及蛋白预测分析 用ＮＣＢＩ中的ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ分析得知，该基因具 有完整的开放阅读框（ＯＲＦ），从ＡｈＣＩｐＰ基因１３０ ｂｐ 处的起始密码子ＡＴＧ至９７０ ｂｐ处的ＴＡＡ（图２），推 测该基因编码的蛋白质含有２８０个氨基酸，预测其 相对分子量为３０．９ ｋＤａ，等电点为９．０７。用ＮＣＢＩ 的ＣＤＤ软件分析该蛋白的保守结构域，发现从９０ ｎ Ｃ Ｔ ＾ 增刊 纪鸿飞等：花生Ｃｌｐ蛋白酶基因（ＡｈＣ￣Ｐ）的克隆与序列分析 ７ ●６ＲＩＧＵＬＴＵＲＡＥ ＢＯＲＥｇＩ．Ｉ－ＳＩＨＩ∞ 到２６０氨基酸之问含有Ｓ１４一ＣｌｐＰ＿２保守结构域（图 ３）。通过ＴａｒｇｅｔＰ和ＳｉｇｎａｌＰ分析，发现ＡｈＣｌｐＰ蛋白 ＤＮＡＭＡＮ软件将该基因氨基酸序列与其他六种植 物 ’川氨基酸序列进行比对，发现有很高的同源性； 进行系统进化分析，由图可知：花生最先与拟南芥、 蓖麻聚类，再与玉米、水稻聚类（图４）。结果表明： 花生与拟南芥、蓖麻亲缘关系较近。 没有信号肽，推测其可能不是分泌蛋白。用ＴＭ— ＨＭＭ一２．０分析得知，该蛋白不含跨膜结构域，属于 膜外蛋白（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ＴＭＨｓ：０）。 亚细胞定位分析显示该蛋白位于线粒体。利用 １ ｏ（）０ｂ 图１ ＡｈＣｌ宣，ｐＰ的ＲＴ－ＰＣＲ扩增ｌ ｝ Ａ）和白斑菌落ＰＣＲ检测【Ｂ）■ ９１ ｂ ｐ Ｆｉｇ．１ ＲＴ－ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＡｈＣｌｐＰ（Ａ）ａｎｄ ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ｓｐｏｔ（Ｂ） ｌ ＡＧＡＴＣＧＡＡＡＣＧＧＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧＴＴＴ ７０ ＴｃＴＴｃＡＡＧｃＴｃＡＡ＾ＴＡＧＴＧＴＧＴＴｃｃｃｃｃｃＴｃｃｃ且ＴｃＴｃＴＴｃＧＴＴＡｃｃＴｃＡＡＡＡＡＧｃＴＡＡＴ墨三曼ＧＣＧＧＴＴ １ Ｈ ＾ Ｖ ｌ３９ ＧＣＡＣＣＣＴＡＴＡＴＣＡＡＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＴＡＧＴＴＧＣＧＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＡ ４ Ａ Ｐ Ｙ Ｉ Ｎ Ａ Ａ Ａ Ｐ Ｐ Ｓ Ｃ Ａ Ｔ Ｋ Ｌ Ｙ Ｓ Ｇ Ｌ Ｋ Ｌ Ｑ ２Ｏ８ ＴＣＴＣＴＡＡＧＴＡＴＣＣＣＴＡＡＴＴＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＡＡＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＡＡＡＡＧＴＴＣＡＣ ２７ Ｓ Ｌ Ｓ Ｉ Ｐ Ｎ Ｓ Ｌ Ａ Ｃ Ｋ Ｐ Ｎ Ｖ Ｓ Ａ Ｅ Ｆ Ｙ Ｇ Ｋ Ｖ Ｈ ２７７ ＡＡＧＡＧＴＣＴＧＣＡＴＴＧＣＧＧＧＴＡＴＧＣＴＡＡＴＣＡＣＡＡＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＣＣＡＴＡＧＧＧ ５０ Ｋ Ｓ Ｌ Ｈ Ｃ Ｇ Ｙ ＾ Ｎ Ｈ Ｋ Ｐ Ａ Ｒ Ａ Ｑ Ｉ Ｑ ｌｑ Ｍ Ｐ Ｉ Ｇ ３４６ ＡＣＣＣＣＴＡＧＡＧＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＴＧＧＣＡＡＴＧＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴＧＣＣＣＴＴ ７３ Ｔ Ｐ Ｒ Ｖ Ｐ Ｙ Ｒ Ｔ Ｐ Ｇ Ｅ Ｇ Ｔ Ⅵ Ｑ Ｖ Ｄ Ｌ Ⅵ Ｎ Ａ Ｌ ４ｌ５ ＴＡＴＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＧＡＣＡＡＡＡＣＡＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＴＴＡＧＴＡＡＣＣＡＡＧＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣ ９６ Ｙ Ｒ Ｅ Ｒ Ｖ Ｌ Ｆ Ｉ Ｇ Ｑ Ｎ Ｉ Ｄ Ｅ Ｅ Ｆ Ｓ Ｎ Ｑ Ｖ Ｌ Ａ Ｔ ４８４ ＡＴＧＣＴＧＴＡＴＣＴＴＧＡＣＡＧＴＡＴＡＧＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴ １ｌ９ Ｈ Ｌ Ｙ Ｌ Ｄ Ｓ Ｉ Ｄ Ｎ Ａ Ｋ Ｒ Ｍ Ｙ Ｍ Ｙ Ｉ Ｎ Ｇ Ｐ Ｇ Ｇ Ｄ ５５３ ＣＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＴＡＡＣＣＡＣＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴ １４２ Ｌ Ｔ Ｐ Ｓ Ｌ Ａ Ｉ Ｙ Ｄ Ｔ Ｍ Ｑ Ｓ Ｌ Ｑ Ｓ Ｐ Ｖ Ｔ Ｔ Ｈ Ｃ Ｖ ６２２ ＧＧＣＴＡＴＧＣＣＴＡＴＡＡＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＣＣＧＣＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＣＴ １６５ Ｇ Ｙ Ａ Ｙ Ｎ Ｌ Ａ Ａ Ｆ Ｌ Ｌ Ａ Ａ Ｇ Ｅ Ｋ Ｇ Ｎ Ｒ Ｆ Ａ Ｈ Ｐ ６９１ ＣＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＧＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧ＾ＴＧＡＣＡＴＣＣＧＣ＾ＡＴＧＡＡ １８８ Ｌ Ｓ Ｒ Ｖ Ａ Ｌ Ｑ Ｓ Ｐ ＾ Ｇ Ａ Ａ Ｒ Ｇ Ｑ Ａ Ｄ Ｄ Ｉ Ｒ Ｎ Ｅ ７６Ｏ ＧＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＴＴＡＡＧＡＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＡＡＣＧＡＧＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴ ２１１ Ａ Ｎ Ｅ Ｌ Ｌ Ｒ Ｉ Ｒ Ｄ Ｙ Ｌ Ｆ Ｎ Ｅ Ｌ Ａ Ｋ Ｋ Ｔ Ｇ Ｑ Ｐ Ｖ ８２９ ＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＣＴＴ ２３４ Ｅ Ｒ Ｉ Ｔ Ｏ Ｄ Ｌ Ｇ Ｒ Ｈ Ｋ Ｒ Ｆ Ｎ Ａ Ｑ Ｅ Ａ Ｌ Ｄ Ｙ Ｇ Ｌ ８９８ ＡＴＴＧＡＴＣＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＴＴ ２５７ Ｉ Ｄ Ｒ Ｉ Ｖ Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ Ｉ Ｋ Ａ Ｄ Ａ Ｐ Ｎ Ｋ Ｅ Ａ Ｇ Ｔ Ｇ Ｌ ９６７ ＧＧＴ ６ＡＡｃＴｃＡＴＧＧＴＴＴＧＴｃＡｃｃｃＡＧｃｃＡＧＡＧＴＡｃＴｃＡＴＡＡＴＡＴＴＡｃＡＧＡＡｃｃＡＧＧＡＴＴＧＴＴＴｃＴｃＧ ２８Ｏ Ｇ １０３６ ＴＧＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＡＴＧＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＧＧＣＡ ｌ１０５ ＡＡＧＡＴＡＡＴＴＧＧＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴＡＡＡＴＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＡ ｌ１７４ ＧＣＴＴＴＡＡＧＴＴＣＧＴＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ 下划线表示起始密码子和终止密码子的位置。 Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｃｏｄｅｓ ｏｆ ｉｎｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ． 图２ ＡｈＣｉｐＰ基因ｃＤＮＡ全长序列 Ｆｉｇ．２ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ ＡｈＣｌｐＰ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ Ｌ． ●Ｃ Ｔ ｌ— ＡＯＲＩＣＵＬＴＵＲＡＥ ８ 华北农学报 ２５卷 ＢＯＲＥＡＬＩ・・ＳｉｌｌｉＣＡ－－．—— ５０ １００ １５０ ２００ ２５０ ２８０ 一 ～ ～ 一 ～ ～＆ 一一 ． 。ｌｉｇ０ｍ。 ｉ ｔｅｒｆ 。丝箍 １ ： 望 譬 图３ ＡｈＣＩｐＰ蛋白的保守结构域 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＡｈＣＩｐＰ １ｏ０％９０％８０ ％７０ ％６０％５０％４０．％． Ｚｍ—ＣＩｐＲ２ａａ．玉米，Ｚｅａ ｍａｙｓ．ＡＣＧ２７９９２．１；Ｏｓ—ＣＩｐＰ—ａａ．水稻 Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ，ＢＡＤ６８４６２．１；ＲｃＣ｜ｐＰ—ａｌ１．．蓖麻，Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ＥＥＦ５１０１５．１；ＡｔＣｌｐＲ２—～ａｎ．拟南芥，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｌａｎａ， ＮＰ＿５６３９０７．１；Ｇｔ—ＣｌｐＰ—ａａ．Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ，ＸＰ Ｏ０１７ ｌ３５６２．１； ＯｔＣｌｐＰａａ．Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｌｔｓ ｔａｕｒｉ，ＣＡＬ５７８７８．１。 —图４ 花生ＡｈＣＩｐＰ氨基酸序列与其他物种氨基酸 序列的系统进化树 Ｆｉｇ．４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＡｈＣＩｐＰ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ３ 讨论 本研究中，从花生中克隆并鉴定了ＡｈＣｌｐＰ基 因。用ＮＣＢＩ中的ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ分析找出该基因具有 完整的开放阅读框（ＯＲＦ），编码的蛋白质含有２８０ 个氨基酸，从９０到２６０氨基酸之间含有Ｓ１４一ＣｌｐＰ一２ 保守结构域。进行同源性比对发现与其他植物的 ＣｌｐＰ有很高的同源性。挑选相似性较高的序列进 行多序列比对，结果发现这些蛋白在ｓ１４一ＣｌｐＰ＿２结 构域处序列非常保守；进行系统进化分析得知花生 ＡｈＣＩｐＰ与拟南芥和蓖麻亲缘关系最近，其次是玉米 和水稻。 拟南芥ＣＩｐＲ２是ＣＩＰ复合体蛋白的非冗余组 分，Ｃｌｐｒ２ 突变体在持续的长日条件下，表现植株 颜色浅，茎尖发育推迟和晚花现象，光合系统Ⅱ部分 失活，显示出该基因的功能与光反应、生殖发育紧密 相关 。陈晓等 随后发现ＰＬ５Ｌ１５是玉米Ｃｌｐ蛋 白酶家族的Ｃ Ｒ２一ＬＩＫＥ基因，同ＣｌｐＲ２基因具有相 似功能，参与玉米Ｃｌｐ蛋白复合体组成，水解异常蛋 白分子，在光周期反应条件下同玉米生殖分化有关。 ＰＬ５Ｌ１５在短日条件下显示出与生殖分化敏感时期 相一致的表达规律，在Ｋ ｒｊ条件下六叶到九叶期，均 表现出异常高表达，明 高于短日处理，说明长¨环 境诱导了该基因更高水平的上调表达。由于花生 ＣＬＰ蛋白酶与拟南芥、玉米等的Ｃｌｐ蛋白酶具有较 高相似性，因此推测ＡｈＣｌｐＰ可能在花生光反应、生 殖发育中起作用。另外ＡｈＣｌｐＰ可能能够清除逆境 环境条件下产生的一些不可逆损伤的蛋白或多肽， 防止这种不可逆损伤的蛋白对细胞产生某种毒害作 用或者干扰正常代谢过程的进行。当然，还需要进 一步的试验结果来证实其在光反应、生殖发育及应 对逆境中的具体作用。 植物的光反应、生殖分化以及响应逆境的机制 在整个生物生命过程中占有至关重要的地位。植物 中对ＣｌｐＰ蛋白酶家族的研究较少，大部分Ｃｌｐ家族 的基因功能尚未确定，仅处于基因克隆、序列分析、 结构鉴定、表达分析等初级阶段。因此，需借助于蛋 白相互作用及ｍｉＲＮＡ等技术进一步研究这些基因 的功能。 参考文献： ［１］ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ Ｓ．Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｕｌｌ ｌ Ｊ １．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，１９９６，３０：４６５． ［２］ 王振海，孙野青．Ｃｌｐ蛋白酶研究进展［Ｊ］．药物生物技 术，２００５，１２（６）：４Ｉ２—４１５． ［３］ 万书波．花生品质学［Ｍ］．北京：中国农业科学技术出 版社，２００５：２—１０． ［４］邵凤霞．花生ＮＡＣ转录因子的克隆和功能分析［Ｄ］． 山东：山东师范大学，２００９． ［５］ 王晓慧．水稻Ｐ 一＾ ，基因的表达及相互作用蛋白的分 析［Ｄ］．黑龙江：哈尔滨工业大学，２００７． ［６］ Ａｄａｍ ｚ，Ａｄａｍｓｋａ Ｉ，Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ Ｋ，ｅｌ ａ１．Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ａ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２５（４）：１９１２— １９ｌ８． 『７］Ｄｅｒｅｌｌｅ Ｅ，Ｆｅｒｒａｚ Ｃ，Ｒｏｍｂａｕｔｓ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｍａｌｌｅｓｔ ｆｒｅｅ・－ｌｉｖｉｎｇ ｅｕｋａｒｙｏｔｅ Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ ｔｉｎ・－ ｖｅｉｌｓ ｍａｎｙ ｕｎｉｑｕｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｌ Ｊ Ｉ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｅｉ，Ｕ Ｓ Ａ，２００６，１０３（３１）：ＩＩ６４７一ｌｊ６５２． ［８］Ｄｏｕｇｌａｓ Ｓ，Ｚａｕｎｅｒ Ｓ，Ｆｒａｕｎｈｏｌｚ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅ— ｄｕｅｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｓｌａ￣，ｅｄ ａｌｇａｌ ｎＵＣＪｃｕ８［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， ２００１，４１０（６８３２）：１０９１—１０９６． ［９］ Ｒｕｄｅｌｌａ Ａ，Ｆｒｉｓｏ Ｇ，Ａｈｍｓｏ Ｊ Ｍ，ｅｌ ｕ１．Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉ０ｎ ０ｆ ＣｌｐＲ２ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣｌｐＰＲＳ ｐｒｏ— ｔｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｃｈｈ，ｒｏｐｌａｓｔ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒ— ａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００６，ｌ８（７）：ｌ７０４—１７２１． ［１０］ 陈 晓，孙朝辉．李思远，等．玉米ＣｌｐＲ２同源基因 ＰＬ５Ｌ１５的克隆及其在不同光周期处理下的表达分 析【Ｊ］．分子植物育种，２００８．６（６）：１ １８７一Ｉ】９２．