６ 粮食与油脂 ２０１ １年第１０期 油茶总皂甙抑菌活性及清除活性氧能力初步研究 唐红枫 ，孙茜 ，张雨婷 ，戴立华 ，程时劲 （１．武汉东湖学院生命科学与化学学院， 湖北武汉４３０２１２； ２．湖北省疾病预防控制中心， 湖北武汉４３００７９） 摘 要：用溶剂法提取油茶饼中油茶总皂甙，经柱层析制备标准品标定有效成分含量为８２．５％。 以油茶皂甙为材料对枯草杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行抑菌试验，结果表明均有抑制作用； 其中对枯草杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用较强，２０％浓度对三种细菌均具有致死作用，抑菌囤 直径大小与油茶总皂甙浓度呈正相关；且初步测定油茶总皂甙清除活性氧能力强于维生素ｃ。 关键词：油茶皂甙；抑菌圈；活性氧 Ａｎｔｔｎｕｃｒｏｂｍｌ ａｃｔｉｏｎ ‘ ０ ‘ ’ ‘ ’ －‘ ａｎｄ ｓｅａＶｅｎｇ］一 ■Ｉ ｎｇ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｌｅｓ Ｏｔ ｔｅａｓａｐｏｍｎ ０ － ‘■ ０ ＴＡＮＧ Ｈｏｎｇ－￣ｎｇ ，ＳＵＮ Ｑｉａｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ－ｔｉｎｇ ，ＤＡＩ Ｌｉ－ｈｕａ ，ＣＨＥＮＧ Ｓｈｉ－ｊｉｎ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。Ｗｕｈａｎ Ｄｏｎｇｈｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３０２１２，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｗｕｈａｎ ４３００７９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｗｉｔｈ ｔｅａｓａｐｏｎｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｔｅａ ｃａｋｅｓ．Ｉｔ ｗａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｅａｓａｐｏｎｉｎ ｈａｄ ａ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｒｅｓｔｒａｉｎｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、 ＳｔａｐｈｙｌＯＣＯＣＣＵＳ ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．２０％ｏｆ ｔｅａｓａｐｏｎｉｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｒｅ ｌｅｔｈａｌ ｅｆｆｅｃｔ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｉｒｃｌｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅａｓａｐｏｎｉｎｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｔｅａｓａｐｏｎｉｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｅａｓａｐｏｎｉｎ；ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｉｒｃｌｅ；ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ 中图分类号：ＴＱ６４５．９＋９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—９５７８（２０１１）１０—０００６～０３ 葡萄球菌（ＳｔａｐｈｙｌＯＣＯＣＣＵＳ ａｕＩ＇ｅｕｓ），枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），武汉大学生命科学院微生物实验室提供。细 菌采用牛肉膏蛋白胨培养基。 １．３实验仪器 油茶皂甙是一种五环三萜类皂素，为几种三萜 皂甙元与结构糖、结构酸所形成复杂化合物混合物。 油茶皂甙具有良好乳化、分散、发泡、湿润等功能，并 具有消炎、镇痛，抗渗透等药理作用 ｑ 。生物体 内自由基导致脂质过氧化及抗氧化平衡与一些疾病 炎症发生具有密切关系。活性氧（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）是由连续单电子还原而产生一系列毒 性中间物，其中危害较大的包括超氧阴离子自由基 （０２・）和羟自由基（・ＯＨ）。其中，０２．可通过细胞膜阴 离子通道，与一些生物分子直接反应；・ＯＨ氧化能力 最强，其一旦产生，便能与碰到任何分子发生反应。 因此，清除活性氧对预防疾病具有重要意义。 本研究以粗提油茶总皂甙为药剂，采用体外抑菌 活性实验方法探讨油茶总皂甙对常见食品腐败菌抑 菌活性，并初步研究油茶总皂甙对０２－．和・ＯＨ清除作 用；为能有效开发油茶饼中功能性成分，提高油茶饼 有效利用率和减少资源浪费等方面起到促进作用。 １实验材料 １．１实验原料 索氏提取器：天津市玻璃仪器厂；ＧＺＸ一９２４０型 ＭＢＥ数显鼓风干燥箱：上海博弈实业有限公司医疗 设备厂；ＳＨＺ—Ｄ（ＩＩＩ）循环水式真空泵：上海予华仪 器设备厂；Ｓｃｉｅｎｔｚ一１０Ｎ真空冷冻干燥机：宁波新芝 生物科技股份有限公司；ＳＰ一１９０１ｕｌｖ型紫外可见分 光光度计、荧光分光光度计：上海光谱仪器有限公司； 恒温培养箱：上海申贤恒温设备厂。 ２实验方法 ２．１油茶皂甙提取 油茶饼：购于湖北省麻城市，成分含量测定：凯 氏定氮法 测得粗蛋白为１６．２７％；索氏抽提法 测 得脂类为７．３５％；碳水化合物 为４５．６５％。 １．２实验菌种 食品腐败菌：大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），金黄色 收稿日期：２０１卜０９—０６ 基金项目：国家科技部国家科技支撑计划（２００６ＢＡＪ０２Ａ１０） 将油茶饼粉碎，取１００ ｇ以ｌ：３料液比将样品及 ７５％乙醇 装入索氏提取器，置于７０℃水浴锅中水 浴２小时，抽滤得滤液；将滤渣仍以１：３料液比进行 二次浸提 ；合并滤液加入适量活性炭，静置过夜， 处理二次；抽滤得滤液，低温浓缩，浓缩液中加入等体 积石油醚萃取脱除油脂，真空冷冻干燥，得油茶总皂 甙样品。 ２．２油茶皂甙标准品制备 纯化：将经预处理ＡＢ－８树脂装入１０×３００ ｍｌＴ１ 层析柱中，装柱高度２４０ ｍｍ。油茶皂甙样品溶于 ６５％乙醇，８０。Ｃ水浴冷凝回流２ ｈ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 作者简介：唐红枫（１９８０￣），男，硕士，讲师，研究方向为分子毒理学。 ２０１ １年第ｌ０期 粮食与油脂 ７ １０ ｒａｉｎ，得乙醇提取物。在层析柱中加入ｌ０ ｍｌ处理 后乙醇提取物，上样流速１ ｍｌ／ｍｉｎ，上样结束后，加 入５０ ｍ１去离子水洗脱，流速设置为１ ｍｌ／ｍｉｎ，再用 ５０％乙醇洗脱，流速０．５ ｍｌ／ｍｉｎ，收集洗脱液，控制 每管量为５ ｍｌ，进行浓缩。将油茶皂甙浓缩液加入 等体积丙酮，搅拌混匀，４￣Ｃ抽提２４ ｈ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 心５ ｍｉｎ，得油茶皂甙沉淀，去掉上清液，真空冷冻干 燥，得淡黄色油茶皂甙晶体，即为高纯度油茶皂甙标 准品。 纯度验证：称取少量所得标准品，溶于甲醇溶液， 浓度约为１ ｍｇ／ｍＬ，进行紫外光谱扫描，得紫外光谱 图。 ２．３供试菌种准备 菌种活化：取菌种使用划线法将其接种于固体培 养基中，培养２４ ｈ；挑取单菌落于相应液体培养基中， ３７￣Ｃ培养２４ ｈ。 ２．４不同浓度茶皂素溶液配置 将５０％油茶皂甙样品溶液灭菌后分别用无菌水 稀释成５０％、２０％、１５％、１０％、５％、２．５％、１．２５％等浓 度梯度，备用。 ２．５抑茵试验 ２．５．１细菌生长活性实验 分别配制一定油茶皂甙样品浓度培养基斜面，倒 置３７℃培养４８ ｈ，经无菌检验合格后，用无菌生理盐 水分别将活化后微生物菌种制成分散均匀悬浮液，调 整浓度，使菌体或孢子浓度约为１０。个／ｍＬ，吸取０．１ ｍｌ 菌悬液涂布平板，３７℃恒温箱中培养，待未加药物的 对照管中细菌形成良好菌落后即读取结果 。 ２．５．２抑菌圈测定 将活化后菌种准确吸取１ ｍｌ原菌液，分别稀释成 １０～、ｌ０＿。、１０ 三个浓度梯度。吸取０．１ ｍｌ稀释后各 菌液，涂布平板，再用镊子将浸过不同浓度油茶皂甙 液且凉干后圆滤纸片（滤纸起始直径为１０ ｍｉｎ）放于 培养基平板中，３７￣Ｃ下倒置培养２４ ｈ 。按垂直方向 量取各抑菌圈直径，记录结果，每种滤纸片做三次重 复，结果取平均值。 ２．６油茶总皂甙清除０２．能力测定 按文献［１０、１１］，采用邻苯三酚自氧化法。邻苯 三酚在弱碱性（磷酸盐缓冲液ｐＨ ８．２）环境中自身氧 化分解产生０２－．，该体系常用于测定ＳＯＤ或类似ＳＯＤ 活性物质ｇ，￣ｏｃ．歧化活性。随着反应进行，０２－・在反应 体系中不断积累，导致反应液在３２５ ｎｍ处吸光值其 后５ ｍｉｎ内随时间变化而线性增大。因此，在该时间 范围内于３２５ ｎｍ处测定含油茶总皂甙反应液吸光度 随时间变化率，并与维生素Ｃ相比较，可得出被测物 清除０２－・能力。 ２．７油茶总皂甙清除・ＯＨ能力 清除・ＯＨ能力测定采用文献［１２］方法。 ３结果与分析 ３．１油茶皂甙标准品纯度检测及粗制样品含量测定 紫外光谱分析如图１所示。采用重结晶法制备油 茶皂甙在２１９ ｎｍ处表现为最大吸收峰，在２８０ ｎｍ处 有一微弱小峰。侯如燕“引等研究结果表明，油茶皂 甙在紫外光谱下２１５ ｎｍ处有最大吸收峰，在２８０ ｎｍ 处有微弱吸收峰，这与本实验结果描述基本一致，因 此本法所制备茶皂素纯度很高，可用作标准品。以此 标准品做标准曲线，采用香草醛一硫酸显色法“ 检 测油茶皂甙样品中皂甙含量为８２．５％。 ３５ ．２０ ．０５ ≤ ．９０ ．７５ ．６０ ．４５ ．３０ ．１５ ０ ２００ ２５０ ３００ ３５０ ４００ ４５０ 波长／ｎｍ 图１油茶皂甙标准品紫外吸收光谱 ３．２三种细菌在不同浓度和油茶皂甙培养基中生长活性 表１不同浓度油茶总皂甙对三种细菌抑菌活性 注：“＋”表示有生长；“一”表示无生长。 由表１可知，高浓度油茶总皂甙对典型革兰氏阳 性细菌金黄色葡萄球菌和枯草杆菌具有杀灭作用，且 对金黄色葡萄球菌抑制能力较强，在１０％以上浓度下 均不能生长；而对革兰氏阴性细菌大肠杆菌抑制作用 较弱，从培养皿中菌落计数来看，均多于同浓度条件 下枯草杆菌和金黄色葡萄球菌菌落总数。 ３．３抑菌圈测定结果 油茶总皂甙浓度 图２油茶皂总甙浓度与抑菌圈直径关系 由图２可知，不同质量浓度油茶皂甙溶液抑菌效 果具有明显规律，随油茶皂甙样品溶液质量浓度升 高，抑菌圈直径呈现明显浓度依赖性，表现为递增趋 势。油茶皂甙对三种受试食物腐败菌具有广谱抑菌 活性，高浓度下对革兰氏阳性菌抑制作用强于革兰氏 阴性菌。油茶皂甙是一种亲水性非离子型表面活性 剂，据夏春华 等采用临界胶囊浓度测定，其亲水亲 ８ 粮食与油脂 ２０１ １年第１０期 油平衡值（ＨＬＢ）为ｌ６。而实验工作人员常用Ｔｒｉｔｏｎ ｘ一１００（ＨＬＢ为１４．６）等作为表面活性剂提取生物膜 的酶和蛋白质，而油茶皂甙ＨＬＢ与Ｔｒｉｔｏｎ ｘ一１００ＨＬＢ 较为接近，因此油茶皂甙可能对微生物生物膜及酶的 活性构成损害。油茶皂甙可能抑菌机理是其产生基团 能吸附于菌体表面“引，改变细胞膜通透性，使胞质内 容物漏出，从而起到杀菌作用。 ３．４油茶总皂甙清除０２．能力 一 １００ 维油—１ｊ ８Ｏ 瓤 Ｃ皂—＿—■ Ｌ 甙料６Ｏ 篷 Ｉ［Ｕ 蝗４Ｏ ０ 。＿＿＿＿Ｉｌ［＝＝＝＝＝●＿Ｉ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝］ ２Ｏ ０ ０．１ ０－２ ０．４ ０．８ 浓度／ｍｇ／ｍＬ 图３油茶总皂甙和维生素Ｃ清除２－．能力比较 由图３可看出，随浓度增大，维生素Ｃ和油茶总 皂甙清除０２・能力都在增强，但前者明显低于后者。维 生素Ｃ作为非酶性抗氧化剂，能直接参与体内氧化一 还原及羟化反应，清除活性氧，从而能有效保护机体。 而油茶总皂甙与其相比，则具有更强抗氧化性，因此 同样具备广泛用途。 ３．５油茶总皂甙清除・０Ｈ能力 图４油茶总皂甙和维生素Ｃ清除・ＯＨ能力比较 本实验利用Ｆｅｎｔｏｎ反应产生・ＯＨ，从而定量测 定油茶总皂甙对・ＯＨ清除能力。从图４可看出，油茶 总皂甙对这一体系产生・ＯＨ有明显清除作用。在０－４ ｍｇ／ｍＬ浓度时，油茶总皂甙对・ＯＨ清除率达４０％，相 当于维生素Ｃ在０．８ ｍｇ／ｍＬ浓度时清除能力。由此 可说明，油茶总皂甙具有较强清除・ＯＨ作用，且其清 除能力明显强于维生素Ｃ。 ４结论 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌是食品生 产、加工、贮藏过程常见腐败菌种，我国每年因发霉变 质而损失粮食约为总产量５％；因此对食品防霉防腐 剂研究历来有着重要应用价值。 本研究所提取油茶总皂甙，经柱层析处理，乙醇冷 凝回流制备标准品标定有效成分含量为８２．５％。在抑 菌实验中，２０％浓度油茶总皂甙对细菌具有致死作用， 而在低浓度时，其也能呈现一定程度抑菌活性。其抑 制机理可能在于其表面活性作用，破坏微生物细胞膜 或影响生物酶活性、影响细菌新陈代谢而导致这些食 品腐败菌个体死亡。在清除活性氧能力测定中，粗提 油茶总皂甙清除０２．和・ＯＨ能力明显强于维生素Ｃ。 油茶皂甙作为一种天然优良非离子型表面活性 剂，由于具备多种功效，在日用化工领域用途广泛；同 时油茶皂甙还具有消炎镇痛、抗肿瘤、抗真菌、抗氧 化、抗高血压、抑制酒精吸收保护肠胃、灭螺、杀血吸 虫等生理活性 钊；因此，在日化、农业、医疗领域具有 广泛应用价值和应用前景。 ［参考文献］ ［１］Ｓａｇｅｓａｋａｍ Ｕ，Ｅｍｕｒａ Ｔ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｅａ－ｌｅａｆ ｓａｐｏｎｉｎ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｌ９９６，１１６（３）：２３８—２４３． （２］夏辉，田呈瑞．茶皂素提取纯化及生物活性研究进展［Ｊ］．粮食 与油脂，２００７（６）：４ｌ一４４． ［３］吴晓荣，叶祥盛，等．流动注射法与凯氏定氮法测定土壤全氮 的比较［Ｊ］．华中农业大学学报，２００９，２８（５）：５６Ｏ一５６３． ［４］冯慧，洪家敏．索氏抽提法测定大豆粉中脂肪含量方法改进研 究［Ｊ］．中国食物与营养，２００９（５）：５０—５１． 【５］李颖，潘雪燕．分光光度法测定并分析六堡茶中碳水化合物含 量【Ｊ］．广西轻工业，２０１０，２６（１２）：ｌＯ—ｌ１． ［６］赵斌，张文．茶皂甙提取及精制的研究［Ｊ］．郑州工程学院学报， ２００ｌ，２２（３）：４６～５２． ［７］刘昌盛，黄风洪，等．超声波法提取茶皂素的工艺研究［Ｊ］．中国 油料作物学报，２００６，２８（２）：２Ｏ３—２０６ ［８］侯如燕，宛晓春，黄继轸，采用大孔树脂法纯化油茶皂苷的工 艺条件［Ｊ］．食品与发酵工业，２００５，３０（５）：１３Ｏ一１３２． ［９］王向军，田呈瑞，蒋萌蒙．油茶饼提取物抗氧化作用及抑菌效 果的研究［Ｊ］．中国 由脂，２００８，３３（７）：４０—４４． 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