・４６・ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＪｏｕｒｎａＩ ｏｆ ｌ ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ＴＣＭ Ｊａｎ．２０１ ４ Ｖｏ １．２１ Ｎｏ．１ 滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病大鼠 大脑皮质内质网应激的影响 胡守玉’，梁丽娜 ，战丽彬’ ，郑路平 ，余丹 ，张福良 １．大连医科大学附属第二医院，辽宁大连１ １６０２３；２．大连医科大学，辽宁大连１ １６０４４ 摘要：目的观察脾阴虚糖尿病大鼠大脑皮质磷酸化（Ｐ）ＲＮＡ依赖的蛋白激酶样内质网激酶（ＰＥＲＫ）、真核 起始因子２ Ｑ一亚单位（ｅｌＦ２ ａ）、ｐ－－ｅＩＦ２ Ｑ、葡萄糖调节蛋白７８（ＧＲＰ７８）的变化，探讨脾阴虚糖尿病相关认知下 降发病机制及滋补脾阴方药的作用机制。方法将大鼠随机分为对照组、糖尿病组、脾阴虚组、脾阴虚糖尿病 组（病证组）、脾阴虚糖尿病＋滋补脾阴方药组（治疗组）。采用高脂喂养４周联合小剂量链脲佐菌素注射方法建 立２型糖尿病模型。在此基础上采用饮食不节、劳倦过度及灌服伤阴药方法建立脾阴虚糖尿病模型。治疗组给 予滋补脾阴方药灌胃，其余各组给予等体积生理盐水灌胃，连续１５ ｄ，取大脑皮质。采用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ、ＲＴ－ＰＣＲ 方法观察ＰＥＲＫ、ｅＩＦ２ Ｑ、ｐ－－ｅＩＦ２ Ｑ、ＧＲＰ７８表达变化。结果糖尿病组、脾阴虚组、病证组ＰＥＲＫ、ｐ－ｅＩＦ２ Ｑ 蛋白表达及ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡ表达较对照组增强（Ｐ＜Ｏ．０５），糖尿病组、病证组ＧＲＰ７８蛋白表达较对照组增强（尸＜ ０．０５），治疗组上述分子表达较糖尿病组、病证组均减弱（Ｐ＜Ｏ．０５）。结论内质网应激参与脾阴虚糖尿病相关 认知下降的发病，滋补脾阴方药通过减轻内质网应激改善学习记忆障碍。 关键词：滋补脾阴方药：内质网应激：脾阴虚；糖尿病相关认知下降：大鼠 Ｄ０ Ｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５—５３０４．２０１４．０１．０１５ 中图分类号ｉ Ｒ２８５．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００５－５３０４（２０１４）０１－００４６—０４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｚｉｂｕ Ｐｉｙｉｎ Ｒｅｃｉｐｅ ｏｎ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｏｒｔｅｘ ｏｆ Ｓｐｌｅｅｎ Ｙｉｎ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｄｉａｂｅｔｅｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｄｅｃｌｉｎｅ Ｒａｔｓ ＨＵ Ｓｈｏｕ．ｙｕ ，ＬＩＡＮＧ Ｌｉ—ｎａ２，ＺＨＡＮ Ｌｉ．ｂｉｎｌ， ， ＺＨＥＮＧ Ｌｕ－ｐｉｎｇｉ，ＹＵ Ｄａｎｚ，ＺＨＡＮＧ Ｆｕ－ｌｉａｎｇ ｛１．Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＤａｌｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｌｉａｎ １１６０２３．Ｃｈｉｎａ；２．Ｄａｌｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，Ｄａｌｉａｎ １１６０４４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｐｌｅｅｎ ｙｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｉａｂｅｔｅｓ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ（ＤＡＣＤ）ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｚｉｎｕ Ｐｉｙｉｎ Ｒｅｃｉｐｅ（ＺＢＰＹＲ）ｂｙ ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ＲＮＡ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ—ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅ（ＰＥＲＫ）， ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２ｏ ｓｕｂｕｎｉｔ（ｅｌＦ２ａ），Ｐ—ｅｌＦ２ａ，ｇｌｕｃｏｓｅ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ７８（ＧＲＰ７８）ｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｏｆ ｓｐｌｅｅｎ ｙｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｇｒｏｕｐ，ｓｐｌｅｅｎ ｙｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｇｒｏｕｐ，ｓｐｌｅｅｎ ｙｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｇｒｏｕｐ（ｄｉｓｅａｓｅ—ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｒｏｕｐ）ａｎｄ ｓｐｌｅｅｎ ｙｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ＋ｚＢＰＩＹＲ ｇｒｏｕｐ（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）．Ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｍｏｄｅｌｓ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ—ｆａｔ ｆｏｏｄ ｆｅｅｄｉｎｇ ｆｏｒ ４ ｗｅｅｋｓ ａｎｄ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ＳＴＺ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｓｐｌｅｅｎ ｙｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒａｔｓ ｍｏｄｅｌ ｂｙ ｉｍｐｒｏｐｅｒ ｄｉｅｔ，ｏｖｅｒ ｅｘｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｎ ｆｌｕｉｄｓ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｇｉｖｅｎ ＺＢＰＹＲ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｇｉｖｅｎ ｅｑｕａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ ｏｆｒ １ ５ ｄａｙｓ，ｔｈｅｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐ—ＰＥＲＫ，Ｐ—ｅＩＦ２ａ，ｅＩＦ２ａ ａｎｄ ＧＲＰ７８ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ ａｎｄ ＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ—ＰＥＲＫ，Ｐ—ｅｌＦ２ａ，ａｎｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＲＰ７８ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｇｒｏｕｐ， ｓｐｌｅｅｎ ｙｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ—ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ 基金项目：国家自然科学基金面上项目（３０７７２８４７）；辽宁省高校优秀人才支持计划（ＬＲ２００１０１５）：教育部高等学校博士学科点专 项科研基金（２００７０１ ６１ ００４、２０１ １ ２１ ０５１ １ ０００６） 通讯作者：战丽彬，Ｅ－Ｔｎａｉ Ｉ：ＺＩｂｄ１ ０４＠ｗｉＰ．１６３．ｃｏｍ ２０１４年１月第２１卷第１期 中国中医药信息杂志 ・４７・ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．ＧＲＰ７８ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｇｒｏｕｐ，ｄｉｓｅａｓｅ—ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＰ—ＰＥＲＫ，Ｐ—ｅｌＦ２ａ， ＧＲＰ７８ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＲＰ７８ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅＵｉｔｕｓ ｇｒｏｕｐ ｎｄ ａｄｉｓｅａｓｅ—ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｒｏｕｐ ｆＰ＜Ｏ．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｐｌｅｅｎ ｙｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＡＣＤ．ＺＢＰＹＲ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｚｉｂｕ Ｐｉｙｉｎ Ｒｅｃｉｐｅ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ：ｓｐｌｅｅｎ ｙｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ；ｄｉａｂｅｔｅｓ— ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ：ｒａｔｓ 糖尿病相蔻认知下降（ｄｉａｂｅｔｅｓ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｇｎｉ ｒｉｖｅ ｄｅｃｌ ｉｎｅ，ＤＡＣＤ）又称糖尿病认知功能障碍， 是糖尿病中枢神经系统并发症，主要表现为轻、中度 认知功能障碍。其发病机制复杂，可能与胰岛素抵抗、 高血糖毒性、低血糖损害、脂毒性、炎性反应等因素 有关…。内质网应激（ＥＲＳ）参与糖尿病的发生，并与神 经退行性疾病有关，但其在ＤＡＣＤ中的作用尚不明确。 本研究通过Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ及ＲＴ—ＰＣＲ方法观察各 组大鼠大脑皮质ＥＲＳ标志分子蛋白激酶样内质网激酶 （ＰＥＲＫ）、真核起始因子２ Ｑ一亚单位（ｅＩＦ２ Ｑ）、磷酸化 （Ｐ）一ｅＩＦ２ Ｑ、葡萄糖调节蛋白７８（ＧＲＰ７８）的变化，研究 ＥＲＳ在ＤＡＣＤ发病中的作用，探讨ＥＲＳ与脾阴虚的内在 联系，并评价滋补脾阴方药对其影响，以进一步明确 ＤＡＣＤ的发病机制及滋补脾阴方药的作用机制，为ＤＡＣＤ 的临床治疗提供实验依据。 １材料与方法 １．１ 动物 ＳＰＦ级健康成年雄性ｓＤ大鼠，体质量（２００±２０）ｇ， 购自大连医科大学实验动物中心，许可证号： ＳＣＸＫ（辽）２００８－０００２；ＳＰＦ级环境饲养，温度（２２±３）℃， 湿度５０％，明暗交替１２ ｈ。 １．２ 药物 滋补脾阴方药（人参、山药、白芍、白扁豆、茯 神、檀香等）和伤阴药（吴茱萸、制附子、肉桂）均一 次性购自大连美罗医药公司，常规水煎，滋补脾阴方 药每毫升药液中含原药材３．２９ ｇ，伤阴药每毫升药液 中含原药材药１ ｇ，过滤后４℃保存备用。 １．３试剂与仪器 普通饲料：按照中华人民共和国《实验动物小鼠 大鼠配合饲料》（ＧＢ１４９２４．３－２００１）进行配制，购自南 京安立默科技有限公司。高脂饲料参照文献［２］配方： 每ｌ ｋｇ高脂饲料含酪蛋白２３６ ｇ、ＤＬ一甲硫氨酸３．５４ ｇ、 蔗糖１００ ｇ、玉米淀粉２４２．６２ ｇ、麦芽糊精１２０ ｇ、 氢化的植物油制起酥油１００ ｇ、猪油１００ ｇ、纤维素 ４０ ｇ、矿物质混合物ＡＩＮ一９３Ｇ—ＭＸ（９４０４６）４１．３ ｇ、碳 酸氢钙４．７２ ｇ、维生素混合物ｌ１．８ ｇ、乙氧喹０．０２ ｇ， 购自南京安立默科技有限公司。Ａｎｔｉ－ｐ－ＰＥＲＫ（＃３１７９）、 Ａｎｔｉ—ｅＩＦ２ ａ（＃９７２２）、Ａｎｔｉ—ｐ—ｅｌＦ２ Ｑ（＃９７２１）抗体均 购自Ｃｅｌ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司；Ａｎｔｉ—ＫＤＥＬ（ＳＰＡ一８２７一Ｄ）抗 体购自Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ公司；Ａｎｔｉ—ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（＃９３１０）、 Ａｎｔｉ—ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（＃９３４０）购自ＧＥ公司；增强化学发光 （ＥＣＬ）试剂盒（批号１ １３６３５１４９１０）购自Ｒｏｃｈｅ公司。台 式高速离心机，ＬＥＧＥＮＤ Ｍｉｒｃｏ２１Ｒ，Ｔｈｅｒｍｏ公司；垂直 电泳仪，ＥＰＳ一３０１，ＧＥ公司；全自动荧光、化学发光凝 胶成像系统，ＢｉｏＳｐｅｎｃｔｒｕｍ ８１０，ＵＶＰ公司。 １．４造模、分组与给药 大鼠适应性喂养３ ｄ后，随机分为对照组、糖尿 病组、脾阴虚组、脾阴虚糖尿病组（简称“病证组”） 和脾阴虚糖尿病＋滋补脾阴方药组（简称“治疗组”）５ 组，每组４只。采用高脂饮食４周联合低剂量链脲佐 菌素（ＳＴＺ）３０ ｍｇ／ｋｇ腹腔注射制备２型糖尿病模型。 随机血糖＞ｌ６．７ ｍｍｏｌ／Ｌ确定为２型糖尿病模型建立 成功。测定空腹血清胰岛素（ＦＳＩ）以判断是否存在高 胰岛素血症，口服葡萄糖耐量实验（ＯＧＴＴ）以判定是否 存在糖耐量异常，胰岛素耐量实验（ＩＴＴ）以验证是否 存在胰岛素抵抗。在此基础上，采用饮食不节、劳倦 过度、灌服伤阴药方法建立脾阴虚糖尿病模型，并对 脾阴虚糖尿病大鼠给予滋补脾阴方药灌胃３２．９ ｇ／ｋｇ 每日１次，其余各组给予等体积生理盐水灌胃，连续 １５ ｄ。通过水迷宫实验判定大鼠是否存在认知功能障 碍。然后处死大鼠，取大脑皮质。具体造模方法及模 型判定方法参照文献［３］。 １．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢＩｏｔ观察蛋白激酶样内质网激酶、真 核起始因子２ Ｑ一亚单位、葡萄糖调节蛋白７８、磷酸 化一真核起始因子２ Ｑ一亚单位蛋白表达变化 取大脑皮质提取总蛋白，将制备好的蛋白样品加 入１０％及８％凝胶中电泳，转膜，５％脱脂牛奶封闭２．５ ｈ， 加入一抗（１：８００），４℃过夜，ＴＢＳＴ洗膜，１０ ｍｉｎ×３， 加入二抗（１：２５００），ＴＢＳＴ洗膜，１０ ｍｉｎＸ３，ＥＣＬ发光显 影。蛋白表达条带采用Ｂａｎｄｓｃａｎ软件进行分析，将 ＰＥＲＫ、ｅＩＦ２ Ｑ、ｐ－ｅＩＦ２ Ｑ、ＧＲＰ７８ ＩＯＤ值与所对应样品 的 —ａｃｔｉｎ ＩＯＤ值进行比较，分析各蛋白表达水平。 ・４８・ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＪｏｕｒｎａＩ ｏｆ Ｉ ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ＴＣＭ Ｊａｎ．２０１４ ＶｏＩ．２１ Ｎｏ．１ １．６ ＲＴ—ＰＣＲ观察各组大鼠葡萄糖调节蛋白７８基因 表达变化 １．７统计学方法 ０ ０ Ｏ ０ ０ Ｏ９ ８ ７ ６ ５ ４采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行分析。所有实验数据 。０Ｈ露表示差异有统计学意义。 以提取的ＲＮＡ为模板合成ｅＤＮＡ，反应体系：总ＲＮＡ 用ｉ±ｓ表示，多组间均数比较采用方差分析。Ｐ＜Ｏ．０５ ２ ｇ，Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）１２—１８ ｐｒｉｍｅｒ ０．５ Ｌ，以ＤＥＰＣ水辛 足体积到９ ｇＬ，７０℃水浴１０ ｍｉｎ，置于冰上。加入 ２结果 ５×Ｆｉｒｓｔ—Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ５．８７５ ｇＬ．０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ ２ ｇＬ ２．１ 滋补脾阴方药对大鼠大脑皮质蛋白激酶样内质 和１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ混合物２ ｇＬ，ＲＮａｓｅＯＵＴ ０．５ ， Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ０．１２５ ｇＬ，总体积为２０乩， ４６℃水浴１．５ ｈ，７０℃水浴１５ ｍｉｎ后置于冰上５ ｍｉｎ， 网激酶、真核起始因子２Ｑ一亚单位、葡萄糖调节蛋白 ７８、磷酸化一真核起始因子２Ｑ一亚单位蛋白表达的影 响 ● ２０℃保存备用。引物合成委托Ｔａｋａｒａ公司完成。 实验结果表明，糖尿病组、脾阴虚组、病证组 ＧＲＰ７８（３４８ ｂｐ）包括正义链５’＿ＧＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧＴＧＴＧ ｐ－ＰＥＲＫ、ｐ－ｅＩＦ２ Ｑ蛋白表达较对照组均增强（Ｐ＜Ｏ．０５）， Ｑ蛋白表达较糖尿病组有增加 ＴＣＣ－３’和反义链５’一ＴＴＴＧＧＴＣＡＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧ一３’，１３一 病证组ｐ－ＰＥＲＫ、ｐ－ｅＩＦ２ ａｃｔｉｎ（２４１ ｂｐ）包括正义链５’－ＡＡＣＣＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴ 趋势，治疗组较糖尿病组、病证组减弱（Ｐ＜Ｏ．０５）；糖 ＧＡＡＡＡＧ－３’和反义链５’＿ＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＴＣＡＧ一３’。以 尿病组、病证组ＧＲＰ７８蛋白表达较对照组增强（尸＜ ｅＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，反应体系见表１。蛋白表 ０．０５），治疗组较糖尿病组、病证组减弱（Ｐ＜Ｏ．０５）； 达条带采用Ｂａｎｄｓｃａｎ软件进行分析，将ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡ ｅＩＦ２ Ｑ蛋白水平各组问比较差异无统计学意义（尸＞ 的ＩＯＤ值与所对应样品的 —ａｃｔｉｎ的ＩＯＤ值进行比较， ０．０５）。提示糖尿病组、脾阴虚组、病证组大鼠大脑 分析ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡ表达水平。 表ｌ ＰＣＲ反应体系 皮质发生ＥＲＳ，滋补脾阴方药则减轻了ＥＲＳ。见图ｌ。 ２．２ 滋补脾阴方药对大鼠大脑皮质葡萄糖调节蛋白 ７８基因表达的影响 成份 Ｍｉ１ｌｉＱ Ｈ２０ １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ 体积（ｕＬ） 观察结果显示，糖尿病组、脾阴虚组、病证组 ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡ表达较对照组均增强（Ｐ＜Ｏ．０５），病证组 ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡ水平较糖尿病组有增加趋势，治疗组 ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡ与糖尿病组、病证组比较均有所降低 １０ ｍｍｏ１／Ｌ ｄＮＴＰ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｕｐ（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ） （Ｐ＜Ｏ．０５），提示糖尿病组、脾阴虚组、病证组大鼠的 大脑皮质中发生了ＥＲＳ，滋补脾阴方药减轻了ＥＲＳ。见 图２。 Ｐｒｉｍｅｒ ｌｏｗ（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ） ｅＤＮＡ ～ 苴 注：ＡＤ与组．ｐＧ对比－ＲＰ照较Ｅ７Ｒ８组Ｋ；：比Ｅ．Ｂ较Ｗｅｐ， ｓ－ｅｔＰＩ＜ｒＦｎ２Ｏ Ｂ０．ｌ：ｏ５ｔ；Ｃ电．与ｅ泳Ｉ糖Ｆ结２尿Ⅱ果病： ，▲Ｐ＜Ｏ．０５；与病证组比较。 ＡＰ＜Ｏ．０５（下同） 图１各组大鼠大脑皮质ｐ－ＰＥＲＫ、ｐ－ｅＩＦ２ ｄ、ｅＩＦ２ ａ和ＧＲＰ７８表达 ２０１４年１月第２１卷第１期 中国中医药信息杂志 ・４９・ 对照组糖尿病组脾朗虚组肩证组治疗组 ｔａｃｔ，７８—————＿ ｅ—ｍ薯暑墨墨置嚣墨■■ Ａ ■■Ｉ ０ ７ ０ ６ Ｏ ５ ●Ｉ 吕Ｏ ０ ２ ■■●Ｉ ０ １ ０ 对照组 糖屎病组 脾阴虚组 一●■Ｉ 病证组 治疗组 Ｂ 注：Ａ．ＲＴ—ＰＣＲ电泳结果；Ｂ．平均灰度值（ＩＯＤ） 图２各组大鼠大脑皮质ＧＲＰ７８基因表达 ３讨论 内质网位于细胞核附近的胞质区域，是哺乳动物 细胞重要的Ｃａ 贮存器，也是蛋白质合成与翻译后修 饰、多肽链正确折叠与装配的重要场所。某些情况如 缺氧缺血、高血糖、化学毒物等，使内质网腔Ｃａ 耗竭、 蛋白质糖基化抑制、二硫键错配、蛋白质向高尔基体 转运减少，均可致未折叠或错误折叠蛋白质在内质网 腔中蓄积，使内质网功能改变，发生ＥＲＳ。内质网对于 代谢反应的调节是一个不可或缺的细胞器，对能量的 波动十分敏感，很多营养物质的合成或阻断途径都可 通过未折叠蛋白反应（ＵＰＲ）来调节 。能量状态发生变 化时可引起内质网应激的发生，触发ＵＰＲ信号通路 。 正常状态下，细胞内质网膜上存在着ＲＮＡ依赖的 ＰＥＲＫ、抑制物阻抗性酯酶１（ＩＲＥ１）、活化转录因子 ６（ＡＴＦ６）３种跨膜蛋白。非应激状态下，存在于内质网 中的分子伴侣ＧＲＰ７８与这三者结合形成复合体，发生 ＥＲＳ时，ＧＲＰ７８与它们解离，进一步引起这三者的活化。 ＧＲＰ７８是内质网中主要的分子伴侣，它属于热休克蛋 白ＨＳＰ７０家族，相对分子量为７８ ０００。ＧＲＰ７８具有三磷 酸腺苷酶活性，有２个高度保守的结构域，一个是位于 Ｎ末端的ＡＴＰ酶结构域，另一个是Ｃ末端结合待折叠蛋 白的区域 ，其主要功能是辅助蛋白质折叠。ＰＥＲＫ属 Ｉ型内质网跨膜蛋白，其胞浆侧羧基端的蛋白激酶活 性既可使ｅｌＦ２ ａ磷酸化，又可使其自身发生磷酸化， 是ＰＥＲＫ的主要功能区；而游离于内质网内的氨基端 主要是感受内质网的应激信息。发生应激时，ＰＥＲＫ与 ＧＲＰ７８解离后，发生自身磷酸化，并使得ｅｌＦ２ ａ磷酸化， 而磷酸化的ｅｌＦ２ Ｑ可以干扰４３ Ｓ翻译起始复合物的 形成，影响核糖体６０ Ｓ和４０ Ｓ亚基聚合，阻止新蛋白 质的合成。有研究表明，ＰＥＲＫ与ｅｌＦ２ ａ的磷酸化是发 生ＥＲＳ的标志 。 中医学认为脾主运化，负责将体内的精微物质输 送至全身。蛋白质是人体所必需的营养物质，是中医 学认为的精微物质。脾阴具有阴液共有的滋养濡润功 能，除了濡养自身，对其他脏腑、四肢百骸、形体诸窍 也有濡养作用，是后天阴液之本。此外，脾阴与脾阳相 辅相成，共同完成脾主运化及升清、统摄血液的作用。 脾阴是保证脾正常发挥其生理功能的物质基础。脾阴 不足，脾主运化功能失司，体内的蛋白质等精微物质 不能正常转输，大量的蛋白质积于内质网内，可引发 ＥＲＳ。 滋补脾阴方药是根据清代吴澄《不居集》中资成 汤化裁而成。全方以培补后天、滋补脾阴为立方原则， 兼能补气理气、活血化瘀、化痰开窍、安神益智。该 方由山药、人参、白扁豆、白芍、莲子、丹参、橘红、 远志、茯神、石菖蒲等组成。课题组既往研究发现该 方能明显改善衰老大鼠的学习记忆能力［９－１３］，其含药 血清对于１３淀粉样蛋白损伤神经元及ＥＲＳ损伤神经元 具有保护作用 。 本研究发现，糖尿病组、脾阴虚组以及病证组大 鼠大脑皮质中ｐ－ＰＥＲＫ、ｐ－ｅＩＦ２ ａ蛋白表达较对照组均 增加，糖尿病组、病证组ＧＲＰ７８蛋白表达较对照组增 加，糖尿病组、脾阴虚组以及病证组ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡ水平 较对照组均增加，说明糖尿病组、脾阴虚组以及病证 组大鼠大脑皮质中均发生了ＥＲＳ。虽然ＥＲＳ本身是细 胞做出的自我保护，但是长时间的ＥＲＳ最终将启动凋 亡，导致神经细胞大量死亡。而治疗组与糖尿病组及 病证组比较，ｐ－ＰＥＲＫ、ｐ－ｅＩＦ２ ａ以及ＧＲＰ７８蛋白表达 水平、ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡ水平均下调，说明滋补脾阴方药具 有减轻ＥＲＳ的作用，从而减轻内质网的负担，在源头上 避免长时间高强度的ＥＲＳ可能带来的神经损伤，这也 是滋补脾阴方药改善认知功能的重要作用机制。 此外，与糖尿病组比较，病证组ｐ－ＰＥＲＫ、ｐ－ｅＩＦ２ ａ 蛋白表达有增加趋势，说明病证组较糖尿病组ＥＲＳ程 度更强，提示脾阴虚可能加重了糖尿病大鼠大脑皮质 中的ＥＲＳ程度，这可能是脾阴虚时脾主运化功能失司 导致大量的蛋白未得正常转输，积于内质网内导致 的。而ＧＲＰ７８基因与蛋白水平的不统一，究其原因，可 能是有差异的基因存在内含子，在基因修饰过程中该 区域被剪切掉或由于密码子的简并性，有差异的基因 最终的翻译产物是相同的。虽然我们已经发现脾阴虚 ＤＡＣＤ时发生ＥＲＳ，但是ＥＲＳ是把双刃剑 其在ＤＡＣＤ中 是否还发挥其他作用仍需进一步探讨，滋补脾阴方药 在减轻ＥＲＳ的同时是否还能通过其他机制改善脾阴虚 ＤＡＣＤ还需进一步证实。 （下转第５３页） ２０１４年１月第２１卷第１期 ５讨论 中国中医药信息杂志 ・５３・ 品６＞样品１＞样品３，分别对应的提取工艺为泡沫分 ＮＯ是存在于哺乳动物中常见的信号分子，由 精 离提取法、水提醇沉提取法、乙醇超声提取法、大孔 氨酸、氧分子、还原型辅酶１Ｉ及其他辅助因子在不同 吸附树脂提取法、乙醇加热回流提取法和水饱和正丁 类型一氧化氮合酶（Ｎ０Ｓ）催化下合成。Ｎ０可以产生于 醇超声提取法。提示在这６种不同提取工艺得到的竹 人体内多种细胞，在心血管、免疫、神经等系统中均 节参皂苷粗提物中，运用泡沫分离法提取的竹节参皂 扮演着重要的角色。在炎症反应中，Ｎ０是判断炎症最 苷粗提物不仅毒性小，而且其抗炎效果最好。 基本的指标，主要由诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）催化 参考文献： 合成，信号通路主要包括ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２或者ＮＦ— ［１］敖明章．竹节参皂苷抗炎抗风湿作用及机理研究［Ｄ］．武汉：华中科技 Ｋ Ｂ，研究发现抑制ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２或者ＮＦ—Ｋ Ｂ能 大学，２０１２． 够阻碍ｉＮＯＳ蛋白合成，导致Ｎ０减少，继而发挥抗炎保 ［２］文德鉴，张翠兰，陈国栋，等．竹节参总皂苷镇痛作用的实验研究［Ｊ］． 护效应 。ＬＰＳ是Ｎ０合成的强诱导剂，通过对巨噬细 时珍国医国药，２００８，１９（８）：ｌ９８３—１９８４． 胞内ｉＮＯＳ基因的诱导，而导致Ｎ０的大量合成和分泌。 ［３］张长城，蒋美杰，赵海霞，等．竹节参总皂苷对环磷酰胺致免疫低下小 鼠免疫功能的影响［Ｊ］．中成药，２０１ １，３３（７）：１ １３４—１ １３８． 本实验结果表明，采用不同工艺提取的竹节参皂 ［４］Ｈｅ Ｈａｉｂｏ，Ｘｕ Ｊｉａ，Ｘｕ Ｙｕａｎｑｉｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｃａｒｄｉ０ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ 苷粗提物对细胞活力影响不同，作用于ＲＡＷ２６４．７细胞 ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｐａｎａｘ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ｏｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ 株的毒性依次为：样品４＜样品６＜样品５＜样品２＜ ａｇａｉｎｓｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ—ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ 样品ｌ＜样品３；对应的提取工艺分别是泡沫分离提 ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］． ．１ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｔｈｎ０ｐｈａｒｍａｃｏ１ｏｇｙ，２０１２，１４０：７３—８２． 取法、大孔吸附树脂提取法、水提醇沉提取法、乙醇 ［５］钱丽娜，陈平，李小莉，等．竹节参总皂苷成分的抗疲劳活性［Ｊ］．中国 超声提取法、乙醇加热回流提取法以及水饱和正丁醇 医院药学杂志，２００８，２８（１５）：１２３８ １２４０． 超声提取法，这表明采用泡沫分离工艺提取的总皂苷 ［６］张海滨，张长城，何毓敏，等．竹节参总皂苷不同提取工艺的比较研 究［Ｊ］．现代生物医学进展，２０１３，１３（１８）：３４５７—３４６０． 对细胞毒性最小。研究还发现，不同提取工艺竹节参 ［７］Ｙａｄａｖ Ｕ，Ｒａｍａｎａ Ｋ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ｓ．Ａｌｄｏｓｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ 皂苷粗提物干预ＬＰＳ刺激的ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞后，可 ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｃｏ—Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ， 剂量依赖性抑制其Ｎ０产生，巨噬细胞的形态也趋于正 ２０１１，１９１（１）：３３９ ３４５． 常，样品抑制效果依次为：样品４＞样品５＞样品２＞样 （收稿日期：２０１３—０５一ｌ６，编辑：华强） （上接第４９页） ［８］Ｏｚｃａｎ Ｕ，Ｃａｏ Ｑ，ＹｉＩｍａｚ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ 参考文献： ｌｉｎｋｓ ｏｂｅｓｉｔｙ，ｉｎｓｕｌｉｎ ａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ， ［１］陈文静，黄小波．２型糖尿病认知功能障碍中西医研究进展［ ．中国中 ２００４．３０６（５６９５）：４５７ ４６１． 医药信息杂志，２０１２，１９（７）：１０６—１１Ｏ． ［９］战丽彬，徐枫，董玉宽，等．滋补脾阴方药对老龄大鼠脑线粒体ＡＴＰ酶活 ［２］Ｓｈｉ Ｘ，Ｌｕ ＸＧ，Ｚｈａｎ ＬＢ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉ ｃｉｎｅ 性的影响［Ｊ］．中药药理与临床，２０００，１６（１）：２４—２５． ＺｉＢｕ ＰｉＹｉｎ ｒｅｃｉｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ［１Ｏ］战丽彬，刘莉，宫晓洋，等．脾阴虚痴呆证病结合模型建立及滋补脾阴 ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ：ａ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｊ ｓ［Ｊ］． 方药干预的实验研究［Ｊ］．中华中医药学刊，２００８，２６（１）：９一ｌ２． Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２０１ｌ，５４（７）：１８８８～１８９９． ［１１］战丽彬，姜婉贞，路小光，等．滋补脾阴方药对大鼠树突棘保护作用的 ［３］梁丽娜，胡守玉，战丽彬，等．滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病大鼠海马胰 机制［Ｊ］．北京中医药大学学报，２００７，３０（９）：５９７—５９９． 岛素抵抗影响的实验研究［Ｊ］．中国中西医结合杂志，２０１２，３２（３）：３５６ ［１２］Ｚｈａｎ ＬＢ，Ｓｕｉ Ｈ，Ｌｕ ＸＧ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｚｉｂｕ Ｐｉｙｉｎ ｒｅｃｉｐｅ ｏｎ ３６１． ＳＮＫ—ＳＰＡＲ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇｌ ｕｔａｍａｔｅ［Ｊ Ｊ． ［４］Ｌｅｅ ＡＨ，Ｓｃａｐａ Ｅｌｙ，Ｃｏｈｅｎ ＤＥ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，１４（２）：１１７—１２２． ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉ ｓ ｂｙ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＸＢＰ１［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８， ［１３］曲明阳，战丽彬．滋补脾阴方药对衰老大鼠学习记忆能力的影响及脑 ３２０（５８８２）：１４９２—１４９６． 内机制［Ｊ］．中药药理与临床，２００２，１８（６）：３２—３５． ［５］Ｍｙｅｒｓ ＭＧ Ｊｒ，Ｍｔｉｎｚｂｅｒｇ ｔｔ，Ｌｅｉｎｎｉｎｇｅｒ ＧＭ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｇｅｏｍｅｔｒｙ ｏｆ＇ ［１４］Ｚｈａｎ ＬＢ，Ｎｉｕ ＸＰ，Ｓｕｉ ｔＩ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｃｔ ｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｐｌｅｅｎ ｌｅｐｔｉｎ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ：ｍｏｒｅ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｔｈａｎ ａ ｓｉｍｐｌｅ ＡＲＣ［Ｊ］． ｙｉｎ—ｎｏｕｒｉ ｓｈｉｎｇ ｒｅｃｉｐｅ ｏｎ ａｍｙｌｏｉｄ Ｂ—ｐｅｐｔｉｄｅ—ｊ ｎｄｕｃｅｄ ｄａｍａｇｅ ｏｆ Ｃｅｌ１ Ｍｅｔａｂ，２００９，９（２）：１１７—１２３． ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］． ［６］Ｏｚｃａｎ Ｌ，Ｅｒｇｉｎ ＡＳ，Ｌｕ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｉｎｔｅｇ￣’ａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９，７（３）：２４２ ２４８． ｐｌａｙｓ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ ［１５］战丽彬，钟军华，路小光，等．滋补脾阴方药含药皿清对内质网应激神 Ｍｅｔａｂ，２００９，９（１）：３５—５１． 经元损伤的保护作用及机制研究［ ．中西医结合学报，２００７，５（４）：４４５— ［７］Ｂｕｋａｕ Ｂ，Ｈｏｒｗｉｃｈ ＡＬ．Ｔｈｅ ｔｔＳＰ７０ ａｎｄ ＨＳＰ６０ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｍａｃｈｉｎｅｓ［Ｊ］． ４５０． Ｃｅｌ１，１９９８，９２（３）：３５卜３６６． （收稿日期：２０１３—０５—２７，编辑：华强）
