6毕赤酵母介绍

巴斯德毕赤酵母(P／ch／a pastor／s)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。

酵母作为一种最简单的单细胞真核生物, 兼有原核生物和真核生物的某些优点。毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同, 从而节省了重新购臵设备和进行新技术探索的巨额花费, 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。现将毕赤酵母表达系统优点概括如下:

① 毕赤酵母更接近高等真核细胞, 不含内毒素和其他有害物质, 使用安全; ② 同酿酒酵母一样, 繁殖速度快, 对培养条件要求低, 培养基价廉, 能进行高密度培养, 且能耐受较高的液体静压, 便于工业化生产;

② 该系统的载体能与核基因组进行整合, 因此构建的菌株较稳定, 一般不会

在传代过程中出现丢失现象;

③ 在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内, 又可在分泌信号作用下将蛋白

分泌至胞外;

⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOX1)或磷酸甘油酸脱氢酶( GAP) 基因启动子作为外源基因启动子, 可对外源蛋白的表达进行严格; ⑥作为真核表达系统, 可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰, 即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化, 从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性;

⑦外源蛋白表达量高, 同时自身分泌的背景蛋白少, 表达产物易于纯化; ⑧和酿酒酵母相比, 毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基, 比酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基短得多。毕赤酵母极少出现过渡糖基化, 可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能, 而且糖链中不含具有致敏作用的α21, 32甘露糖, 使其使用更加安全。

★ 独特的毕赤酵母表达技术 原核细胞 真核细胞 低等真核细大肠杆菌 高等哺乳动物细胞 CHO细胞 酿酒酵母、毕赤酵母 细胞因子、蛋白质

细胞因子、蛋白质 单克隆抗体 原核

胰岛素

需要破壁

胰岛素

真核

分泌型，不需破壁

毕赤酵母与其它表达系统相比的优点 特点 表达系统 毕赤酵母 蛋白翻译高密度发诱导物 后加工 有 酵 可 甲醇 细胞外 细胞外IPTG (分泌能力差) 大肠杆菌 在公开的资料中使用）

表达方式 表达量 高 酿酒酵母 有（易过度 不可 糖基化） 无 可 较低 IPTG 细胞内 高 （注意：酿酒酵母是挪和诺德的产品，大肠杆菌是其他公司的产品，应该了解，但是不适合优思灵高标准 质量指标 优思灵 检定规程 中国药典 2010年版 美国药典 34版 欧洲药典 7.1版 A21脱氨胰岛素不得过5.0% 其它相关蛋白的总和不得过6.0% 有关物质 A21脱氨胰岛素A21脱氨胰岛素不不得过2.0% 得过1.5% 其它相关蛋白无相关规定 其它相关蛋白的总的总和不得过和不得过3.0% 6.0% 高分子蛋白 不得过2.5% 不得过3.0% 不得过3.0% 不得过3.0% 名词： 启动子：对遗传转录起发动作用的基因。DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。

（毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的表达；通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株）

翻译后的加工与修饰：……肽链从核蛋白体释放后，经过细胞内各种修饰处理过程，成

为有活性的成熟蛋白质，称为翻译后加工（post-translational processing）包括高级结构的加工修饰、一级结构的加工修饰和靶向运输三个方面。

糖基化：在酶作用下，蛋白质或脂质分子添加糖残基的过程。（蛋白质经过糖基化作用之

后，可形成糖蛋白。）

免疫原性：抗原能诱导机体产生体液免疫或细胞免疫应答的性能。

（毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用）

安全：纯（外源表达、不易糖基化） 有效：生物活性（翻译后加工与修饰？） 经济：易培养、高表达