植物染色体微切割、微收集及微扩增技术应用

实验室研究与探索

V01．29No．7

2010年7月

RESEARCH

AND

EXPLORATIONINLABORATORY

Jul，2010

植物染色体微切割、微收集及微扩增技术应用

高居荣，

崔

法，

封德顺，李兴锋，

王洪刚

(山东农业大学农学院，国家小麦改良中心泰安分中心，作物生物学国家重点实验室，山东泰安271018)

摘

要：为使染色体微切割、微收集、微扩增技术在植物精细遗传图谱及物理图谱构建中有效应用，利用

SLuCUT全自动激光显微切割系统对普通小麦“中国春”和中间燕麦草染色体进行了微切割、微收集和微克隆研究。结果表明，SLuCUT．A全自动激光显微切割系统使植物染色体的微切割、微分离和微收集技术操作简单、快速准确、污染轻、样本不被降解等；DOP—PCR微量扩增条件适于普通小麦和中间燕麦草微量染色体的高效扩增，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以快速、准确地分析判断微扩增产物的

来源。

关键词：染色体；微切割；微收集；微克隆

中图分类号：Q78l

文献标识码：A文章编号：1006—7167(2010)07—001l一03

TechniqueApplicationofPlantC

hromosomeMicrodissection，MicrocellectionandMicrocloning

GAOJu—rong，

CUIFa，

FENGDe—shun，LIXing-feng，，WANGltong—gang

(AgronomyCollegeofShandongAgriculturalUniversity，Shandong

Tai’an

SubcentreofNationalWheat

Improvement

Centre，StateKeyLaboratoryofCropBiology。Tai’an271018，C

hina)●

Abstract：Forhigh-efficientutilizationofchromosomemicrodissection，microcollectionandmicrocloningtechnologyin

theconstructionofplant

high—resolutiongeneticm

apandphysicalmap，chromosomesofbothcommonwheat

Chinese

SpringandElytrigiainterm

ediumwereusedby

SLuCUT-Afullyautomaticlaser

microdissectionsystem．Theresultsindicate

thatSLuCUT

Afully

automated

lasermicrodissection

system

makes

the

technology

of

chromosomemicrodissection，microcollectionandmicrocloningof

easy-operation，quick，precise，low—levelpollution

as

well

as

low—

degreedegradationofsamples．TheconditionofDOP—PCRmicrocloningissuitableforhigh

efficient

cloningofm

icrochromosomesofbothcommonwheat

ChineseSpringandElytrigiaintermedium．PCRproducts

were

analysedin6％non

denaturingpolyacrylamidegels．andthethe

source

of

microcloningproduct

can

berevealedquicklyandprecisely．

Keywords：chromosome；microdissection；microcollec；microcloning

l

引言

染色体区带特异的DNA文库，然后从中分离新的分子标记，是进一步饱和现有遗传图的一条重要途径，也是染色体微切割、微收集与微扩增技术使得部分遗克隆新基因的一条重要途径…，因此，染色体微切割传研究从全基因组水平缩小到某条染色体(染色体片和微扩增技术自诞生以来，一直受到广泛关注。染色段)水平成为可能。利用此项技术建立染色体特异或

体微切割、微克隆技术¨。是一项分子细胞遗传学新技术。植物染色体显微切割技术就是在显微镜下，主要收稿日期：2009—07—25

采用微细玻璃针或激光对特定的染色体或染色体片段基金项目：国家自然科学基金资助项目(30571156)

进行切割、分离，然后利用切割产物为模板进行外扩作者简介：高居荣(1964一)，女，山东宁阳县人，硬士，高级实验师，主要从事生物技术与作物遗传改良研究。

增，从而构建染色体或染色体区段特异性的DNA文Tel．：0538—824682I；E

mail：greeting@sdau．edu．c“

库。因此，研究者可以根

不同的目的和用途选择不

通信作者：王洪刚(1955一)，男，博士生导师，主要从事生物技术与同的染色体文库进行操作，这比针对整个基因组的操作物遗传改良的理论与

法研究。

作要有效得多。自Saudery等¨’利用染色体微切割和

12

实验

室

研究与探索

第29卷

微克隆技术获得了黑麦DNA克隆以来，科学工作者已相继进行了小麦、玉米、水稻等植物的染色体微切割、微克隆技术研究H引。但以往主要采用激光微束法、流式染色体分级分离法和玻璃针法，这3种方法操作复杂、技术难度大、污染较重、被分离的目标染色体难以完全回收等，以致许多研究者难以进行植物染色体遗传分析的深入研究。

。本文利用SLuCUT全自动激光显微切割系统对普通小麦“中国春”和中间偃麦草染色体进行了微切割、微回收及微扩增研究，以期使染色体微切割、微收集、微扩增技术在植物精细遗传图谱及物理图谱构建中有

效利用。

2材料与方法

2．1供试材料

材料：普通小麦“中国春”种子和中间偃麦草种子，国家小麦改良中心泰安分中心保存。

2．2‘实验方法

(1)种子发根。取普通小麦“中国春”种子和中间偃麦草种子在25℃无菌水中浸泡24h，然后把已露白的种子转入4℃冰箱中24h后，再置于25℃暗培

养，待根长至0．5—1．5cm时，截取根尖与冰水中预处理24h(25×10“的放线菌酮20℃处理70m

in)，立即移入70％乙醇中于4℃保存待用。

(2)根尖前低渗。用滴管缓缓滴加无菌双蒸水，并小心冲洗2次根尖，4℃无菌双蒸水中前低渗3次，

每次5min。

(3)根尖酶解。切取根尖2—3mm于酶解液中(4％的纤维素酶OnazukaR一10+0．5％的果胶酶

PectolyaseY

-23．75mmol／LKCI和7．5m

mol／LEDTA缓冲液配制，pH=4．0，抽滤除菌)，37oC

消化105min。

(4)根尖后低渗。用滴管缓缓滴加无菌双蒸水，并小心冲洗2次根尖，4℃无菌双蒸水中后低渗3次，

每次5

mino

(5)根尖染色体压片。将低渗后的根尖于盖玻片上，滴l滴卡宝品红染色约5min后，轻轻捣碎根尖后反转覆盖于载玻片的膜上，轻压即可，立即把压好的片

子放到一20oC(至少2h)，从一20℃保存的制片取

出，立即用人口吹气，用刀片揭开盖片，放人70℃烘箱干燥，使用或一20℃保存备用。

(6)染色体显微切割、收集和保存。将制备好的染色体标本片子放到载物台上，分别在lO、20、40或100倍镜下选择目标染色体后，将黏性的Eppendorf管放在管盖固定架上，管盖固定架吸附在自动管盖提取装置上。载物台的移动，切割路径的任意勾画，切割长度的测量、聚焦、激光能量、切割速度、拍照、保存、收集等都通过简便易用的UVCUT软件来完成。切割后的

染色体用黏性的Eppendorf管盖进行收集，然后加入含20斗L(5ng／弘L)蛋白酶K溶液(1×TaqDNA聚合酶缓冲液配制，用于DOP．PCR微扩增)的0．2mL

Eppendorf管中。放入37℃4

h，500r／min，4

min高速

离心，将含有分离染色体的0．2

mL

Eppendorf管置于

37℃水浴中温浴4h，以便蛋白酶K充分消化去蛋白，

然后75℃，20min使蛋白酶K失活，一20℃存放备用。

(7)基因组DNA的提取。普通小麦“中国春”和中间偃麦草基因组DNA的提取参照Devos等¨1的报

道，略有改动。

(8)简并引物序歹Il。5’一CCGACTCGAGNNNN-

NNATGTGG一3’，引物由上海生物工程研究所合成

(HPLC纯化)。

(9)DOP—PCP微量扩增条件。参照Vega等旧1的报道，略有改动。

第l轮反应：其反应体系是在含上述酶解液的Eppendorf管中+10×Taq酶缓冲液4¨L+MgCl2

(25mmol／L)3“L+2m

mol／LdNTP5IzL+弓I物

(15pmol／L)5IxL+Taq酶(4U／斗L)0．5灿L+无菌水

补至50¨L混匀，于BIO．RAD型扩增仪进行第1轮扩增；反应程序为94℃预变性10rain，然后进入5个循环的94℃l

min，30oC1．5

rain，72oC3rain，其中，

30℃变化至72℃需3rain；接着进行25个循环94℃

1rain，57℃l

min，72℃1．5

rain，每圈自动延伸1

s；

最后72℃延伸10rain，4oC保温。

第2轮PCR反应：反应体系是第l轮‘PCR产物

5斗L+10×Taq酶缓冲液5斗L+MgCl2(25m

mol／L)3斗L+2mmol／LdNTP5斗L+弓I物(15pmol／L)5pL

+Taq酶(4U／gL)0．5IxL+无菌水补至50“L

混匀。于BIO．RAD型扩增仪进行第2轮扩增；反应程序为94℃预变性5rain，然后进入30个循环的94℃

1

rain，55℃1rain，72oC

1．5

rain，最后72℃延伸

10rain，4oC保温。

为避免外源DNA’的污染，上述整个单染色体体外扩增过程均在无菌条件下进行，并设立严格不含染色体DNA的阴性(无菌水)对照和以10pg总DNA为模板的阳性对照。

(10)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、银染、显

影。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、银染、显影参照文献[9]中方法。

(11)实验地点。国家小麦改良中心泰安分中心。

3结果与分析

3．1

染色体的切割和收集

利用SLuCUT—A全自动激光显微切割系统对普通

小麦“中国春”和中间偃麦草根尖细胞中期染色和染色体片段进行切割、分离和收集，染色体切割、分离和

第7期

高居荣，等：植物染色体微切割、微收集及微扩增技术应用

13

(a)切割前

图1

(b)切割后

普通小麦“中国春”根尖细胞染色体照片

(c)切割收集后

收集后分别拍照，其中普通小麦“中国春”的一条染色体切割前、后和收集后的照片如图l所示。

由图l可以看出，图1(a)箭头所示欲切割的目标

染色体，表明目标染色体未被切割；图1(b)箭头所示切割路径，表明目标染色体已经被切割分离；图1(c)箭头所示目标染色体被切割收集后留下的空白处，表明被切割和被分离的目标染色体已经被黏性

Eppendorf管盖收集。由此可见，利用SLuCUT．A全自

动激光显微切割系统切割植物染色体时，研究者能够清楚地判断所切割的目标染色体是否被切割、分离和收集，减少了盲目性，提高了切割和收集目标染色体的效率。

3．2

染色体DNA的DOP-PCR微量扩增及微扩增产

物的初步检测

分别以收集的普通小麦“中国春”单个细胞、单条染色体、染色体片段和中间偃麦草单条染色体及普通小麦“中国春”基因组DNA、中间偃麦草基因组DNA和无菌水为模板，首先进行第l轮DOP-PCR微扩增，再利用第1轮DOP．PCR扩增产物为模板，进行第2轮DOP-PCR微扩增。利用第2轮微扩增产物进行琼脂糖电泳，其电泳图谱见图2。

图2普通小麦“中国春”染色体第2轮DOP—PCR

微扩增产物电泳图谱

1一DNAMarker

DL2

000，2、3—1条染色体，4—2条染色体，

5一染色体片段，6—1个会细胞条染色体，7一阳性对照(普通小麦“中国春”基因组DNA)，8一阴性对照(无菌水)

由图2可见，在2～6泳道(普通小麦“中国春”微切割染色体)和第7泳道均获得较强的弥散扩增信

号，其扩增产物长度均大于100bp，而泳道8中未观察

到此扩增信号。由此表明，在2—6泳道中所观察到的扩增信号(DNA产物)很可能是源自普通小麦“中国春”基因组DNA；微切割、分离和收集的中间偃麦草染色体DNA经以上实验也得出相同的结论，表明微切

割、分离和收集的中间偃麦草DNA产物很可能是源自中间偃麦草基因组DNA。从扩增信号的强度可以看出，DOP-PCR微量条件不仅适于普通小麦“中国春”和中间偃麦草微量DNA扩增，而且扩增效率较高。．3微切割染色体扩增产物的验证

普通小麦“中国春”单个细胞、单条染色体、染色体片段和中间偃麦草单条染色体及普通小麦“中国春”基因组DNA、中间偃麦草基因组DNA和无菌水进行2轮DOP—PCR微扩增，利用第2轮微扩增产物进行％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、银染、显影和拍照，其电泳图谱见图3。

图3普通小麦“中国春”和中间燕麦草第2轮DOP

PDR

微扩增产物聚丙烯酰凝胶电泳图谱

1、13一DNAMarkerDL2

000，4一染色体片段，8一i条染色体，

3、9—2条染色体，6—3条染色体．2、10—1个会细胞条染色体，5一中间偃麦草1条染色体，7一中间偃麦草基因组DNA，11一阳性对照(普通小麦。中国春”基因组DNA)，12一阴性对照(无菌水)

由图3可见，5泳道和7泳道中都产生了l条相

对分子质量相同且清晰可辩的DNA谱带(箭头所示)，此条谱带的相对分子质量>100

bp，<250bp，而

在阴性对照12泳道中却未观察到此谱带。由此表明，所切割的这条中间偃麦草染色体与中间偃麦草基因组

DNA有同源性；在2、3、4、6、8、9、10泳道(微切割普通

小麦“中国春”染色体DNA)和阳性对照11泳道中，均

分别产生了2条相对分子质量相同且清晰呵辨的DNA谱带(箭头所示)，其中l条DNA谱带的相对分子质量>250

bp，<500

bp，另1条DNA谱带的相对分

子质量>100bp，<250bp，且小于中间偃麦草所产生

的那条DNA谱带的相对分子质量，而在阴性对照12泳道中却未观察到这2条DNA谱带。由此说明，所切DNA与普通DNA有同源性。由以上分析表明，所切割和收集的普通小麦“中国春”染色体的DNA和中间偃麦草染色体的DNA分别源自普通小麦“中国春”基因组DNA和中间偃麦草基因组DNA。

(下转第26页)

36割和收集的普通小麦“中国春”的染色体小麦“中困春”基因组实

表2

验室研究与探索

第29卷

2种虞合板在缝合与不缝z方向弹性模量

‘好，为缝合层合板刚度计算提供了一种有效的方法。参考文献(References)：

[1]

杜善义．先进复合材料与航空航天[J]．复合材料学报，2007，24

(1)：I-17．

4

结语

参考文献(References)：

=I

以往所采用的激光微束法、流式染色体分级分离法和玻璃针法，技术难度大，被分离的目标染色体难以完全回收，严重影响了基因的分离、定位及物理图谱构建等研究的精确度。而SLuCUT—A全自动激光显微切割系统通过鼠标勾画各种图形来选择切割目标，冷激光不与分离样本直接接触，并且通过有黏性的收集管盖黏附分离下来的膜和样本，提取过程不需要激光的轰击。整个操作过程，从SLuCUT—A全自动激光显微切割系统载物台的移动、切割路径的任意勾画、切割长度的测量、聚焦、激光能量、切割速度，到拍照、保存、收集等都是通过简便易用的UVCUT软件来完成，因此SLuCUT．A全自动激光显微切割系统实现了染色体微切割、微收集的高效自动化。从DOP—PCR微量扩增产物的量来看，DOP．PCR微量扩增技术可以使普通小麦和中间偃麦草微量DNA高效扩增，并且DOP-PCR微量扩增产物经6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可获得清晰可辨的DNA谱带，根

谱带相对分子质量的大小

就比较清楚地分析判断微切割和微收集染色体的来源，这比利用Southern杂交验证微切割和微收集染色

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