双酚f和双酚s联合暴露下的斑马鱼富集及神经毒性

双酚F和双酚S联合暴露下的斑马鱼富集及神经毒性

王倩倩1,王永花1*,汪贝贝1,刘晓丹1,吴 兵2,陆光华1 (1.河海大学环境学院,江苏 南京 210098；2.南京大学环境学

院,江苏 南京 210023)

摘要：为探究双酚F(BPF)和双酚S(BPS)联合暴露下斑马鱼富集及神经毒性,进行为期14d的1,10,100,1000 μg/L BPF和BPS的单一或联合暴露.结果表明,BPF和BPS在斑马鱼组织内的富集水平与暴露浓度和暴露时间呈正相关,BPF富集能力高于BPS,BPF和BPS联合暴露降低了斑马鱼对BPS的富集水平,但对BPF富集水平的影响较小.脑组织中的富集水平低于肠道但远高于肌肉.以脑为目标组织进行了毒性研究,结果表明,BPF诱导的丙二醛(MDA)、8-羟化脱氧鸟苷(8-OHdG)、白细胞介素1β(1L-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等氧化损伤和炎症指标水平高于BPS,且联合暴露存在毒性增强效应.但BPS对皮质醇(COR)、肾上腺素(EPI)和乙酰胆碱酶(AChE)等神经毒性标志物和Syn2a、MBP、Gfap、MAP2、NSE2和S-100B等神经功能有关基因的毒性效应影响高于BPF,联合暴露削减了对AChE、COR和EPI等的影响. 关键词：双酚F；双酚S；神经毒性；斑马鱼；联合暴露

中图分类号：X174 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2020)02-0865-09

Accumulation and neurotoxicity of bisphenol F and bisphenol S in zebrafish under combined exposure. WANG Qian-qian1, WANG Yong-hua1*, WANG Bei-bei1, LIU Xiao-dan1, WU Bing2, LU Guang-hua1 (1.College of Environment, Hohai University, Nanjing 210098, China；2.School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China). China Environmental Science, 2020,40(2)：865~873

Abstract：In orderto investigate the enrichment of bisphenol F (BPF) and bisphenol S (BPS) in zebrafish and their combined neurotoxicity, single and combined exposure of 1, 10, 100, 1000μg/L BPF and BPS was conducted for 14days. The enrichment level of BPF and BPS in zebrafish tissues was positively correlated with the exposure concentration and time, and the enrichment capacity of BPF was higher than that of BPS. Combined exposure of BPF and BPS reduced the enrichment level of BPS in zebrafish, but had little effects on the enrichment of BPF. Toxicity studies on brain tissues showed that BPF induced levels of oxidative damage and inflammation indicators such as malondialdehyde (MDA), 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG), interleukin-1β(1L-1β) and tumor necrosis factor α (TNF-α), were higher than those of BPS. Moreover, combined exposure was found to have toxicity enhancement effects. However, the toxic effects of BPS on neurotoxic markers, such as cortisol (COR), epinephrine (EPI) and acetylcholinesterase (AChE), and genes related to neurological functions, such as Syn2a, MBP, Gfap, MAP2, NSE2 and S-100B, were higher than those of BPF. And, combined exposure reduced the effects on AChE, COR and EPI. Key words：BPF；BPS；neurotoxicity；zebrafish；combined exposure

双酚A(BPA)是世界上产量和消费量最高的化学物质之一,但因其健康危害[12],而被多个国家

-

体暴露进入生物体.斑马鱼和大型蚤的急性毒性分级标准表明,BPF属于中等毒性,而BPS的毒性略低,两种化合物暴露都会诱导生殖毒性、细胞毒性、遗传毒性和内分泌干扰等毒性效应[7].流行病学研究表明,环境中的双酚类物质与精神症和自闭症的发病有相关关系[8].动物实验发现BPF和BPS对幼年老鼠的大脑造成潜在的不利影响[9],BPS可对小鼠的摄食行为及斑马鱼后代的早期发育产生影响[1011].但BPS和BPF单独及联合暴露下的神经毒

-使用,并积极推广BPA替代品.与BPA结构和理化性质相似的BPA类似物(BPs)受到越来越多的关注[3],其中双酚F(BPF)和双酚S(BPS)因化学性质稳定、耐热、耐高温、生产工艺简单等优势,其产量和消费量呈逐年上升趋势[4],导致了它们在自然水体、沉积物、污水厂进出水、污泥、室内灰尘中被广泛检出,且与BPA浓度在同一数量级[5].对各地区水体及沉积物的风险值比较,结果表明,BPF产生的风险值高于BPS,某些地区BPF产生的风险值甚至高于BPA.

环境中的BPF和BPS可通过接触、饮食及水

[6]

收稿日期：2019-07-16

基金项目：污染控制与资源化研究国家重点实验室开放基金资助项目(PCRRF17028);高校基本科研业务费(2018B57214) * 责任作者, 副教授, mgflora@hhu.edu.cn

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性效应研究较少.

本研究以成年斑马鱼为研究对象,研究了BPS和BPF单独及联合暴露下斑马鱼脑、肠道和肌肉组织的富集能力,分析了暴露后斑马鱼脑组织的氧化损伤、炎症因子、与神经毒性有关生物标志物的变化,检测了脑组织中与神经有关基因的表达水平,评估BPF和BPS单一或联合暴露下的神经毒性效应,为2类BPs的环境健康风险评估提供参考. 1 材料和方法 1.1 实验材料

主要仪器:全自动样品研磨仪(上海净信科技),数显气浴恒温振荡器(常州普天仪器),H4多功能酶标仪(美国Biotek公司),Waters ACQUITY超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(美国Waters公司),分析天平(赛多利斯科学仪器公司),数控超声波清洗器(昆山市超声仪器),离心机(上海安亭科学仪器).

主要试剂:BPF(CAS为620-92-8,纯度为99.5%)和BPS(CAS为80-09-1,纯度为99.5%)购自上海百灵威科技有限公司,乙腈(HPLC级,德国默克公司)、二甲基亚砜(DMSO,纯度为99.5%)、磷酸盐缓冲液(PBS)购自南京荣华科学器材有限公司.考马斯亮蓝蛋白、脂质过氧化丙二醛(MDA)、8-羟化脱氧鸟苷(8-OHdG)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、皮质醇(COR)、肾上腺素(EPI)和乙酰胆碱酶(AChE)测定试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司).BPF、BPS不易溶于水,用DMSO助溶,助溶剂浓度为0.01%.

受试动物:实验用鱼为AB型五月龄斑马鱼,购自南京夫子庙花鸟鱼市场,体长(20 ± 5) mm,平均体重0.3g,无明显疾病和肉眼可见的畸形.实验室条件下驯化2周,养殖用水为预曝气24h的脱氯自来水,pH值为(7.8 ± 0.2),水温 (28 ± 0.5)℃,光照:黑暗周期=14h:10h,早晚各喂食一次新孵化的丰年虾,用全换式染毒法每隔24h用预曝气的脱氯自来水配制相同浓度的染毒液,转移鱼进新更换的染毒液,同时检测每次更换前后染毒液浓度. 1.2 实验方法

1.2.1 染毒方法 选择健康成年斑马鱼进行暴露实验,每组40只,雌雄各半.根据预实验结果和前期的文献调研,将BPS和BPF的单独暴露及两种污染

物(1+1)联合暴露浓度设置为1,10,100,1000μg/L,同时设置0.01%的DMSO为对照组,染毒时间为14d.斑马鱼饲养遵守中国国家食品药品监督管理总局实验室动物饲养和使用指导方针.在各浓度染毒组中,除了1000 μg/L BPF和BPS的联合染毒组中斑马鱼在染毒14d时上下游动出现分群现象,活力有所减弱,其他各处理组斑马鱼在暴露液底部聚集游动,无明显异常现象.在染毒的第1,7,14d,分别取20条斑马鱼,用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS222)麻醉后,迅速分离肠道、脑、肌肉组织,将获取的组织样品置于液氮中速冻后于-80℃冰箱保存待测.

1.2.2 BPF、BPS浓度测定 染毒液前处理方法:更换暴露液前后各取1L暴露水样,过滤去除颗粒物后以5mL/min的流速过HLB固相萃取柱.用10mL 4.5%氨水:乙腈溶液洗脱提取物,氮吹至近干并用1mL甲醇定容后用于超高效液相色谱-串联质谱分析.

斑马鱼组织前处理方法:分别称取0.1g冻干的肠道、脑和肌肉组织样品,用6mL乙腈匀浆120s后置于20℃气浴恒温振荡器中混合30min.超声萃取30min后以6000r/min离心10min,重复此过程2次,合并提取液置于-80℃冰箱冷冻除脂48h.氮吹至近干用1mL的乙腈定容后用于超高效液相色谱-串联质谱分析.

色谱检测条件:ACQUTY BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm, 1.7μm,美国Waters公司);柱温:40℃;流速:0.3mL/min;进样量:10μL;流动相A:体积比为0.01%的氨水溶液,流动相B:乙腈;运用梯度洗脱对目标物洗脱,具体流动相梯度:0~0.25min流动相A: 90%,B: 10%; 3~4min A:10%, B: 90%; 4.01~ 5min A: 90%, B: 10%.

质谱检测条件:负离子模式;离子源温度:150℃;毛细管电压:3.0kV;锥孔反吹气流量:50L/h;碰撞气流速:0.16L/min;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂流量700L/h.BPF和BPS的保留时间都是0.6min;驻留时间分别为0.042,0.161s;锥孔电压分别为30,42V; BPF和BPS用于定量分析的母离子反应m/z分别为199.10和249.13,BPF的子离子m/z为93.10和105.10,BPS的子离子m/z是92.05和108.07.

上述检测方法对斑马鱼组织中BPF的检出限为0.2ng/g,回收率83.5%~86.8%,RSD 3.4%~12.3%, BPS的检出限为0.2ng/g,回收率80.4%~110.7%,

2期 王倩倩等：双酚F和双酚S联合暴露下的斑马鱼富集及神经毒性 867

RSD1.7%~11.9%.

1.2.3 氧化损伤、炎症及神经毒性指标检测 取染毒14d后的50mg脑组织样品,按1:9(m:V)加预冷的PBS缓冲液(pH=7.2~7.4,浓度0.01mol/L)匀浆,以3500r/min离心20min,取上清液待测.测定脑组织中的AChE活性以及MDA、8-OHdG、1L-1β、TNF-α、COR和EPI含量,测定步骤按ELISA试剂盒所述方法分别用酶标仪测定对应反应后波长分别为412nm(AChE)、532nm(MDA)、450nm(8- OHdG、1L-1β、TNF-α、COR、EPI)的吸光度.获得的检测结果通过蛋白质含量进行标准化处理.蛋白含量采用Bradford法检测.

1.2.4 荧光定量PCR 染毒14d后取一定量斑马鱼脑组织,采用RNA提取试剂盒提取总RNA (QIAGEN, Germany),通过NanoDrop 2000分光光度计和2%琼脂糖-凝胶电泳检测RNA的质量和纯度.采用Takara PrimeScript RT试剂盒合成cDNA. ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (2X)(南京诺唯赞生物科技有限公司)构建定量PCR反应体系,待测基因的引物如表1所示.利用ABI 7500系统进行定量PCR分析,以β-actin作为内参基因.定量PCR扩增条件如下:95℃预变性5min;95℃,5s;55℃,30s; 72℃,40s,循环40次.mRNA的相对表达量由2-

ΔΔCt

方法计算,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)空白.

表1 qRT-PCR引物序列

Table 1 Primer sequences used in the quantitative real-time

PCR

基因名称 正反向引物序列(5’-3’) β-actin F:AGGTCATCACCATTGGCAAT R:GATGTCGACGTCACACTTCAT Gfap F:GGATGCAGCCAATCGTAAT R:TTCCAGGTCACAGGTCAG Syn2a F:GTCACCATGCCAGCATTTC R:TGGTTCTCCACTTTCACCTT S-100B F:ACTGCCTGGGAACCATCATTGAAGT R:GAGTCGCCATCGGTGTCCAAACT NSE2 F:CTTCACTGAGCTGATCGCTGGAGTT R:TTCAAGCACCGCCTCTTGGTCATAG MBP F:TGGATTGAGCGGAGAAGGACATACG R:CGACTTAGGACGAGGAGAGGACACA

MAP2

F:TTCTCTGTCGTCCTCCGTGC R:GCCGACCGTCTGCCATCTAA

1.2.5 数据统计和分析 测定数据用平均值±标准

偏差(Mean ± SD)表示,采用SPSS 22.0进行数理统计分析,组别差异性通过方差分析(ANOVA)和Turkey事后检验方法分析,两组比较数据之间的显著差异性量度为P<0.05.数据可视化由Origin Pro 9.0软件实现. 2 结果与讨论

2.1 斑马鱼组织中BPF和BPS的积累

每天更换暴露液前后测定1,10,100,1000μg/L暴露组中目标污染物浓度分别为(1.1±0.7), (9.3± 2.3),(93.5±5.2),(1030±56.4)μg/L,表明暴露期间目标污染物浓度保持基本稳定.14d暴露结束后,BPF和BPS在斑马鱼各组织(肠道、脑、肌肉)中浓度如图1所示,总体水平介于ng/g~μg/g之间.

BPS和BPF单独暴露时,斑马鱼在肠道、肌肉和脑组织中都存在生物富集效应.富集水平呈现浓度依赖性,如图1(a)和(b).对于相同暴露浓度,随着暴露时间的增加,BPS富集水平呈现增加的趋势.但对于BPF暴露,在第7d达到最高后逐渐降低,说明7d左右已经达到最高值,这与2,6-二甲基萘在鲫鱼各组织中富集规律相似,一种可能的原因是体内污染物促使解毒酶系统被诱导激活[12].

对比3种斑马鱼组织,肠道的富集水平最高,其次是脑和肌肉.不同组织对有机污染物的亲和力不同,肠道对这两种BPS的亲和力大,因而不断被摄取并迅速积累,肠道通过内源分配作用获得更多的目标化合物[13];另一种可能是由于肝肠循环机制,肝脏中目标污染物可随胆汁分泌进入小肠,延长了与肠道粘膜的接触时间[14].对于脑,有研究发现新安江、滇池野生鱼酚类内分泌干扰物在脑中的生物富集系数高于肌肉[15-

16],表明脑是除肠道外另外一个重

要的内分泌干扰物富集器官.

当BPS和BPF联合暴露于斑马鱼时,富集水平与暴露浓度和暴露时间呈一定的正相关,3种组织的富集水平顺序为肠道>脑>肌肉.与单一暴露相比, BPS富集水平在联合暴露时小于单一暴露,如图1(a)和(c);BPF富集水平则小于或相当于单一暴露水平,如图1(b)和(d).上述结果表明,联合暴露对BPS富集水平的影响高于BPF.不论单一暴露还是联合暴露,BPF在斑马鱼体内的富集能力高于BPS,这可能与其本身的疏水性有关,BPF的辛醇水分配

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系数(log Kow)高于BPS,BPF的疏水性更强,更容易在生物体内积累.王强等[17]研究表明疏水性是双酚类物质积累的主要驱动力,且生物累计因子(log BAF)与log Kow呈显著正相关,佐证了本研究

1400 1200 BPS浓度(ng/g) 1000 800 600 400 200 0

d d bc dcd d c cd d bbcc c c c ab bc c b b ab b a aaa a a a a a1d 7d 14d 1d 7d 14d 1d 7d 14d 1d7d14d1µg/L 10µg/L 100µg/L 1000µg/L肌肉 脑 肠道 (a) BPS单独暴露 结果. 此外,BPF富集浓度在联合暴露下随时间持续增加,并未出现暴露第7d达到富集最高值的现象,这可能是BPS共存干扰了BPF的体内解毒清除代谢过程.

肌肉脑 肠道 (b) BPF单独暴露 ede 1000800BPF浓度(ng/g) ee6004002000

ede e d bc c cdc cb b d a ab b edc c a bcdcddecababbaa1d7d14d1d7d14d 1d 7d 14d 1d 7d 14d

160014001200

1µg/L肌肉脑肠道10µg/L 100µg/L 1000µg/Le 1400 1200 BPS浓度(ng/g) 1000 800 600 400 200 0

肌肉 脑 肠道 (c) BPS和BPF联合暴露 (d) BPS和BPF联合暴露 edf e cce bcdee d d d b bc cd c c d c abb b a b b aa ba a a 1d 7d 14d 1d 7d 14d 1d 7d 14d 1d组别

ef BPF浓度(ng/g) e10008006004002000

cd c e a a a b b bc cdbcbccceabb a bccbdad d bc a dedc cb 7d14d1µg/L 10µg/L 100µg/L 1000µg/L1d7d14d1d7d14d 1d 7d 14d 1d 7d14d1µg/L10µg/L 100µg/L 1000µg/L

组别

图1 不同暴露条件下BPS和BPF在斑马鱼各组织中的积累

Fig.1 Accumulation of BPS and BPF in zebrafish tissues under different exposure conditions

不同字母表示相互之间存在显著性差异(P<0.05)

2.2 斑马鱼脑组织氧化损伤

MDA和8-OHdG是氧化损伤的重要生物指示物.BPF和BPS单一或联合暴露显著增加了斑马鱼脑组织中MDA的含量,且呈现显著的剂量-效应关系(图2a).BPF暴露组的MDA含量略高于BPS暴露组,但只在100 μg/L组具有显著性差异.BPF和BPS联合组虽然诱导了MDA含量的增高,但与BPF单一暴露组比无显著性差异.斑马鱼脑组织中8-OHdG含量也存在显著的剂量-效应关系(图2b).BPF暴露组的8-OHdG含量显著高于BPS暴露组(P<0.05),且BPF和BPS联合暴露诱导的8-OHdG含量显著高于单独暴露组(P<0.05).

MDA是脂质过氧化的最终分解产物,可对细胞

膜产生影响.8-OHdG是DNA氧化损伤的敏感性指标.文献报道虽显示BPS暴露可提高大鼠睾丸ROS水平,诱导脂质过氧化[18];BPS和BPF暴露可诱导干细胞DNA损伤[19],但BPF和BPS单一及联合暴露下对脑组织氧化损伤的影响仍不够明确.本研究发现的MDA和8-OHdG含量升高表明BPS和/或BPF进入斑马鱼脑组织后可能诱导了大量的氧化自由基产生,增加了氧化损伤产生,且存在联合暴露的毒性增强效应.

2.3 斑马鱼脑组织炎症效应

1L-1β和TNF-α是反映全身炎症状态的重要细胞因子.BPS单一暴露只在高浓度(1000μg/L)时诱导了1L-1β的显著增加(P<0.05),BPF单一暴露在所有

2期 王倩倩等：双酚F和双酚S联合暴露下的斑马鱼富集及神经毒性 869

暴露组都诱导了1L-1β的显著增加(图2c).当BPS和BPF联合暴露时,在1~10μg/L浓度是存在毒性削减效应,但在更高浓度时存在毒性增强效应(P<0.05).对于TNF-α(图2d),BPS在高浓度组(100~1000μg/L)诱导了其显著增加,BPF诱导的TNF-α增加略高于或类似于BPS,BPS和BPF的联合暴露时诱导了高于两者单独暴露时诱导的TNF-α含量.上述研究结果表明,BPS和BPF在高浓度联合暴露时存在潜在的炎症增强效应.

1L-1β和TNF-α 在机体炎症和免疫响应中起着重要作用.文献报道显示100μg/L的BPA能显著

7 MDA含量[nmol/(g pro)] 6 5 4 3 2 1 0

BPF (a) MDA BPS BPF+BPSc c cbc b b a a a de提高斑马鱼体内活性氧并破坏免疫系统[20],Jin等[21]发现壬基酚(NP)能改变斑马鱼胚胎中TNF-α和IL-1β的mRNA表达.本研究的结果表明BPF和BPS对斑马鱼脑组织也存在炎症响应,且两者在高浓度联合暴露时的炎症损伤尤其需要被关注.

BPF和BPS单一及联合暴露下诱导的炎症趋势与氧化损伤效应趋势具有一致性,并与BPF和BPS在斑马鱼脑中的富集能力呈正相关.这一结果也解释了联合暴露下氧化损伤及炎症效应高于单一暴露结果,即当BPF和BPS联合暴露时,两者的总浓度提高,导致氧化损伤及炎症效应高于单一暴露.

508-OHdG含量[ng/(g pro)] 403020100

aaabaBPF BPSBPF+BPS c (b) 8-OHdG cbd d c b d c ed d c d控制 1 10 100 1000暴露浓度(µg/L)

控制110 100 1000

暴露浓度(µg/L)

4035TNF-a含量[ng/(g pro)] 302520151050

aaaaa

dc c c 35 30 1L-1ß含量[ng/(g pro)] 25 20 15 10 5 0

a BPF BPS BPF+BPSc a a ab b (c) 1L-1ß eed d dd c b bc BPF BPSBPF+BPS b (d) TNF-a ba bc bc b 控制

1 10 100 1000暴露浓度(µg/L)

控制110 100 1000暴露浓度(µg/L)

图2 不同暴露条件下斑马鱼脑组织氧化损伤及炎症反应

Fig.2 Oxidative damage and inflammatory response of zebrafish brain tissue under different exposure conditions

不同字母表示相互之间存在显著性差异(P < 0.05)

2.4 斑马鱼脑组织神经毒性效应

乙酰胆碱酶(AChE)活性是神经毒性的重要标志物.乙酰胆碱水平的降低可能会干扰神经信号,导致肌肉收缩和游泳行为异常.BPS和BPF单独暴露诱导了AChE活性的降低,随暴露浓度的升高存在先降低后升高的U型效应模式(图3a).研究结果表明BPS和BPF可以产生和BPA等内分泌干扰物类

似的AChE抑制作用[2223],这与BPS和BPF对大型

-

溞神经毒性影响的结果一致[24].不同暴露组间比较发现,BPF处理组AChE活性要高于BPS处理组. 这一结果与BPF富集能力高于BPS的结果相反.大部分暴露浓度下,BPS和BPF联合组AChE活性高于单独暴露组,表明联合暴露对AChE活性具有潜在的拮抗作用.

870

中 国 环 境 科 学 40卷

16 BPF (a) AChE活性14 BPS ]e e e BPF+BPSe )od dr12 p cd gc cc cmb (10 /U[a b性8 a 活E6 hCA4 2 0

控制 1 10 100 1000

暴露浓度(µg/L)

60 BPF BPS (b) COR含量50 BPF+BPS d ])orp 40 cc c cg(b b ab ccd/gm[量30 a a a a a 含RO20 C10 0

控制 1 10 100 1000

暴露浓度(µg/L)

45 40 BPF BPS (C) EPI含量 BPF+BPS d ]35 d d )oc cd rp30 c bcc cbc g(/g25 b b b bn[量a 含20 IP15 E10 5 0

控制 1 10 100 1000

暴露浓度(µg/L)

图3 BPS和BPF单一及联合暴露下神经毒性效应 Fig.3 Single and combined exposure of BPS and BPF to

neurotoxic effects

不同字母表示相互之间存在显著性差异(P<0.05)

中枢神经系统和大脑皮层是对应激反应起调节作用的主要部位,通过调节下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)、下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)等途径实现对机体的调节.已有研究发现BPS暴露能够影响HPG轴的反馈调节回路,影响后代的发育[25],但是对HPA轴的影响还未见报道,COR和EPI是HPA轴的重要激素,可以调节生物的代谢、认知功能等.本研

究发现,BPS和BPF单一或联合暴露在大部分处理组诱导了斑马鱼脑组织中COR含量的增加,且BPS诱导的COR含量增加存在剂量-效应关系(图3b).在10μg/L联合暴露时,COR含量显著高于其他暴露组,但这种增加在其他联合暴露组未发现.

长期高水平COR会影响HPA轴,出现剂量依赖性,使垂体、肾上腺等器官重量减轻.BPF和BPS单一暴露诱导了斑马鱼脑中EPI含量减少,且存在U

型效应模式.BPS在低浓度(1,10μg/L)时抑制效应高于BPF.两者的联合暴露降低了对EPI的抑制效应,表现出潜在的拮抗作用.COR诱导和EPI抑制效应可能是由于组织分泌的皮质醇增多反馈抑制下丘脑-垂体轴,使肾上腺皮质萎缩功能减退.由于BPS、BPF和BPA结构和性质的相似性,推测BPS可能与BPA的神经介导方式相似,通过雌激素受体(ER),甲状腺激素受体(THR)和芳香化酶通路(AROM)破坏免疫功能而对HPA轴造成影响,进而影响中枢神经系统的正常功能[26].

2.5 斑马鱼脑组织神经系统功能基因表达变化

为进一步解析BPF和BPS神经毒性的生物学机制,本研究分析了两者单独和联合暴露下斑马鱼脑部神经元、突触形成、神经胶质细胞和神经递质

相关功能基因的表达变化,为神经毒性效应提供分子生物学机制.

Syn2a是一种神经元磷酸蛋白,可促进神经递质释放,参与突触形成.BPF和BPS单独暴露抑制了斑马鱼脑中Syn2a基因的表达,且BPS具有更高的抑制作用(图4a),2种BPs联合暴露时Syn2a基因的表

达被进一步抑制.

MBP蛋白对中枢神经系统中髓鞘的形成有很大作用,大量脱髓鞘的产生,对神经元造成二次损伤[27].BPS和BPF单独暴露显著抑制了MBP基因

的表达,但未见明显的剂量效应关系(图4b).BPS单一暴露和联合暴露组的抑制效应强于BPF单一暴露组.

Gfap是星形胶质细胞的标记物[28],参与了多种重要的中枢神经系统过程.BPF和BPS单一暴露在部分浓度组诱导了斑马鱼脑中Gfap的表达量,但联合暴露组抑制了其表达(图4c).

S-100B蛋白在脑组织中丰富的含量可促进神经生长和损伤修复,但含量过高会诱导神经元和神

2期 王倩倩等：双酚F和双酚S联合暴露下的斑马鱼富集及神经毒性 871

经胶质细胞凋亡.BPS和BPF的单一暴露诱导了S-100B的表达,但联合暴露抑制了其表达(图4d).

NSE2是存在于成熟神经元的酶,是中枢神经受损的定量指标[29].BPS和BPF单一及联合暴露都显著上调了NSE2基因的表达,且BPF组>BPS组>BPF+BPS组.高表达的NSE2从神经元细胞中进入细胞间隙和脑脊液,进而诱发中枢神经受损.

1.4 Syn2a mRNA相对表达量 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

控制

1.8 1.6 Gfap mRNA相对表达量 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

控制 3.0 NSE2 mRNA相对表达量 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

控制 a a a b bb1 10 100 1000

暴露浓度(µg/L) BPF BPS BPF+BPS (e) NSE2 d c c bcb ab bcbeMAP2 mRNA相对表达量 ac c c bc ab a bd cd1 10 100 1000暴露浓度(µg/L) (c) GfapBPF BPS dBPF+BPS d c baba a c c c BPF BPS BPF+BPS c cc bc bc baabaaMAP2是一种特异性表达于分化的神经元细胞中的细胞骨架相关蛋白,被用作神经元敏感和特异性的神经标志物.BPS和BPF单一及联合暴露都显著抑制了MAP2基因表达,联合暴露组的抑制效应最高.MAP2蛋白的减少会造成微管变形堆积,破坏细胞骨架完整性,使其代谢出现紊乱而致神经系统损害.

1.4MBP mRNA相对表达量 BPFBPSBPF+BPS (b) MBP (a) Syn2a1.21.00.80.60.40.20

eeed cccb aa bc b d cab 控制110 100 1000 暴露浓度(µg/L)

1.6S-100B mRNA相对表达量 1.41.21.00.80.60.40.20

控制

1

cccbbc

d cd aba BPF BPSBPF+BPS b (d) S-100B d d cdcd b 10 100 1000暴露浓度(µg/L)

1.61.41.21.00.80.60.40.20

eeeBPFBPSBPF+BPSd

(F) MAP2 cdccd cd c b ab ab ab a 1 10 100 1000暴露浓度(µg/L)

控制110 100 1000暴露浓度(µg/L)

图4 BPS和BPF单一暴露和联合暴露下斑马鱼脑中功能基因表达变化

Fig.4 Changes of functional gene expression in zebrafish brain after BPS and BPF single exposure and combined exposure

不同字母表示相互之间存在显著性差异(P<0.05)

上述基因表达的研究结果表明,BPF和BPS的暴露影响了神经元的分化和连接相关功能基因的

表达,从而诱导了斑马鱼神经递质水平的紊乱,影响突触可塑性,干扰神经递质的储存和释放,使大脑神

872 中 国 环 境 科 学 40卷

经受损. Takashi等[30]发现BPA可调节微管相关蛋白的活性,改变大鼠神经系统的发育.本研究结果表明BPS和BPF可能存在于BPA类似的神经毒性效应.此外,BPF和BPS联合暴露下基因表达水平的变化也为AChE、COR和EPI等含量的拮抗效应提供了分子生物学机制支撑. 3 结论

3.1 BPF和BPS在斑马鱼组织内的富集水平与暴露浓度和暴露时间正相关,且BPF富集能力高于BPS.联合暴露对BPS富集水平的影响高于BPF. 3.2 BPF诱导的氧化损伤和炎症效应高于BPS,且联合暴露的氧化损伤效应高于单一暴露.BPS诱导的神经毒性效应强于BPF,联合暴露削减了对神经毒性生物标志物AChE、COR和EPI等神经毒性生物标志物的影响.BPF的毒性效应侧重于氧化损伤及炎症,而BPS的神经毒性效应更强,联合暴露期增加了氧化损伤及炎症,但削减了神经毒性效应.

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作者简介：王倩倩(1993-),女,安徽池州人,河海大学硕士研究生,主要从

事环境内分泌干扰物的生物效应研究.