维普资讯 http://www.cqvip.com 河南农业科学 抗Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ ＨＡ单克隆抗体的制备及其 在胶体金层析检测中的初步应用 詹爱军 。，王新卫”，陈枝楠 ，卢体康 ，花群义 （１．深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳５１８０１０；２．扬州大学兽医学院，江苏扬州２２５００９； ３．河南农业大学牧医工程学院，河南郑州４５０００２） 摘要：用基因疫苗ｐｃＤＮＡ—Ｈ９和纯化Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，细胞融合后用ＨＩ和 ＥＬＩＳＡ方法筛选出５株抗Ｈ９亚型ＡＩＶ ＨＡ的特异性单克隆抗体Ｈ９—０１（２Ｅ６），Ｈ９—０２（３Ｂ１）， Ｈ９—０３（３Ｈ１１），Ｈ９—０４（１Ａ４），Ｈ９—０５（２Ｇ９）。各株单抗亚型测定的结果为Ｈ９一Ｏ１，Ｈ９一Ｏ２和 Ｈ９—０５均为ＩｇＧ２ｂ，Ｈ９—０３为ＩｇＧ１，Ｈ９一Ｏ４为ＩｇＧ２ａ，轻链的亚型均为ｋａｐｐａ链。经特异性和 与同型病毒的反应谱检测，它们均是ＨＡ特异性单克隆抗体。用制备的抗Ｈ９亚型ＡＩＶ ＨＡ的单 克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条，可以检测到２００个ＥＩＤ。。的Ｈ９亚型ＡＩＶ，为监测该亚型 ＡＩＶ试剂盒的进一步商品化奠定了基础。 关键词：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ；单克隆抗体；胶体金层析检测 中图分类号：￥８５２．６５ ９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４—３２６８（２００８）０９—０１２３一Ｏ４ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ Ａ ｏｆ Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｓｓａｙ ＺＨＡＮ Ａｉ—ｊｕｎ ”，ＷＡＮＧ Ｘｉｎ—ｗｅｉ”，ＣＨＥＮ Ｚｈｉ—ｎａｎ ，ＬＵ Ｔｉ—ｋａｎｇ ，ＨＵＡ Ｑｕｎ—ｙｉ （１．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ＣＩＱ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８０１０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ ２２５００９，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｌｂ／Ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｐｃＤＮＡ—Ｈ９ ｇｅｎｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｏｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈ９Ｎ２ ｓｕｂｔｙｐｅ ＡＩＶ．Ａｆｔｅｒ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ，ｆｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｈ９～０１（２Ｅ６），Ｈ９—０２（３Ｂ１），Ｈ９—０３（３Ｈ１１），Ｈ９一Ｏ４（１Ａ４）ａｎｄ Ｈ９—０５（２Ｇ９）ｗｈｉｃｈ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ ｓｅｃｒｅｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ９ ｓｕｂｔｙｐｅ ＡＩＶ， ｗｅｒｅ ｆｉｎａｌｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｈ１ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ．Ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅ— ｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ Ｈ９—０１，Ｈ９—０２ ａｎｄ Ｈ９—０５ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ＩｇＧ２ｂ，Ｈ９—０３ ｔｏ ＩｇＧ１，Ｈ９— ０４ ｔｏ ＩｇＧ２ａ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ａｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｋａｐｐａ ｓｕｂｔｙｐｅ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｈｏｍｏ— ｌｏｇｏｕｓ ｖｉｒｕｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ａｌｌ ＨＡ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ— ｂｏｄｉｅｓ．Ａ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ９ ＡＩＶ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ，ａｎｄ ２００ ＥＩＤ５０ Ｈ９ ＡＩＶ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅ— ｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ．Ｏｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｕｓｅｆｕｌ ｄａｔａ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｋｉｔ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈ９Ｎ２ ｓｕｂｔｙｐｅ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｉｍｍｕｎｏ－ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓａｙ 收稿日期：２００８—０４—２８ 基金项目：国家“十一五”科技支撑计划项目（２００６ＢＡＫ０２Ａ２９） 作者简介：詹爱军（１９７０一），男，江苏扬州人，兽医师，博士后，主要从事动物传染病研究。 通讯作者：王新卫（１９７１一），男，河南泌阳人，副教授，主要从事动物病毒学研究。 ・ １２３ ・ 维普资讯 http://www.cqvip.com １９７５年，Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ开创了一项具有划 时代意义的新技术，即利用Ｂ淋巴细胞杂交瘤生产 单克隆抗体（ＭｃＡｂ），在诊断、治疗、预防和提纯蛋 白质方面显示了重要的作用和广阔的应用前景。单 克隆抗体具有单～抗原决定族特异性以及产生特定 性质抗体的无限性，因而用于病毒学诊断时，具有超 过多克隆抗血清的许多优点 。１９９４年Ｂａｒｒｙ 等＿２ 用ｈＧＨ基因免疫小鼠，并用免疫鼠脾细胞建 立了杂交瘤，最终成功地获得了分泌抗ｈＧＨ抗体 的单克隆细胞株，为单克隆抗体的研制开辟了一条 新的途径。 禽流感（ＡＩ）是Ａ型禽流感病毒（ＡＩＶ）所引起 的禽类的一种急性高度致死性传染病，是危害目前 养禽业最严重的疫病，被世界动物卫生组织（ＯＩＥ） 规定为Ａ类传染病。１９９７年和２００３年底一些 国家发生Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ感染人事件，提示人们禽 流感的防治具有公共卫生意义 。因此，如果能 研制出禽流感病毒的单克隆抗体，将对禽流感的诊 断、防制和病毒蛋白分子结构分析提供有利条件，实 际应用前景非常广阔。本研究利用多种免疫方法， 制备抗Ｈ９亚型ＡＩＶ血凝素单克隆抗体，并利用制 备的特异性抗成检测Ｈ９亚型流感病毒的胶体 金层析试纸条，为进一步研究ＨＡ蛋白的抗原表 位，以及临床检测该亚型流感病毒奠定基础，进而为 控制与预防禽流感提供技术支持。 １材料和方法 １．１ 病毒、试验动物与细胞系 ４株ＮＤＶ、４株Ｈ９亚型ＡＩＶ（用于检测试纸条 的１株病毒效价ＥＩＤ 。为１０ ・。／ｍＬ）和３株Ｈ５亚 型ＡＩＶ、ｌ株产蛋下降综合征（Ｅｐｓ）病毒毒株由深 圳出入境检验检疫局动植中心分离、鉴定并保存。 重组质粒ｐｃＤＮＡ—Ｈ９由作者构建。 Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠、昆明鼠购自中山医科大学实验动 物中心．小鼠骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）由扬州大学兽医 学院提供。 １．２细胞培养基及其他试剂 ＰＥＧ～１０００、ＰＥＧ～２０００、细胞基础培养基ＩＭ— ＤＭ和降植烷、石蜡油为Ｇｉｂｃｏ ＢＲＩ 公司产品；弗 氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、ＲＰＭＩ一１６４０培养 基、次黄嘌呤（Ｈ）胸腺嘧啶（Ｔ）氨基喋呤（Ａ）（５０× ＨＡＴ）、次黄嘌呤（Ｈ）胸腺嘧啶（Ｔ）（１００×ＨＴ）均为 Ｓｉｇｍａ公司产品；新生小牛血清和胎牛血清购自杭 州四季青生物工程材料有限公司；Ｍｏｕｓｅ Ｍａｂ Ｉｓｏ一 ・ １ ２４ ・ ２００８年第９期 ｔｙｐｉｎｇ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ购自ＨｙＣｕｌｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂ．ｖ公 司；酶标兔抗鸡ＩｇＧ和羊抗鼠ＩｇＧ（二抗）为珠海百 奥生物技术有限公司产品；Ｈ９和Ｈ５亚型禽流感抗 原、阳性血清、阴性血清购自哈尔滨兽医研究所。 １．３ 分泌抗Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ ＨＡ ＭｃＡｂ杂交瘤细胞株 的建立 １．３．１ 免疫８周龄的一级雌性Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠ｌ０ 只，随机分为２组，每组５只。然后将纯化Ｈ９ ＡＩＶ 和ｐｃＤＮＡ—Ｈ９与等量的弗氏完全佐剂混合乳化首 次免疫，每只小鼠０．５ｍＩ ；间隔１４ ｄ后以弗氏不完 全佐剂乳化的抗原进行二次免疫，剂量同前。在第 ３次免疫后７ ｄ试血，当抗体效价达到２。以上时，由 腹腔注射不加佐剂的抗原０．５ｍＬ，３～４ ｄ后采血取 脾，用于细胞融合。 １．３．２ 检测方法的建立 按常规间接Ｅ１ ＩＳＡ操作 步骤 ｊ，运用棋盘滴定试验，确定抗原最佳包被浓 度、待检抗体最佳工作浓度及判定标准；同时设立空 白对照及ＳＰ２／０上清对照。ＨＡ和ＨＩ试验参照 ＯＩＥ标准进行。 １．３．３ 阳性杂交瘤细胞株的筛选及ＭｃＡｂ制备 参照文献［６］方法进行融合，筛选出阳性杂交瘤细胞 株，扩大培养后制备腹水；然后用蛋白Ａ（ＳＰＡ）法提 纯腹水和阳性杂交瘤细胞培养上清中的ＩｇＧ，一２ＯＣ 保存备用。 １．４ ＭｃＡｂ鉴定 １．４．１ 特异性排谱反应 用ＥＬＩＳＡ方法将抗Ｈ９ ＡＩＶ单克隆抗体与４株ＮＤＶ、４株Ｈ９亚型ＡＩＶ和 ３株Ｈ５亚型ＡＩＶ、１株产蛋下降综合征病毒毒株反 应，检测其特异性。用Ｈ１，ＥＬＩＳＡ方法将抗Ｈ９亚 型ＡＩＶ单克隆抗体与表达蛋白Ｈ９ＨＡ反应，检测 各株单克隆抗体是否针对禽流感血凝素蛋白。 １．４．２ ＭｃＡｂ抗体效价及亚类测定 按照Ｍｏｕｓｅ Ｍａｂ ｌｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ方法鉴定５株单克隆抗体 的亚型。加入５００ Ｌ缓冲液至含有Ｋ或 轻链的 检测试纸条的小试管，加５００ Ｉ 单抗溶液（纯化腹 水１Ｏ０～１ ０００倍稀释，培养上清不稀释）至小试管。 最后判断单抗的亚型。 １．４．３ 单抗的Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ分析 参照姜泊 等 的方法进行，以ＳＤＳ～聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ— ＰＡＧＥ）电泳并进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－－Ｂｌｏｔ鉴定。 １．５检测Ｈ９亚型禽流感的胶体金层析试纸条的 制备及对Ｈ９亚型ＡＩＶ检测 纯化好的Ｈ９亚型ＡＩＶ血凝素单克隆抗体经 定量后，由华南理工大学万孚生物技术有限公司做 维普资讯 http://www.cqvip.com 河南农业科学 成胶体金层析检测试纸条，每１ ｍＬ纯化腹水可制 ＯＤ 。≥０．２０判为阳性。 成３００根胶体金层析试纸条。 ２．２ 分泌抗Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ ＨＡ ＭｃＡｂ杂交瘤细胞株 ‘将经过ＥＩＤ 。测定的Ｈ９Ｎ２亚型禽流感尿囊液 的建立 用０．１ 甲醛灭活，用ＰＢＳ稀释成含有２０ ０００， 试验共进行５次融合，其中免疫核酸疫苗和 ５０００，１ ０００，２００和５Ｏ个ＥＩＤ 。的病毒滴加到胶体 Ｈ９ＨＡ蛋白的小鼠的细胞融合各失败１次；另３次 金层析检测试纸条上，１５ ｍｉｎ～１ ｈ内观察结果，出 细胞融合成功，每次接种４３２孔，融合率均超过 现２条反应线的判为阳性，设Ｈ５亚型抗原对照。 ８０ 。经Ｈｌ检验，最终筛选出１株阳性细胞，标记 ２结果与分析 为Ｈ９—０１（２Ｅ６）；经ＥＬＩＳＡ检验，最终筛选出４株 阳性细胞，阳性细胞株分别标记为Ｈ９—０２（３Ｂ１）， ２．１ 间接ＥＩ ＩＳＡ方法的建立 Ｈ９—０３（３Ｈ１１），Ｈ９—０４（１Ａ４）和Ｈ９一Ｏ５（２Ｇ９）。 通过方阵滴定试验，抗体工作浓度在１：７ ０００ ２．３ 单克隆抗体的特异性反应和排谱反应 ～１００００ ＯＤ值比较稳定。因此，选择酶标抗体工 分别用ＨＩ和ＥＵＳＡ方法与４株ＮＤＶ、４株 作浓度为１：７ ０００ １０ ０００最宜。Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ尿囊 Ｈ９亚型ＡＩＶ和３株Ｈ５亚型ＡＩＶ、ｌ株产蛋下降 液稀释２００倍，阳性血清稀释２００倍时Ｐ／Ｎ值最大 综合征病毒毒株反应的结果见表１。５株Ｈ９单克 （５．７８），即Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ尿囊液稀释２００倍时为最佳 隆抗体与Ｈ９ＡＩＶ反应的ｏＤ值明显大于与ＮＤＶ、 包被量。Ｈ９ＨＡ蛋白包被量在２．５～５ｔ￣ｇ／ｍＬ之间， Ｈ５亚型ＡＩＶ和ＥＤＳＶ反应的ｏＤ值。用Ｈ９亚型 阳性血清稀释２００倍时Ｐ／Ｎ值最大（４．９７和４．９８）， Ａ１Ｖ ＨＡ表达蛋白检测各株单抗针对的抗原蛋白， 即Ｈ９ＨＡ蛋白最佳包被量在２．５～５ ｇｇ／ｍＬ。划定 结果见表２。５株Ｈ９单克隆抗体与Ｈ９ＨＡ呈阳性 标准：测定ＯＤ 。值，Ｐ／Ｎ≥２．１且ｏＤ 。≥０．３ｏＮ 反应，说明这５株单克隆抗体都是特异性针对 为阳性（包被提纯病毒），包被ＨＡ表达蛋白的 Ｈ９ＨＡ的。 表１ ５株Ｈ９单克隆抗体与ＮＤＶ，Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ，Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ和ＥＤＳＶ的反应 ２．４单克隆抗体的亚型测定 有反应条带，提示可能与病毒ＨＡ蛋白的空间结构 Ｈ９各株单抗亚型测定的结果分别为Ｈ９一Ｏ１， 对应。 Ｈ９—０２和Ｈ９—０５均为ＩｇＧ２ｂ；Ｈ９—０３为ＩｇＧ１， ２．６ 胶体金层析试纸条对Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ的检测 Ｈ９—０４为ＩｇＧ２ａ，轻链的亚型均为ｋａｐｐａ链。 试纸条与２００００，５０００，１ ０００和２００个ＥＩＤ５。的 ２．５ 单克隆抗体的Ｗｅｓｔｅｒｎ－－Ｂｌｏｔ检测 Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ呈阳性反应，与５Ｏ个ＥＩＤ 。的Ｈ９Ｎ２ 经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，然后转移纤维素 ＡＩＶ和Ｈ５Ｎ１ ＡＩＶ呈阴性反应（图１）。 膜，用特异性的Ｈ９ ＡＩＶ作Ｗｅｓｔｅｒｎ－－Ｂｌｏｔ检测，没 ・ １２５ ・ 维普资讯 http://www.cqvip.com
２００８年第９期 １—４对应的病毒含量分别为２０ ０００，５ ０００，１ ０００和２００个ＥＩＤ５０；５，６分别表示５０ ＥＩＤｓ０ Ｈ９ＡＩＶ和Ｈ５ＡＩＶ的反应结果 图ｌ胶体金层析试纸条与不同浓度Ｈ９ＡＩＶ及Ｈ５ＡＩＶ的反应结果 ３讨论 参考文献： Ｈ９Ｎ２亚型流感病毒的ＨＡ纤突是由３个ＨＡ ［１］Ｅｓｐｙ Ｍ Ｊ，Ｓｍｉｔｈ Ｔ Ｆ，Ｈａｒｍｏｎ Ｍ Ｗ，ｅｔⅡ ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｓｈｅｌｌ ｖｉａｌ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ— 单体聚合在一起形成的三聚体［８ 。单抗的免疫印迹 结果表明，５株单抗是构像特异性的，与ＨＡ蛋白的 ｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８６，２４：６７７—６７９． ［２］ Ｂａｒｒｙ Ｍ Ａ，Ｂａｒｒｙ Ｍ Ｅ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｓ Ａ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔ ｉｏｎ Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｌ９９４，１６（４）：６１６—６２０． 立体构像相对应。此外，禽流感病毒存在抗原漂移 和抗原转变现象［ ，其抗原突变频率很高，而以血凝 素基因的突变率最高。禽流感病毒亚型众多，而且 在同一亚型的病毒中也有许多毒株，其抗原性存在 差异。因此，制备的单克隆抗体必须进行型特异性 检测和同型的排谱反应。本研究分别用ＨＩ和 ［３］Ｚｈｏｕ Ｎ Ｎ，Ｓｈｏｒｔｈｉｄｇｅ Ｋ Ｆ，Ｃｌａｕｓ Ｅ ｃ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｅｖｏ— ｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎ ＨｏｎｇＫｏｎｇ ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ，ｌ９９９，７３（４）：３３６６—３３７４． ［４］王秀荣，陈化兰．禽流感与公共卫生［Ｊ］．基础医学与临 床，２００５，２５（１２）：１０７９—１０８３． ＥＬＩＳＡ方法将获得的单克隆抗体与４株ＮＤＶ、４株 ［５］朱立平，陈学清．免疫学常用实验方法［Ｍ］．北京：人民 军医出版社，２０００：３４２—３５８． Ｈ９亚型ＡＩＶ和３株Ｈ５亚型ＡＩＶ、ｌ株产蛋下降 综合症病毒毒株反应，检测其特异性和与同型病毒 的反应谱，获得了较为广谱的亚型特异性单克隆抗 体，对于防控广泛流行危害严重的Ｈ９Ｎ２亚型禽流 感有重要意义。 Ｅ６］冯仁青，郭振泉，宓捷波．现代抗体技术及其应用［Ｍ］． 北京：北京大学出版社，２００６：５５—７０． ［７］姜泊，张亚历，周殿元．分子生物学常用实验方法［Ｍ］． 北京：人民军医出版社，１９９５：９２～９４． ［８］ 王新卫．詹爱军．禽流感病毒的宿主特异性和致病性分 子基础［Ｊ］．长江大学学报（农学卷），２００６，３（１）：ｌ６ｌ一 １６４． 胶体金溶液是指分散相粒子直径在１～１５０ ｒｉｍ 的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫 红色。１９７１年胶体金被引入免疫化学中，开始作为 一［９］ 王泽霖，刘岩，李建丽，等．Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒抗原 性变异的研究［Ｊ］．中国兽医学报，２００７，２７（３）：３５１— ３５４． 种免疫标记技术而被使用。之后，许多学者进一 步证实胶体金能稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白 质的生物活性无明显改变，可以作为探针进行细胞 表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸 等生物大分子的精确定位，也可以用于日常的免疫 诊断，进行免疫组织化学定位，在临床诊断及药物检 测等方面的应用已受到广泛的重视 。 。。 。笔者利 ［１Ｏ］Ｈｏｌｇａｔｅ Ｃ Ｓ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｐ，Ｃｏｗｅｎ Ｐ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｇｏ— ｌｄ—ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ， １９８３，３ｌ：９３８—９４４． ｒ ｌ１］ Ｆａｕｌｋ Ｗ，Ｔａｙｌｏｒ Ｇ．Ａｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｌｌｏｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７９，８： １Ｏ８１一ｌＯ８３． 用制备的抗Ｈ９亚型ＡＩＶ ＨＡ的单克隆抗体，经华 南理工大学万孚生物技术有限公司做成胶体金层析 检测试纸条，可以检测到２。（）ＥＩＤ 的Ｈ９亚型ＡＩ病 ［１ ２］Ｒｏｍａｎｏ Ｅ，Ｓｔｏｌｉｎｓｋｙ Ｃ，Ｈｕｇｈ－Ｊｏｎｅｓ Ｎ．ＵＩｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒ ａｌ ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａ ｇｏｌｄ ｃｏｍｐｌｅｘ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｌ９７４． １ｌ：５２ｌ一５２２． 毒，方法简便快捷，具有很好的特异性，可以推广应 用。同时也为临床上检测Ｈ９亚型流感病毒提供了 一［１３］ Ｒｏｔｈ Ｊ，Ｂｅｎｄａｙａｎ Ｍ，Ｏｒｃｉ Ｌ．ＦＩＴＣ—ｐｒｏｔｅｉｎ ａ ｇｏｌｄ ｃｏｍ— ｐｌｅｘ ｆｏｒ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍ— 种可行的方法。 ・ ｉｓｔｒｙＥＪ］．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，１９８０，２８：５５—５７． １ ２６ ・
