ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＮＡＴＯＭＹ Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．５ ２０１２ 解剖学杂志２０１２年第３５卷第５期 Ｏｃｔ一４及生殖细胞核因子在精原干细胞体外分化前后的表达 王 菊 宋 勇 王 苗周宗瑶△ ８３２００２） （石河子大学医学院组织学与胚胎学教研室，石河子摘要 目的：检测Ｏｃｔ一４和生殖细胞核因子（ＧＣＮＦ）在小鼠精原干细胞（ＳＳＣｓ）诱导分化前后的表达。方法：体外分离培养 小鼠ＳＳＣｓ，用干细胞因子（ＳＣＦ）诱导其向精母细胞方向分化，通过间接免疫荧光显色和ＲＴ－ＰＣＲ，检测Ｏｃｔ－４和ＧＣＮＦ在 小鼠ＳＳＣｓ诱导分化前后的表达。结果：Ｏｃｔ－４在小鼠ＳＳＣｓ诱导前有表达，诱导２ ｄ后表达下降；而ＧＣＮＦ在小鼠ＳａＣｓ诱 导前呈阴性表达，向精母细胞诱导２ ｄ后呈阳性表达。结论：ＧＣＮＦ可能通过抑制Ｏｃｔ一４的表达促使ＳＳＣｓ分化。 关键词 Ｏｃｔ－４；生殖细胞核因子；精原干细胞；分化；间接免疫荧光 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ－４ ａｎｄ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ Ｗａｎｇ Ｊｕ，Ｓｏｎｇ Ｙｏｎｇ，Ｗａｎｇ Ｍｉａｏ，Ｚｈｏｕ Ｚｏｎｇｙａｏ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ ８３２００２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ－４ ａｎｄ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒｓ（ＧＣＮＦ）ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉ— ｕｍ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＳＳＣｓ）ａｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＳＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌ１ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ａｇｅｓ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｓｐｅｒｍａ ｔｏｃｙｔｅｓ．Ｔｈｅ ｉｍｍｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ－４ ａｎｄ ＧＣＮＦ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＳａＣｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｒｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ一４ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ＳＳＣｓ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｗｏ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ；ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓ— ｓｉｏｎ ｏｆ ＧＣＮＦ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＳａＣｓ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＣＮＦ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ２ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏｗａｒｄｓ ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＧＣＮＦ ｉｓ ｌｉｋｅｌｙ ｔｏ ｐｒｏｍｐｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＣｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ－４． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｏｃｔ－４；ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ；ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ 精原干细胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＳＳＣｓ）是 导剂诱导培养的小鼠ＳＳＣｓ向精母细胞分化，通过问接 免疫荧光显色和ＲＴ－ＰＣＲ技术，从蛋白和ｍＲＮＡ水平 动物体内惟一能进行遗传信息传递的干细胞，有研究 表明，在成体动物的精原干细胞有Ｏｃｔ－４基因表达。 Ｏｃｔ一４作为干细胞标志物，是维持细胞全能性的转录 观察ＧＣＮＦ和Ｏｃｔ一４在小鼠ＳＳＣｓ诱导分化前后的 表达。 １材料和方法 １．１ 实验动物 因子。体外研究证实，Ｏｃｔ－４作为转录因子受生殖细 胞核因子（ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ，ＧＣＮＦ）。ＧＣ— ＮＦ是核受体超家族成员之一，由于其配体未知，因而 又称为孤儿受体。最近研究表明，ＧＣＮＦ在小鼠睾丸 ４～６周ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，购自医科大学实验动 物中心。 １．２主要试剂 生后发育的第８天开始出现，定位于精原细胞，而第 １７天后的精原细胞却表现为阴性，此时的ＧＣＮＦ定位 于部分粗线期精母细胞和圆形精子细胞，提示ＧＣＮＦ 在精子发生的启动中可能起到一个“开关样”作用＿】］。 但是，Ｏｃｔ４及ＧＣＮＦ在体外培养的小鼠ＳＳＣｓ中是否 有表达，目前尚未见报道。本研究通过体外分离、培养 小鼠ＳＳＣｓ，应用干细胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ，ＳＣＦ）诱 Ｌ－ＤＭＥＭ培养基（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’Ｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｄｕｌｂｅｅｃｏ，Ｇｉｂｃｏ公司）；胎牛血清（ｆａ— ｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｎ，ＦＢＳ，Ｈｙｃｏｌｏｎ公司）；ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；ＳＣＦ、ＧＣＮＦ单克隆抗体（Ｓｉｇｍａ公司）； Ｏｃｔ一４多克隆抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司）；异硫氰酸荧光素 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１—１６３３．２０１２．０５．００６ （ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）标记的山羊抗兔 ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）；ＴＲＩｚｏｌ试剂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；ＲＴ— ＰＣＲ试剂盒（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）。 １．３ 睾丸组织获取（阳性对照组） 第１作者Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｔ＞ｗｊ＠ｓｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ △通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｏｎｇｙａｏｚｈ＠１６３．ｃｏｍ 收稿日期：２０１２—０１—１２；修回日期：２０１２—０５—０１ 取小鼠睾丸组织，将其总数一半制作成石蜡切片， ５７５— ３讨论 本研究观察到ＧＣＮＦ在体外培养的小鼠ＳＳＣｓ中 表达为阴性，Ｏｃｔ一４阳性，提示培养的细胞为精原干细 胞，未发生分化；间接免疫荧光以及ＲＴ—ＰＣＲ结果均显 示原代培养的小鼠ＳＳＣｓ体外诱导分化２ ｄ后，多数细 胞呈ＧＣＮＦ强阳性，而Ｏｃｔ－４表达转为阴性，提示ＧＣ— Ｏｃｔ一４作为干细胞标志物，它是维持细胞全能性的 转录因子。Ｏｃｔ一４基因定位于人类染色体６ｐ２１．３，其编 码的Ｏｃｔ一４蛋白是一种Ｖ类ＰＯＵ蛋白。ＰＯＵ转录因 子是ＤＮＡ结合蛋白，ＡＴＧＣＡＡＡＴ序列为其识别的顺 式结合位点，它可以激活在启动子或增强子区域内带 有顺式反应元件基因的转录，这一类基因的顺式反应 ＮＦ可能参与了ＳＳＣｓ的早期分化，ＧＣＮＦ可能是通过 抑制了Ｏｃｔ一４的表达，关闭了多潜能基因，从而促使 ＳＳＣｓ分化。本研究结果将有助于进一步阐明生殖干 元件中包含Ｏｃｔ序列（称为Ｏｃｔ结构）。它与其他转录 因子如Ｓｏｘ、ＦｏｘＤ３结合，共同作用于许多下游靶基因 的启动子或增强子，正／负下游靶基因的表达，从 细胞增殖与分化以及精子发生的分子机制。此外，体 外培养的小鼠ＳＳＣｓ以及诱导其定向分化后的细胞在 临床医学、生物工程学以及转基因研究等诸多领域有 而维持干细胞的自我更新状态［３］。有研究表明，一旦 触动胚胎干细胞分化，Ｏｃｔ－４表达立即下调＿４］，提示 Ｏｃｔ一４抑制了细胞的分化，在维持干细胞的未分化状态 起到了重要作用。 体外研究证实，Ｏｃｔ一４作为转录因子受ＧＣＮＦ调 控。ＧＣＮＦ是核受体超家族成员之一，由于其配体未 知，因而又称为孤儿受体，ＧＣＮＦ在不同物种伺同源性 很高，因而在功能上很可能具有高度保守性。研究表 明，ＧＣＮＦ在成年人及动物睾丸或卵巢中高度表达。 在睾丸ＧＣＮＦ表达大小分别为７．４ ｋｂ和２．３ ｋｂ的转 录子，其中２．３ ｋｂ的转录子主要定位于圆形精子细胞， 这种表达提示ＧＣＮＦ在精子发生的特定阶段发挥调节 作用［５＿６］。最近研究表明，ＧＣＮＦ在小鼠睾丸生后发育 的第８天开始出现，定位于精原细胞，而第１７天后的精 原细胞却表现为阴性，此时的ＧＣＮＦ定位于部分粗线 期精母细胞和圆形精子细胞，提示ＧＣＮＦ在精子发生 的启动中可能起到一个“开关样”作用［１］。此外，还观 察到动物附睾生后发育中ＧＣＮＦ表达的时空规律以及 区域特异性，提示ＧＣＮＦ可能在附睾上皮的发育分化 和附睾中精子的成熟起重要作用［７喝］。 姜开军等［９ 报道，在３．５ ｄｐｃ小鼠胚胎细胞中只表 达Ｏｃｔ一４，而不表达ＧＣＮＦ，间接说明ＧＣＮＦ和Ｏｃｔ一４ 在胚胎发育过程中的表达呈负相关，且观察到ＧＣＮＦ 在ＢＭＳＣｓ体外分化中有表达，提示ＧＣＮＦ参与了成体 干细胞的分化。Ｓａｔｏ等［１０］研究表明，在胚胎干细胞体 外诱导分化过程中，Ｏｃｔ一４基因表达的下调是由于该基 因启动子区发生甲基化，而ＧＣＮＦ可以促进Ｏｃｔ一４基 因的甲基化。提示ＧＣＮＦ通过下调Ｏｃｔ一４基因的表达 而参与胚胎干细胞的分化。 着较为广阔的应用前景。 参考文献 ［１］ＸｕＣ，ＺｈｏｕＺＹ，ＧｕｏＱＳ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｐｅｒｍ ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｐｅｒｉｏｄ ＥＪ］． Ａｓｉａｎ Ｊ Ａｎｄｒｏｌ，２００４，６（３）：２１７－２２２． ［２］王菊，符毓豪，谢松松，等．小鼠精原干细胞的体外培养与鉴定 ＥＪ－１．石河子大学学报，２００９，２７（４）：４７０—４７３． ［３］Ｚｈｏｕ Ｚ Ｙ，Ｘｕ Ｃ，Ｇｕｏ Ｑ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＳＦｌａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ［Ｊ］．Ａｓｉａｎ Ｊ Ａｎ— ｄｒｏｌ，２００４，６（１）：２３—２８． ［４］Ｈａｙ Ｄ Ｃ，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ Ｌ，Ｃｌａｒｋ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｏｃｔ一４ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ａｎｄ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍａｒｋ— ｅｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ Ｉ－Ｊ］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２００４，２２（２）：２２５—２３５． ［５］ＨｉｒｏｓｅＴ，Ｏ’ＢｒｉｅｎＤＡ，ＪｅｔｔｅｎＡＭ．ＲＴＲ：ａ ｎｅｗｍｅｍｂｅｒ ｏｆｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｔｅｓｔｉｓ Ｉ－Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９９５，１５２（２）：２４７—２５１． ［６］ＺｈａｎｇＹＬ，ＡｋｍａｌＫＭ，Ｔｓｕｒｕｔａ ＪＫ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ（ＧＣＮＦ／ＲＴＲ）ｄｕｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，１９９８，５０（１）：９３—１０２． ［７］Ｈｕ Ｙ，Ｚｈｏｕ Ｚ，Ｘｕ，Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｒｅ— ｇｉｏｎ－ｓｐｅｅｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＣＮＦ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ［Ｊ］．Ｅｎｄｏ— ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００３，１４４（４）：１６１２—１６１９． ［８］Ｚｈｏｕ Ｚ Ｙ，Ｘｕ Ｃ，Ｇｕｏ Ｑ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｐａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ［Ｊ］．Ａｓｉａｎ Ｊ Ａｎ— ｄｒｏｌ，２００４ ６（１）：２３—８． ［９］姜开军，王菊，周宗瑶，等．生殖细胞核因子在骨髓间充质干细胞 中的表达口］．农垦医学，２００８，３０（４）：２５７—２６０． ［１０］Ｓａｔｏ Ｎ，Ｋｏｎｄｏ Ｍ，Ａｒａｉ Ｋ．Ｔｈｅ ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＧＣＮＦ ｒｅｃｒｕｉｔｓ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎ－ｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ Ｏｃｔ一３／４ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｂｉｏ— ｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００６，３４４（３）：８４５—８５１． （编辑：刘 芳） ５７７－－－——
