细胞培养步骤

细胞培养前需要准备的物品

提前开启37℃水浴锅和超净台的紫外灯； 灭菌吸头、1.5mL的离心管、空玻璃瓶； 无菌的15mL、50mL离心管；

无菌的10cm培养皿、16孔板、32孔板、96孔板、培养瓶等。 5mL、10mL的移液管；

橡胶手套、普通移液器、电子移液器、装有99.9%-100%CO2钢瓶

70%酒精、DMEM培养基（37℃提前温浴）、FBS血清、二抗生素（10,000Unit/mL penicillin和10,000ug/mL Streptomycin混合液）、0.05% typsin-EDTA（上述培养细胞所用试剂都用GIBCO的产品，国产的产品没有办法保证质量）

细胞培养步骤

1. 取一瓶液体DMEM培养液（GIBCO DMEM液体低糖培养基）、FBS血清、二抗，在放入超净台前用70%的酒精消毒；

2. 向500mL的DMEM培养基中加入55mL的FBS血清，至终浓度为10%，再向其中加入双抗生素，一般保证抗生素的单位达到100Units（即500mL培养基中加入5mL 10,000单位的双抗生素，如果用于保藏的细胞培养最好不加），放置于4℃冰箱中保藏待用； 3. 细胞培养使用前培养基应先放入37℃水浴中温浴，提前打开超净台的紫外灯杀菌，然后从水浴锅中取出培养基，喷上70%酒精后放入超净台中待用；

4. 从液氮中取出冻存管，立刻放入37℃的水浴锅中晃动，直至细胞冻存液完全溶解； 5. 将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5mL培养液，轻轻吹打混匀； 6. 将细胞悬液经500rpm/min离心5min，弃上清液。

7. 向细胞沉淀内再加入适量培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养皿中进行培

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养。

8. 取出在培养箱中培养的细胞（一般BMSCs传代3次左右就不太好了，所以较难培养）显微镜下观察细胞的生长状态，在超净台中吸去表面的培养基，此时加入少量的培养基清洗一下，然后向培养基内加入1-2 ml 0.05%胰蛋白酶后放入37℃培养箱中处理1-2分钟使细胞与培养皿脱离。

9. 取出培养皿，观察胰酶处理的效果，一般以视野中出现均匀的单细胞为宜，如果有多个细胞聚集的现象可以继续处理1-2分钟，然后吸去胰酶，加入适量的培养基进行终止胰蛋白酶活性，用电子移液器套移液管进行吹打，使细胞悬浮。

10. 显微镜下观察细胞悬浮程度，最好是可以看到均匀的单细胞，如果有多个细胞聚集的现象可以用手动移液器进行吹打。

11. 向事先准备好的培养皿中加入8-9ml的培养基（此过程加入的培养基的量与加入细胞时所带入的培养基的量有关），一般10cm的平板中总量有10ml的培养基。向含有培养基的培养皿中加入1-2ml的细胞悬液，然后放入细胞培养箱内

注意事项：

1. 加入FBS血清时要考虑血清本身的体积，使FBS血清的终浓度达到10%；

2. FBS血清和二抗生素提前1天放入4℃的冰箱中融化，可以用50mL无菌的离心管分装，以免多次融化造成血清变性。每50mL的离心管中最多装入40-45mL的FBS血清，因为血清冻存后会膨胀；

3. 冻存管中的细胞溶化过程要迅速，减少DMSO对细胞的破坏作用；

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