肝细胞亲和-HPLC法体外筛选三七总皂苷（PNS）抗肝细胞脂肪变性的活性成分

脂肪变性的活性成分

徐文博;陈艺丹;周律;贝伟剑;范辉

【摘 要】目的 通过肝细胞亲和-HPLC法体外筛选三七总皂苷（PNS）中降脂活性成分。方法 采用HepG2细胞系与PNS体外共孵育,联合HPLC法检测孵育后的细胞解离液,色谱柱为Aglient-C（18）（250 mm×4.6mm,5μm）,流动相为乙腈-水,梯度洗脱（0-35 min,乙腈的体积百分比为29%;70-100 min,乙腈的体积百分比为29%→40%）,流速为1.0 mL/min,检测波长为203 nm;采用体外肝细胞脂肪变性模型对PNS中亲和成分的降脂活性进行评价。结果 从PNS中筛选出2个肝细胞特异性亲和成分,分别为人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1;与正常组相比,建立的体外肝细胞脂肪变性模型组细胞内三酰甘油（TG）含量显著升高（P〈0.05）,不同浓度的PNS、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1作用后给药组细胞内TG含量显著降低（P〈0.05）,呈剂量效应关系。结论 建立肝细胞亲和-HPLC法,筛选出PNS亲和成分为人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1,经体外模型验证亲和成分具有显著降脂活性。

【期刊名称】《广东药科大学学报》 【年(卷),期】2017(033)002 【总页数】5页(P226-230)

【关键词】三七总皂苷 肝细胞 HPLC 脂肪变性 【作 者】徐文博;陈艺丹;周律;贝伟剑;范辉

【作者单位】[1]广东药科大学中医药研究院,国家中医药管理局高脂血症“调肝降脂”重点研究室／脂代谢三级实验室,广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室,广东广州510006;[2]广东药科大学药学院,广东广州510006 【正文语种】中 文 【中图分类】R917

脂肪肝是指各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，以肝细胞大泡性脂肪变性为病理特征[1-3]。近10年来，全球肥胖、糖尿病、代谢综合征及其相关非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病率不断增高，而中国的脂肪肝患者也日益增多[4]。

五加科人参属植物三七Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen，是我国名贵中药材，具有化瘀止血、活血定痛之功效，三七富含皂苷类成分，目前已从三七不同部位分离得到70余种达玛烷型皂苷。三七总皂苷(Panax Notoginseng

Saponins,PNS)为三七的主要活性组分，文献报道在体外培养建立的肝细胞脂肪变性模型中PNS能显著降低脂肪变性肝细胞内三酰甘油(triglyceride，TG)水平，减轻肝细胞脂肪变性[5]。在体内PNS通过降低丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、肝脏TG水平来缓解大鼠酒精性脂肪肝[6]。

PNS中单体皂苷成分10余种之多，其中人参皂苷Rg1和Rb1含量最高[7]。现代药理研究表明，与靶细胞、细胞内特异性的酶或受体结合是中药发挥作用的一个重要步骤。通过体外细胞与中药提取液直接作用，鉴定出细胞亲和成分，药理评价亲和物质活性，可作为中药药效物质基础研究的筛选方法之一[8]。本文旨在通过该方法寻找PNS调脂药效物质基础。 1.1 药物与试剂

三七总皂苷对照品(批号870-200001)、人参皂苷Rg1对照品(批号110703-200726)人参皂苷Rb1对照品(100704-200318)、人参皂苷Rd对照品(11818-201302)、三七皂苷R1对照品(110745-200617)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇和乙腈均为色谱纯(美国Honeywell公司)；超纯水自制(PURELAB Ultra-GE-MK2纯水仪)。

高糖DMEM培养基购自美国GIBCO公司(批号129007)；血清购自赛默飞世尔；胰酶购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司(批号89010440)；油酸钠(Sodium Oleate)、棕榈酸钠(Sodium Palmitate)购自美国Sigma公司；三酰甘油(TG)试剂盒购自南京建成生物工程有限公司；BCA蛋白测定试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。 1.2 主要仪器

Ultimate 3000 HPLC仪(美国Dionex公司)，配备DAD检测器；KQ-500VDE型双频超声波清洗仪(江苏省昆山超声仪器公司)；BT224s型电子天平(德国Sartorius科学仪器有限公司)；PURELAB Ultra GE MK2纯水仪(ELGA,High Wycombe,UK)；CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；Mithras LB940酶联免疫检测仪(德国Berthold Technologies公司)；5180R低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；SW-CF-1FD超净台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。 2.1 对照品、供试品溶液制备

取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rd对照品、三七皂苷R1对照品适量，精密称定，加DMSO溶解并稀释定容至1.0 mL，摇匀，作为对照品贮备液。

取PNS适量，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，质量浓度为10.0 mg/mL，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，取续滤液作为PNS样品储备液。

2.2 色谱条件

色谱柱Aglient-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水，梯度洗脱(0～35 min，乙腈的体积百分比为29%；70～100 min，乙腈的体积百分比为29%→40%)；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：25 ℃。在此色谱条件下PNS中各成分达到基线分离。 2.3 细胞培养

HepG2细胞培养于高糖DMEM完全培养液中；高糖DMEM完全培养液含有10% FBS、1%的双抗(100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素)。置于5%(φ)CO2的37 ℃细胞孵育箱中培养，每2天换液1次；待细胞生长至约80%，用0.25%胰酶消化细胞，进行传代。

2.4 MTT比色法检测细胞增殖活力

取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，种于96孔板内，于37 ℃、5%CO2条件下培养；24 h后分别设置空白对照组、溶质组、不同浓度(0、5、25、50、100、200、500 μg/mL)PNS，不同浓度(0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL)的人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1，每个组均设6个平行孔进行给药，置37 ℃、5%CO2细胞孵育箱内培养；24 h后取出96孔培养板加入MTT，继续培养4 h后，加入DMSO溶液，低速振摇10 min；采用多功能酶标仪于波长485 nm处测定各孔吸光度A值，计算细胞存活率。 2.5 肝细胞萃取筛选亲和成分

取对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化后，吹打均匀制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×105个/mL，以细胞悬液15×105个/皿接种于培养皿中置37 ℃、5%CO2条件下培养；待细胞生长至70%，PBS液洗涤2遍除去细胞代谢物；分别加入100 μg/mL PNS溶液(用不含血清DMEM配制)8 mL/皿、或不含药的DMEM培养液(不含血清)8 mL/皿，24 h后弃去培养液，用PBS洗涤2遍，胰酶

消化并收集细胞；未结合的成分用5 mL PBS、1 000 r/min离心5 min，重复洗涤3次并留下末次洗涤液，作为供试品溶液，待进行HPLC分析；将细胞转移至1.5 mL EP管中，加2 mL 75%(φ)乙醇吹打均匀，反复冻融破碎细胞，高速离心10 000 r/min(×10 min)，取上清液，氮气吹干，用甲醇0.5 mL复溶，高速离心(10 000r/min×10 min)，取上清液待HPLC分析。 2.6 亲和成分降脂活性验证试验

调整HepG2细胞悬液浓度，以每孔2×105的细胞个数接种于6孔板，正常培养48 h，当细胞达到对数生长期，分组给药：正常对照组给予含10%(φ)FBS的完全培养基、模型组给予0.5 mmol/L FFA 培养基(油酸钠/棕榈酸钠，2∶1，0.5 mmol/L)、含不同浓度PNS(25、50、100、200 μg/mL)的0.5 mmol/L FFA 培养基、含不同浓度人参皂苷Rb1(5、25、50、100 μg/mL)的0.5 mmol/L FFA 培养基、含不同浓度人参皂苷Rg1(5、25、50、100 μg/mL)的0.5 mmol/L FFA 培养基，每组分别做6个平行孔，继续培养。24 h后，吸弃孔内培养液，PBS洗涤1～2遍，胰酶消化制成细胞悬液，将各孔细胞悬液平均分成2份(细胞A和细胞B)，4 ℃PBS洗涤细胞2次，4 ℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞A管加入100 μL异丙醇，细胞B管中加入100 μL PBS，超声波细胞粉碎机裂解细胞，再以4 ℃，13 500 r/min离心10 min，收集上清液，用三酰甘油试剂盒测定细胞A管上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定细胞B中蛋白含量，换算成TG/蛋白含量的比值。 2.7 统计学分析

应用SPSS17.0对分组数据进行统计学分析，实验数据用±s表示。若方差齐，应用One-way ANOVA比较各组间是否有统计学差异，若差异显著，则应用LSD法进行两两比较；方差不齐时，若差异显著，应用Tamhane’s T2法进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3.1 PNS、人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg1对HepG2细胞的存活率影响 结果见表1、表2、表3。PNS、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1分别作用于HepG2细胞24 h后，细胞的存活率随着药物作用浓度的增加而逐渐降低，细胞存活率>80%时对HepG2细胞的毒性较小，根据结果，PNS给药浓度范围确定在0～500 μg/mL，人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的给药浓度范围确定在0～200 μg/mL。

3.2 PNS亲和成分的筛选

采用HPLC法分别分析PNS原液、PNS作用后的HepG2细胞解离液、空白细胞解离液和最后一次洗脱液，在203 nm检测波长处，通过比较PNS作用细胞解离液和PNS原液，发现细胞解离液峰2、峰3两个特征峰，分别在30.2 min和39.5 min处；通过对照品定性，分别为人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1，提示人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1是肝细胞特异性亲和成分，可能通过特异性结合肝细胞膜上受体而引起药理作用；在203 nm检测波长下，空白对照和最后一次洗脱液并无响应，证明方法专属性较好，在最后一次洗涤细胞的洗脱液中已无任何可积分成分，说明已排除非特异性结合成分的影响(图1)。 3.3 亲和皂苷成分降脂活性的验证

为观察PNS对肝细胞脂质沉积的作用，不同浓度的PNS(25、50、100、200 μg/mL)与FFA共同作用于HepG2细胞24 h，采用TG试剂盒测定细胞内TG含量，在25～200 μg/mL浓度范围内，细胞内TG含量随浓度的增加呈剂量依赖性减少，与模型组比较，各组差异均有统计学意义(P<0.05)(表4)；不同浓度的人参皂苷Rb1(5、25、50、100 μg/mL)作用于HepG2细胞24 h，同样测定细胞内TG含量，在5～100 μg/mL浓度范围内，对比模型组，各给药组细胞内TG含量显著降低(P<0.05)(表5)，且呈剂量依赖性；同上，不同浓度人参皂苷Rg1(5、25、50、100 μg/mL)作用于HepG2细胞，测定结果显示人参皂苷Rg1在5～100

μg/mL浓度范围内，与模型组相比，各给药组细胞内TG含量显著降低(P<0.05)(表6)，差异有统计学意义。

细胞亲和色谱法利用活性细胞为分离载体，以复杂体系提取物为研究对象，对提取物中的成分进行萃取，亲和成分鉴定，方法高效，操作简便易行，特异性强。本研究建立的肝细胞亲和-HPLC技术已应用于黄连总生物碱的降脂活性成分筛选[9]。本研究采用该筛选体系，筛选三七总皂苷中肝细胞特异性亲和成分，分别为人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1，且平行3份样品的筛选结果一致，各成分峰面积的RSD<5%，表明所筛选的两种化合物具有特异性。

为了评价人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的降脂效应，采用相同HepG2细胞系，游离脂肪酸(油酸钠/棕榈酸钠，2∶1，0.5 mmol/L)诱导肝细胞脂肪变性[9]，与正常组对比，模型组细胞内TG含量/蛋白高出6倍以上，成功建立体外肝细胞脂肪变性模型，模型稳定。研究报道人参皂苷Rb1能够降低高脂喂养肥胖大鼠的肝脏重量、肝脏内的TG水平和改善肝脏脂滴形成，改善脂肪肝[10]，人参皂苷Rg1能够改善NAFLD大鼠肝脏的脂滴浸润，血脂显著降低[11]。本实验结果表明人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1在体外均能有效降低肝细胞内三酰甘油的蓄积。 总之，本研究通过肝细胞亲和-HPLC法筛选出PNS肝细胞亲和成分，建立了一种快速有效的中药活性成分筛选方法，在体外肝细胞脂肪变性模型上验证了肝细胞亲和成分人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的降脂活性，筛选的结果与活性结果保持一致。为其他中药活性成分筛选提供思路，为三七调脂药物开发提供了证据。

【相关文献】

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