×中国组织工程研究与临床康复彩７４誊 ‘４ ７卿２０１０—１０一Ｏ８出版 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｈａｂ＃ｉｔａｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｍｅｅｎｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｃｔｏｂｅｒ ８－２０１０ Ｖｏ１．１４．Ｎｏ．４１ 锌指转录因子ｓｎａｉｌ高表达质粒构建和稳定株的筛选 周传文，李倩君 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｓｎａｉｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌＩ ｃｌｏｎｅ Ｚｈｏｕ Ｃｈｕａｎ—ｗｅｎ，Ｌｉ Ｑｉａｎ￣ｕｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ：Ｓｔｕｄｉｅｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｃｈａｔ Ｓｎａｆ１ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｈｏｗｎ ｔｏ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ Ｅ—ｃａｄｈｅｒｉｎ ｉｎ ｆｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎｅ ｗｉｔｈ ＣＤＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｂｏｘ ｍｏｔｉｆ，ｌｈｕｓ．ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ＣＤＨ１ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｓｎａｉｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌＩｉｎｅ． ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｅｘｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｎａｉｌ ｉｎ ｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． Ｈｕａｉａｎ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ （ｔｈｅ Ｆｉｒｓｌ Ｐ￣ｐｌｅ’ｓ ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｍｄ一１８Ｔ．ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｍｄ一１８Ｔ／ｓｎａｉ１，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅｃｏｉｌ ＤＨ５ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｏｎｔｃａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｍｄ一１８Ｔ／ｓｎａｉ１ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ＥｃｏＲ Ｊ ａｎｄ Ｘｈｏｌ Ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＥｃｏＲ Ｊ ａｎｄ Ｘｈｏｌ ｗａｓ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ａｎｄ ｊｎｓｅｒｔｅｄ ｊｎｔｏ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｈｕａｉ‘ａｎ）， Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｉａｎ ２２３３００．Ｃｈｉｎａ Ｚｈｏｕ Ｃｈｕａｎ－ｗｅｎ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｃｈｉｅｆ ｐｈｙｓｉｃｉａｎ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｉａｎ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｐ￣ｐｌｅ’ｓ ｖｅｃｔｏｒ ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｔｏ ｏｎｓｔｃｒｕｃｔ ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｓｎａｉ１，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｏｌｃｏｎ ＨＴ．２９ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ＨＴ－２９ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｎａｉｌ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｇ４１ ８ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ． ＲＥＳＵＬ－ＴＳ ＡＮＤ ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ｓｎａｉ１ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ＨＴ－２９ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｓｎａｉｌ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｖ Ｇ４１ ８ ｗｉｔｈ ６００ ｍｇ／Ｌ ａｔ ２１ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕＩ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐｃＤＮＡ３．１ ｒ＋）／ｓｎａｉｌ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｎａｉｌｉｎ ｃｏｌｏｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ ｃｅｌｌｓ ＨＴ一２９． Ｚｈｏｕ ＣＷ，Ｌｉ ＱＪ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｉｆｎｇｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｓｎａｉｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｈｕａｉａｎ）． Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｈｕａｉａｎ ２２３３００。Ｃｈｉｎａ ｚｈｏｕｃｌｏｎｅ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｚｕｚｈｉ Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｙａｎｊｉｕ ｙｕ Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ Ｋａｎｇｆｕ．２０１０；１４（４１）：７６８７—７６９０． 【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｏｎ ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｏｍ１ｃ ｃｗｌ９６７＠ ｓｉｎａ ｃｎ 背景：研究表明Ｓｎａｉｌ和Ｅ一钙黏素在肿瘤组织中有负向表达关系，且与Ｓｎａｉｌ与ＣＤＨ１启动子区ｂｏｘ盒结合，抑制ＣＤＨ１ 基因转录。 摘要 ：； ：：２０１ｏ０＿－０８７－０９３ ’ 目的：构建针对ｓｎａｉｌ的高表达载体，建立稳定转染的细胞株。 方法：根据ＧｅｎＢａｎｋ中ｓｎａｉｌ的基因序列人工合成ｓｎａｉｌ全序列，将合成好的序列装入Ｐｍｄ一１８Ｔ载体并转化感受态细胞 ＤＨ５ｏ，进行阳性克隆筛选。测序验证重组克隆中基因序列正确后，用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ双酶切Ｐｍｄ－１８Ｔ／ｓｎａｉｌ质粒，将 所得的ｓｎａｉｌ全基因片段转入ｐｃＤＮＡ３．１（＋）空质粒，构建ｐｃＤＮＡ（＋）Ｉｓｎａｉｌ真核表达质粒，同时构建阴性对照质粒，并分别 对结肠腺癌细胞ＨＴ－２９进行转染，最后利用Ｇ４１８进行稳定表达株的筛选，并采用ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定宿主细胞 内ｓｎａｉｌ基因的表达情况。 结果与结论：成功构建了真核表达质粒ｐｃＤＮＡ（＋）Ｉｓｎａｉｌ，顺利转染结肠癌细胞ＨＴ－２９后于６００ ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８浓度时筛选 ２１ ｄ得到ｓｎａｉｌ基因稳定表达株，构建的ｓｎａｉｌ基因正义表达质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）／ｓｎａｉｌ转染宿主细胞后可促进ｓｎａｉｌ基因 的表达。 关键词：锌指转录因子ｓｎａｉｌ；表达质粒；感受态细胞；结肠癌；转染 ｄｏｉ：ｌ０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—８２２５．２０１０．４１．０２１ 周传文，李倩君．锌指转录因子ｓｎａｉｌ高表达质粒构建和稳定株的筛选【Ｊ】．中国组织工程研究与临床康复，２０１０ １４（４１）：７６８７・７６９０． 【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｅｒ．ｏｒｇ ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】 南京医科大学附 属淮安第一医院 （淮安市第一人民 医院）消化科，江 苏省淮安市 ２２３３００ 族中的一员，是一种钙依赖性黏附分子，广泛 ０引言 存在于各类上皮细胞中。 已有文献报道，Ｓｎａｉｌ和Ｅ一钙黏素在肿瘤组 织中有负向表达关系，且与Ｓｎａｉｌ与ＣＤＨ１（Ｅ・ 钙黏素编码基因）启动子区ｂｏｘ盒结合，抑制 上皮向间质转化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）是多细胞生物胚胎发生过程 中，以上皮细胞极性丧失及其问质特性的获得 为主要特征的生理过程。 ・ＣＤＨ１基因转录有关【１”，实验拟构建人型Ｓｎａｉｌ 周传丈，男，１９６７ 年生，江苏省淮安 市人，汉族，副主 高表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｓｎａｉｌ，并进行真核表 达稳定株的筛选。 １材料和方法 任医师，主要从事 消化科方面的研 究。 ｚｈｏｕ ｃｗｌ９６７＠ ｓｉｎａ．ｃｎ 。 Ｓｎａｉｌ是锌指蛋白转录因子，可以介导上皮 细胞向间充质细胞的转化，在转录水平上抑制 Ｅ一钙黏素的表达，促进肿瘤细胞的侵袭和复发、 转移。 阁分类号：Ｒ３１８ 盅＝献标识码：Ｂ 文馥编号：１６７３－８２２５ （２０１ｏ）４１－０７６８７－０４ Ｅ一钙黏素是属于钙黏素族典型的钙黏素亚 设计：单一样本观察。 收稿日期：２０１０－０７－０９ 侉回日期：２０１０－０８－０３ （２０１００７０９００１ Ｊ・Ｚ１ ｌｓｓＮ １６７３—８２２５ ｃＮ ２１—１５３９ｆＲ ＣｏＤＥＮ：ｚＬＫＨＡＨ ７６８７ 鞠传文 等 锌指转录因子ｓｎａｉｌ高表达质粒掏建和稳定株的靖选 时间及地点：于２０１０－０２／０６在南京医科大学公共卫 生学院实验室完成。 材料： 条件下恒温摇床培养过夜，取０．８ ｍＬ菌液）ｍ０．２ ｍＬ无菌 甘油，至于一８０℃冻存，取１管冻存菌液送至大连Ｔａｋａｒａ 生物技术公司进行基因测序鉴定 ’ 。 Ｓｎａｉｌ真核表达质粒的构建：选择测序正确含 ＰＭＤ一１ ８Ｔ／ｓｎａｉｌ菌液进行培养扩增，用试剂盒小量提取 质粒，利用紫外分光光度仪检测抽提产物的浓度，按 ＰＭＤ一１ ８Ｔ／ｓｎａｉｌ质粒（１ ５０ ｍｇ／Ｌ）７ ｐＬ，Ｂｕｆｆｅｒ ＥｃｏＲ Ｉ ５ ｕＬ，１ＯＯｘ牛血清白蛋白０．５ ｐＬ，Ｅｃｏ Ｉ １ ｐＬ，Ｘｈｏ Ｉ 载体及细胞：结肠腺癌细胞株ＨＴ－２９购自中国典型培养 物保藏中心【２ ；克隆载体ＰＭＤ．１ ８Ｔ购自Ｔａｋａｒａ公司Ｉｓ６１； 真核表达载体ｐＣＤＮＡ ３．１（＋）［７－８］、大肠杆菌ＤＨ５Ｑ［。 购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。 试剂及仪器： 试剂及仪器 来源 １ ＩＪＬ，ｄｄＨ２Ｏ ３５．５ ＩＪＬ配成５Ｏ ＵＬ酶切体系，在３７℃条 件下酶切２ ｈ。 对酶切产物进行１．２％琼脂糖凝胶电泳，切胶、将 Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ、胶网收试剂盒、两步法 ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒、引物 Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｎｐｒｅｐ Ｋｉｔ Ｉ 大连ｒａｋａｒａ公司 北京ＴＩＡＮＧＥＮ公司 英国Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ 公司 ｐＣＤＮＡ３．１载体按ｐＣＤＮＡ３．１载体（１８０ ｍｇ／Ｌ）６ ＩＪＬ， ＢｕｆｆｅｒＥｃｏＲ Ｉ ５ ｕＬ，１Ｏ０×牛血清白蛋白０．５ ｐＬ，Ｅｃｏ Ｉ １ ｐＬ，Ｘｈｏ Ｉ １ ｐＬ，ｄｄＨ２０ ３６．５ ｐＬ配成５０ Ｌ酶切 质粒提取试剂盒 ＤＮＡ连接酶 体系，在３７℃条件下酶切２ ｈ；对酶切产物进行琼脂糖 凝胶电泳，切胶、回收６ １Ｏ０ ｂｐ左右的大片段线性载体。 将目的基因和ｐＣＤＮＡ３．１载体的酶切产物按目的基 限制性内切酶Ｘｈｏ Ｉ和Ａｐａ Ｉ， ＴＲｌＺＯＬ，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、 美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司 ｏ嘶一ＭＥＭ。低虹清培养基 ＢＣＡ蛋白检测试剂盒 南京ＫｅｙＧｅｎ公司 因（２００ ｍｇ／Ｌ）２ ＩＪＬ、酶切ｐＣＤＮＡ３．１载体（１８０ ｍｇ／Ｌ） ３ ＵＬ、１０ Ｘ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ １ ｐＬ、Ｌｉｇａｓｅ １ ｐＬ、ｄｄＨ２０ 蛋白相对分子质量标记、预染蛋白相对 英国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司 分子质量标记、硝酸纤维膜、ＤＡＢ 显色试剂盒 兔抗人Ｓｎａｉｌ多克隆抗体，鼠抗人 Ｅ一钙黏素单克隆抗体 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、 羊抗鼠ＩｇＧ抗体 ＡＧ ２２３３１紫外分光光度仪 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－２７２０ ＰＣＲ ３ ｕＬ配成１０ ｕＬ反应体系，ＤＮＡ连接酶１６℃作用１ ｈ； 将连接产物送至Ｔａｋａｒａ生物技术公司进行基因测序，分 美国Ａｂｃｏｍ公司 美国Ｊａｃｋｓｏｎ公司 德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司 析克隆序列组成及其阅读框架的正确性。将检测正确的 链接产物命名为ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｎａｉｌ，将其转化感受态细胞 ＤＨ５０，得到含ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｎａｉｌ融合蛋白表达系统的工 程菌。 美国Ａ＆Ｂ公司 美国Ｂｉｏ－Ｆ Ｄ公司 美国ＵＶＰ公司 北京六一仪器厂 扩增仪 Ｐｏｗｅｒ－ｐａｃ ２００ ＰＣＲ电泳仪 取１ ０ ｕＬ工程菌接种于３ ｍＬ含Ａｍｐ抗性的ＬＢ培养基 中，３７℃、２５０ ｒ／ｍｉｎ恒温摇床培养过夜，取０．８ ｍＬ菌液 （对数生长期），加Ｏ．２ ｍＬ无菌甘油，混匀后至于－８０℃冻 存。 ＧＤＳ－８０００ ＰＣＲ成像仪 ＤＹＹ－８Ｃ型电泳仪 按同样方法设计阴性对照组，命名为 方法： ｐＣＤＮＡ３．１／ｍｏｃｋ，经证实其对细胞基因不产生任何调 节作用。 Ｓｎａｉｌ基因扩增：根据ＧｅｎＢａｎｋ中查得的Ｓｎａｉｌ全基因 序列（基因臀录号ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ１５５２３３．１），并由 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物技术公司合成全部外显子编码序列，在 其５’端分别添）Ｊ￣ｌＥｃｏＲＩ和Ｘｈｏｌ限制性酶切位点Ｉ］…。 结肠癌ＨＴ－２９细胞筛选浓度和维持浓度的确定：将结肠 癌细胞ＨＴ－２９按２ｘｌ０５溶于５００ ＩＪＬ １６４０完全培养基（含 体积分数１０％小牛血清，１００ Ｕ，ｍＬ青霉素和１０Ｏ Ｕ／Ｌ链 霉素）接种于２４孔板。 将Ｇ４１８按终浓度为０，１Ｏ０，２００，３００，４００，５００， Ｓｎａｉｌ原核表达载体的构建：分别采用Ｅｃ０ＲＩ和Ｘｈｏｌ进 行双酶切和琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，经Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶在１６℃条件下将Ｓｎａｉｌ基因插入ＰＭＤ一１８Ｔ质粒 ＤＮＡ，连接产物转化感受态细胞ＤＨ５ａ，涂布于含Ａｍｐ 抗性的ＬＢ平板上（含５０ ｇ／Ｌ的氨苄青霉素），３７℃恒温培 养过夜。 ６００，７００，８００，９００，１ ０００ ｍｇ／Ｌ￣Ｈ于２４孔板各空中， 于３７℃，５％ＣＯ２的培养箱中培养１０ ｄ，已导致细胞全 部死亡的最低浓度为基准，筛选时比该浓度高一个级 别，维持浓度为筛选浓度的一半。 预实验证实５００ ｍｇ／Ｌ的Ｇ４１８在培养１０ ｄ时使细 胞全部死亡，则筛选浓度确定为６００ ｍｇ／Ｌ，维持浓度 为３００ ｍｇ／Ｌ。 细胞转染及Ｓｎａｉｌ蛋白稳定表达株的筛选：按 从培养皿上挑选５个单克隆菌落接种于３ ｍＬ含Ａｍｐ 抗性的ＬＢ培养基中，３７℃，２５０ ｒ／ｍｉｎ条件下恒温摇床 培养过夜。用试剂盒小量提取质粒后，用ＥｃｏＲＩ和Ｘｈｏ Ｉ双酶切质粒，酶切产物行１．２％琼脂糖凝胶电泳，鉴定 正确的质粒命名ＰＭＤ一１ ８Ｔ／ｓｎａｉｌ。 将含ＰＭＤ一１８Ｔ／ｓｎａｉｌ的细菌至于３７℃，２５０ ｒ，ｍｉｎ ７６８８ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ¨Ⅵ２０００说明书，转染前１ ｄ，将细胞以 ４×１ ０。，孔接种于２４７Ｌ板，每；ｆＬ￣ｎ５ｏｏ ｐＬ无双抗培养基使 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００４ ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍ 髓传文．等．锌指转录囡子ｓｎａｉｌ离表达质粒构建ｌ郓稳定株的筛选 短 切产物，见图１。 ～ｃ尺…憎 其在转染时融合度达到９０％以上。转染当天按粒 ＤＮＡ（Ｈｇ）：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００＝１：２－１：３接种于每 孔；本实验中针对２４孔板即使用０．８ Ｐｇ ＤＮＡ，２．０ ｐＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ。Ｍ２０００；转染后将２４孔板置于３７℃，全 积分数５％ＣＯ２培养箱中培养６ ｈ，换完全培养基培养至 ２４ ｈ，按１：１０传代接种于新的２４－￣Ｌ板中，同时加筛选 浓度的Ｇ４１８，培养１０ ｄ后，利用套环法及有限稀释法 将存活菌落接种于９６７Ｌ板获得稳转单克隆，同时将完全 培养基中Ｇ４１８浓度改为维持浓度继续培养 Ｊ。 真核表达ＲＴ－ＰＣＲ鉴定：引物由Ｔａｋａｒａ公司设计并合 成： ２ ７００ ｂｐ ７９５ ｂｐ Ｌａｎｅ １：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＭＤ一１ ８Ｔ／ｓｎａｉｌ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｅｃｏｌ ａｎｄ Ｘｈｏｌ；ｌａｎｅ ２ ｍａｒｋｅｒ １００—１２ ０００ ｂｐ Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＰＭＤ一１８Ｔ／ｓｎａｉｌ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ 引物 人源性 Ｓｎａｉ１ 序列 ｆｏｒｗａｒｄ ５＇－ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＣＴ ＧＣＧ一３’． ｒｅｖｅｒｓｅ ５＇－ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＡ ＴＧＧ ＡＧＡ ＧＧＡ ＡＧＡ一３’ 长度（ｂｐ） ８８１ 图１ ＰＭＤ １８Ｔ／ｓｎａｉｌ质粒酶切产物 ｐＣＤＮＡ３．１载体酶切产物，见图２。 ｏｒｗａｒｄ ５＇－ＴＣＣ ＣＡＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＣＣ Ｅ一钙黏 ｆ５００ 素 ＡＧＡ ＡＡ一３’， ｒｅｖｅｒｓｅ ５＇－ＴＧＡ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＡ．３。 ＧＡＰＤＨ ｆｏｒｗａｒｄ ５＇－ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＧＴ ＧＧＡ ＡＧＧ ＡＣＴ ＣＡＴ ＧＡＣ．３‘ ｒｅｖｅｒｓｅ ５ｔ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＡＧＣ ＴＴＣ ＣＣＧ ＴＴＣ ＡＧＣ－３ Ｒ￣ＰＣＲ在ＲＮＡ水平上检测Ｓｎａｉｌ表达情况：利用 ＴＲ亿ＯＬ一步法提取 ￣ＲＮＡ［俘’ ，紫外分光光度仪测总 ＲＮＡ浓度和纯度。 取１ ｐＬ总ＲＮＡ利用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ试剂盒进行反转录、 扩增、检￣ＵＳｎａｉｌ表达情况。扩增条件：预变性９４℃ ５ ｍｉｎ：变性９４℃３０ ｓ，延１＂￣５４℃３０ ｓ，退火７２℃ １ ｍｉｎ，３０循环：复性７２℃３ ｍｉｎ。 Ｗｅｓｔｅｒｎ．Ｂｌｏｔ在蛋白水平检测Ｓｎａｉｌ表达水平：采用 ２．２真核表达ＲＴ－ＰＣＲ鉴定ＨＴ－２９细胞株在稳定转染 ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｎａｉｌ质粒后，Ｓｎａｉｌ转录水平上升；稳定转 染ｐＣＤＮＡ３．１／ｍｏｃｋ组无明显变化，见图３。 ＲＩＰＡ细胞裂解液提取ＨＴ－２９细胞总蛋白。利用１０％ ＳＤＳ．ＰＡＧＥ凝胶电泳１ ｈ ３０ ｍｉｎ，２００ ｍＡ恒流、１ ｈ ３０ ｍｉｎ将蛋白转至硝酸纤维膜上，用含５％脱脂奶粉的 ＴＢＳＴ封闭硝酸纤维素膜１ ｈ，兔抗人Ｓｎａｉｌ多克隆抗体 孵育４℃过夜，ＴＢＳＴ洗脱液洗脱１０ ｍｉｎ／次，４次，ＨＲＰ 标记的羊抗兔ＩｇＧ孵育１ ｈ，ＴＢＳＴ洗脱液洗脱１０ ｍｉｎ￣４ 次：ＤＡＢ显影。 主要观察指标：构建的Ｓｎａｉｌ真核表达质粒及ＨＴ－２９ 细胞株Ｓｎａｉｌ蛋白的表达。 设计、实施、评估者：周传文设计，李倩君实施， 共同评估。 ２结果 Ｈ１－－２９ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｓｎａｉ１．ｏｒ ｗｉｔｈ ｅｍｐｔｙ ｐｌａｓｍｉｄ（ｃｏｎｔｏ１ｒ）． Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＲＴ．ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｎａｉｌ ａｎｄ Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ ＨＴ．２９细胞转染高表达Ｓｎａｉｌ的质粒及阴性对照质粒 后，各筛选出稳定株，并利ｆｆ】ＲＴ．ＰＣＲ检测Ｓｎａｉｌ和Ｅ一 钙黏素表达的变化 ２．１ Ｓｎａｉｌ真核表达质粒ＰＭＤ一１８Ｔ／ｓｎａｉ１质粒的酶 ７６８９ ｌｓｓＮ １６７３—８２２５ ＣＮ ２１．１５３９／Ｒ ＣｏＤＥＮ：ｚＬＫＨＡＨ 死 ｗ ｃＲ砜０ ２．３ Ｓｎａｉｌ蛋白表达ＨＴ－２９细胞株在稳定转染 确嫱文 等．锌撩转录圈子ｓｎａｉｌ高表达睦粒掏建秘稳定株的筛选 明显的反向表达的结果相符。 综上，本实验成功构建了Ｓｎａｉｌ高表达质粒，并稳 定转染结肠癌细胞株ＨＴ－２９，证实了在结肠癌中Ｓｎａｉｌ 与Ｅ一钙黏素之问的负向表达关系。 ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｎａｉｌ质粒后，Ｓｎａｉｌ蛋白表达量上升，Ｅ一 钙黏素表达明显下降，稳定转染ｐＣＤＮＡ３．１／ｍｏｃｋ组无 明显变化，见图４。 ４参考文献 ｏＩｍｅｄａ Ｄ．Ｊｏｒｄ Ｍ，Ｐｅｉｎａｄｏ Ｈ。ｅｔ ａ１．ＳｎａｉＩ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００７； ２６（１ ３１：１ ８６２—１ ８７４． Ｆｅｎｇ ＹＨ．Ｔｓａｏ ＣＪ．Ｗｕ ＣＬ ｅｔ ａ１．Ｓｐｒｏｕｔｙ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｐｉｄｅｒｍａＩ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＣａｎＧｅｒ Ｓｃｉ．２０１ ０．ｆＩｎ ｐｒｅｓｓ１ Ｌｉｕ Ｑ．Ｔｏｎｇ Ｓｚｅ ＳＣ，ｅｔ ａＩ．＂ｌｉａｎ Ｘｉａｎ Ｌｉｑｕｉｄ（ＴＸＬ）ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨＴ－２９ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ＧｅｌＩ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ．２０１０；５ｆ１）：２５． Ｄｏｌｅｍａｎ ＪＦ，Ｅａｄｙ ＪＪ，Ｅｌｌｉｏｔｔ ＲＭ．ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｐｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ａｓ ａ ｎｏｖｅＩ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ＥＰＡ）ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ（ＨＴ－２９）．Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂ（Ｌｏｎｄ）．２０１ ０；７：５６． Ｑｉａｏ Ｘ，Ｗａｎｇ ＬＨ．Ｌｉ ＲＳ，ｅｔ ａ１．Ｓｈａｎｘｉ Ｙｉｋｅ Ｄａｕｘｅ Ｘｕｅｂａｏ． ２００７；３８（１ ０）：８９９．９０１． 乔嗝，．Ｅ利毕，李荣“Ｊ，等．肾』 腺髓质素真核表达质粒的构建及其 ： 火鼠近端肾小管Ｉ：皮细胞中的农达【Ｊ】．１ＩＩ两医科人学学报，２００７， ３８（１０）：８９９—９０１． ¨ 【６】 Ｚｈａｎｇ Ｈ．Ｙａｎｇ Ｌ，Ｇｕｏ Ｊ。ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｏｎｅ ｎｏｖｅｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ—ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒ ｄｕｐｌｅｘ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｏｕｎｄｕｐ ｒｅａｄｙ ｓｏｙｂｅａｎ Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２００８；５６（１４１： ５５１４—５５２０． Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｌｕｏ Ｗ。Ｚｈｅｎｇ Ｌ．ｅｔ ａｌ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＦＧＦＲ１ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉａｔｃｉｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ．２０１ ０；６４ｆ１）：６０－６７． Ｊａｌｉｌｉａｎ Ｂ，Ｏｍａｒ ＡＲ，Ｂｅｊｏ ＭＨ．ｅｔ ａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｉｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ｈ５ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ＭＤＰ．１ ｇｅｎｅ ｏｆ ３讨论 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ａｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｄｊｕｖａｎｔ Ｇｅｎｅｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｔｈｅｒ． ２０１ ０；８：４ Ｎａｋａｇａｍｉ Ｇ．Ｓａｎａｄａ Ｈ，Ｓｕｇａｍａ Ｊ，ｅｔ ａＩ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｗｏｕｎｄ：ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａＩ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｅ一钙黏素是钙黏素糖蛋白家族中的主要成员，起细 胞骨架作用，被认为是肿瘤细胞发生局部侵袭、远处转 Ｒｅｇｅｎ．２００８；１ ６（１ １：３０—３６． ｌｏｕｌ Ｓ。ＥＩｓｔｒａｎｄ ＭＢ．Ｎｅｓｌａｎｄ ＪＭ，ｅｔ ａ１．Ｓｎａｉｌ，Ｓｌｕｇ，ａｎｄ 【１０】 ＥＩＳｍａｄ—ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｓ ｎｏｖｅＩ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ａｇｇｒｅｓｓｉＶｅｎｅｓｓ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｏｖａｒｉａｎ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． 移和血管浸润的抑制因子Ｉ“。研究显示，Ｓｎａｉｌ可以在上 皮性肿瘤的进展中直接抑制Ｅ一钙黏素的表达Ｉ侣 ，因而 促进转移的发生。本次试验表明，细胞株ＨＴ－２９细胞中 存在Ｅ一钙黏素ｍＲＮＡ的表达，为检测到Ｓｎａｉ１ ｍＲＮＡ 的表达，在转染Ｓｎａｉｌ高表达质粒ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｎａｉｌ后， 可检测到Ｓｎａｉｌ表达，而Ｅ一钙黏素表达下降。说明在 ［１３】 ＣａｎＧｅｒ．２００５；１Ｏ３（８）：１６３１—１６４３． ｙｏｈａｒａ ＹＢ。Ｎｉｓｈｉｉ Ｋ。Ｕｋａｉ—Ｔａｄｅｎｕｍａ Ｍ。ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ［１１】 Ｋｉｃｉｒｃａｄｉａｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｍＤｂｐ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｖｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８；３６（４）： ｅ２３． 【１２】 Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｓ，Ｋｕｍａｒ Ｊ。Ａｐｔｅ．Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａ ｎｏｖｅＩ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｍｅｃｔｏｒ ｏｒ ｆｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ： ｄｉｒｅｃｔ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｅ ｃｏｆｔ．Ｍｉｃｒｏｂ ＣｅｌＩ Ｆａｃｔ．２０１０：９：３０ Ｓｐａｄｉｕｔ Ｏ．Ｐｏｓｃｈ Ｇ，Ｌｕｄｗｉｇ Ｒ．ｅｔ ａ１ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒａｎｏｓｅ ２一ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｉｎ Ｅ．ｃｏｉｌ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｄ． ２０１０：９：１４． ＨＴ－２９细胞中存在Ｓｎａｉｌ ｍＲＮＡ与Ｅ一钙黏素ｍＲＮＡ负 向表达关系。为进一步证实这种负向表达关系的存在及 肿瘤细胞中Ｓｎａｉｌ的表达对肿瘤细胞间质标志物表达的 调节以及肿瘤细胞体外侵袭力的改变的影响，选择有Ｅ一 钙黏素表达，而无Ｓｎａｉｌ表达的结肠癌细胞株ＨＴ＿２９稳定 转染Ｓｎａｉｌ高表达质粒ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｎａｉｌ及阴性对照 Ｊｉｎ Ｄ Ｌｉ ＭＦ Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ．１９９５：８９１． 金冬雁，黎孟枫．分ｆ克隆实验指南［Ｍ】．２版．北京：科学出版社．１９９５： ８９１． Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｑ Ｉｊｚｅｒ Ｊ，Ｂｒｉｎｋｈｏｆ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｎｄ ｓｔｏｒｅ ｌｉｖｅｒ ｂｉｏｐｓｉｅｓ ｏｒ ｆｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａＩ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｏｍｐ Ｈｅｐａｔｏ１．２００９；８：３． Ｐｉｎｔｏ ＦＬ，Ｔｈａｐｐｅｒ Ａ，Ｓｏｎｔｈｅｉｍ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｈｅｎｏＩ ｂａｓｅｄ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈＯｄＯｌＯａｊｅｓ ｆ０ｒ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００９；１０：７９． Ｇｌｅｎｎ Ｓ Ｈｅａｄ ＫＬ １－ｅｈ Ｂ ｅｔ ａＩ．Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ＲＮＡ ｙｉｅｌｄ ｆｒ０ｍ ａｒｃｈｉｖａｌ ｒｅｎａｌ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ ｐＣＤＮＡ３．１／ｍｏｃｋ。结果发现，随着Ｓｎａｉｌ ｍＲＮＡ表达的 同时，Ｅ一钙黏素表达下降，在稳定转染细胞株中，Ｅ一 钙黏素表达显著下降。与Ｃａｎｏ ｚｕＪ的研究首次证明， Ｓｎａｉｌ可以直接结合Ｅ一钙黏素ＣＤＨ１启动子，下调Ｅ一钙 黏素的表达，通过降低细胞间的黏附，破坏正常组织形 态，促进肿瘤侵袭及临床研究表明，Ｓｎａｉｌ和Ｅ一钙黏素 在很多上皮性癌（包括鳞癌、肝癌、黑色素瘤等）中存在 ＢｉｏｍｏＩ Ｓｃｒｅｅｎ．２０１０：１５ｆ１）：８０—８５． Ｐｅｉｎａｄｏ Ｈ，ＯＩｍｅｄａ Ｄ，Ｃａｎｏ Ａ．Ｓｎａｉｌ，Ｚｅｂ ａｎｄ ｂＨＬＨ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：ａｎ ａｌｌｉａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ？ Ｎａｔ Ｒｅｖ ＣａｎＧｅｒ．２００７；７（６）：４１ ５－４２８． Ｈｏｕ Ｚ．Ｐｅｎｇ Ｈ，Ｗｈｉｔｅ ＤＥ，ｅｔ ａＩ．１ ４．３—３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｌｎ ｔｈｅ ｓｎａｉＩ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｓｎａｉｌ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａＩ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ—ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａＩ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＣａｎＧｅｒ Ｒｅｓ．２０１０： ７０（１ １ １：４３８５－４３９３． Ｃａｎｏ Ａ，Ｐ６ｒｅｚ—Ｍｏｒｅｎｏ ＭＡ，Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｉ，ｅｔ ａｌ Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｓｎａｉｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｂｙ ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ Ｇｅｌ Ｂｉｏ１．２０００；２（２）：７６—８３ ７６９０ 尸Ｏ．Ｂｏｘ １２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００４ ｃｎ ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍ
