一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104862303 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.08.26

(21)申请号 2015102808.4(22)申请日 2015.05.30

(71)申请人福建出入境检验检疫局检验检疫技

术中心

地址350001 福建省福州市湖东路312号国

检广场(72)发明人陈文炳 翁国柱 邵碧英 缪婷玉

江树勋 彭娟(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限

公司 35100

代理人蔡学俊(51)Int.Cl.

C12N 15/10(2006.01)

权利要求书1页 说明书3页序列表1页 附图1页

()发明名称

一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法(57)摘要

本发明涉及一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，所述方法为：1）合成引物对；2）河豚鱼DNA样品中加入CTAB裂解缓冲液，在功率100%的超声波清洗器中65℃恒温温浴处理，处理时间为5-25 min，各处理重复3次；3）将获得DNA样品用于PCR扩增，通过PCR产物电泳图谱，鉴定处理的DNA提取结果。本发明以河豚鱼肉为实验材料，对影响河豚鱼特异物种成分检测的主要前处理因素，DNA提取过程中的CTAB裂解缓冲液在65℃恒温常规温育与超声波温育处理效果进行分析，以期筛选出优化的前处理措施，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，为建立河豚鱼物种鉴别的快速检测方法提供依据。 C N 1 0 4 8 6 2 3 0 3 A CN 104862303 A

权 利 要 求 书

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1.一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，其特征在于：所述方法步骤包括如下：

1）合成引物对；2）河豚鱼DNA样品中加入CTAB裂解缓冲液，在功率100%的超声波清洗器中65 ℃恒温温浴处理，处理时间为5 -25 min，各处理重复3次；

3）将获得DNA样品用于PCR扩增，通过PCR产物电泳图谱，鉴定处理的DNA提取结果。2.根据权利要求2所述的一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，其特征在于：所述引物对为HT-1F：5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3'；HT-1R：5'-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3'。

3.根据权利要求2所述的一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，其特征在于：步骤2）具体为：称取100 mg样品于2.0 mL离心管中，加入600 μL 2 % CTAB溶液和蛋白酶K 15 μL，在超声波清洗器中温育处理5 -25 min及在水浴锅中65℃常规温浴过夜处理；在离心管中加入600 μL三氯甲烷，13400 r·min-1条件下离心15 min，取上清，加入2倍体积的0.5 % CTAB溶液，颠倒混匀，室温静置约1.5 h；在13400 r·min-1条件下离心25 min，取沉淀，加入400 μL NaCl 溶液，沉淀溶解完全后，加入15 μL Rnase 酶37 ℃条件下温浴约1.5 h；加入等体积的三氯甲烷、饱和酚、异戊醇混合液，颠倒数次充分混合后，在13400 r·min-1条件下离心15 min，重复此操作三次；取上清，加入0.8倍异丙醇和1/10体积的NaAc溶液，涡旋30 s，充分混合后，在13400 r·min-1下离心15 min；取沉淀，加入400 μL 70 % 乙醇，上下颠倒使沉淀悬于溶液中，在13400 r·min-1条件下离心洗涤沉淀10 min；经DNA浓缩仪干燥10 min，加pH 8.0、100 μL TE 在65 ℃条件下溶解15 min，放入4 ℃冰箱保存待用。

4.根据权利要求3所述的一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，其特征在于：所述的三氯甲烷：饱和酚：异戊醇体积比为25：24：1。

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说 明 书

一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法

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技术领域

[0001]

本发明涉及一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法。

背景技术

动植物材料样品通常采用细胞裂解缓冲液（CTAB、GuSCN或SDS）在65 ℃恒温下振荡温育，进行样品前处理，继而提取DNA，但要想提取的DNA产量高质量好，必须对动植物材料样品在裂解缓冲液温育浸泡较长时间，充分反应，比较费时，通常需要过夜，达不到快速的目的。超声波处理能改善对生物DNA提取效果，提高产量与纯度，但在超声波环境中以CTAB裂解缓冲液65℃温育提取河豚鱼DNA，迄今未见报道。[0003] 为提高DNA提取效率，在保证检测结果准确的前提下，缩短DNA提取时间，本发明以河豚鱼肉为实验材料，对影响河豚鱼特异物种成分（Cyt B基因）检测的主要前处理因素，DNA提取过程中的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide)裂解缓冲液在65 ℃恒温常规温育与超声波温育处理效果进行比较分析，以期筛选出优化的前处理措施，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，为建立河豚鱼物种鉴别的快速检测方法提供依据。

[0002]

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，发明基于超

声波技术的应用，建立一种应用超声波处理的河豚鱼DNA提取方法。[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，所述方法步骤包括如下：1）合成引物对；所述引物对为HT-1F：5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3'；HT-1R：5'-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3'。[0006] 2）河豚鱼DNA样品中加入CTAB裂解缓冲液，在功率100%的超声波清洗器中65 ℃恒温温浴处理，处理时间为5 -25 min，各处理重复3次；

3）将获得DNA样品用于PCR扩增，通过PCR产物电泳图谱，鉴定处理的DNA提取结果。[0007] 步骤2）具体为：称取100 mg样品于2.0 mL离心管中，加入600 μL 2 % CTAB溶液和蛋白酶K 15 μL，在超声波清洗器中温育处理5 -25 min及在水浴锅中65℃常规温浴过夜处理；在离心管中加入600 μL三氯甲烷，13400 r·min-1条件下离心15 min，取上清，加入2倍体积的0.5 % CTAB溶液，颠倒混匀，室温静置约1.5 h；在13400 r·min-1条件下离心25 min，取沉淀，加入400 μL NaCl 溶液，沉淀溶解完全后，加入15 μL Rnase 酶37 ℃条件下温浴约1.5 h；加入等体积的三氯甲烷、饱和酚、异戊醇混合液，颠倒数次充分混合后，在13400 r·min-1条件下离心15 min，重复此操作三次；取上清，加入0.8倍异丙醇和1/10体积的NaAc溶液，涡旋30 s，充分混合后，在13400 r·min-1下离心15 min；取沉淀，

[0004]

加入400 μL 70 % 乙醇，上下颠倒使沉淀悬于溶液中，在13400 r·min-1条件下离心洗涤沉淀10 min；经DNA浓缩仪干燥10 min，加pH 8.0、100 μL TE 在65 ℃条件下溶解15

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说 明 书

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min，放入4 ℃冰箱保存待用。[0008] 所述的三氯甲烷：饱和酚：异戊醇体积比为25：24：1。[0009] 本发明设计5个时间段的超声波处理与常规温育过夜（8小时）处理。其中5个超声波处理时间依次为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，均为65 ℃恒温温浴处理，个处理重复3次。数控超声波清洗器（KQ-500DE型，500 W、40KHZ）使用功率为100%。选择在超声波清洗器中温育处理5 min，建立了省时高效的超声波处理DNA提取方法。[0010] 本发明的优点在于： 传统的DNA提取过程中的样品CTAB裂解液65 ℃恒温常规温浴处理时间在1-8小时，本方法利用超声波处理65 ℃温育只需5 min，节省时间，大幅度提高DNA提取效率，进而达到快速检测的目的。附图说明

图1不同超声波处理时间提取的河豚鱼DNA电泳结果比较。1-5：超声波处理时间依次为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min；6：经65 ℃常规温浴过夜处理，M：DNA-Marker。

[0012] 图2 6种处理提取的DNA河豚鱼特异物种成分（Cyt B基因）PCR产物电泳图。1-5：超声波处理时间依次为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min；6：经65 ℃常规温浴过夜处理；7：非河豚鱼阴性对照；8：空白（纯水）对照；9：DNA-Marker。

[0011]

具体实施方式

[0013] 试剂来源与超声波清洗器：10 × Taqbuffer 与Taq酶、dNTPs购自上海生工有限公司。数控超声波清洗器（KQ-500DE型，500 W、40KHZ）购自昆山市超声仪器有限公司。[0014] 引物合成

由上海生工生物工程有限公司合成河豚鱼成分检测引物（HT-1），引物碱基序列、PCR产物片段长度与适合的退火温度（Tm值）见下表。

[0015] 河豚鱼成分的PCR检测用的引物序列与退火温度

3. 提取DNA方法与PCR验证DNA提取过程中，样品中加入CTAB裂解缓冲液，在超声波清洗器（功率100%）中65 ℃恒温温浴处理，处理时间依次为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min共 5个处理，各处理重复3次，另设在水浴锅中65℃常规温浴过夜处理作为对照。[0016] 具体步骤为：称取100 mg样品于2.0 mL离心管中，加入600 μL 2 % CTAB溶液和蛋白酶K 15 μL，在超声波清洗器中温育处理5 min、10 min、15 min、20 min、25 min及在水浴锅中65℃常规温浴过夜处理；各处理（离心管）加入600 μL三氯甲烷，13400 r·min-1

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说 明 书

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条件下离心15 min，取上清，加入2倍体积的0.5 % CTAB溶液，颠倒混匀，室温静置约1.5 h；在13400 r·min-1条件下离心25 min，取沉淀，加入约400 μL NaCl 溶液，沉淀溶解完全后，加入15 μL Rnase 酶37 ℃条件下温浴约1.5 h；加入等体积的 三氯甲烷：饱和酚：异戊醇（25：24：1），颠倒数次充分混合后，在13400 r·min-1条件下离心15 min，重复此操作三次；取上清，加入0.8倍异丙醇和1/10体积的NaAc溶液，涡旋30 s，充分混合后，在13400 r·min-1下离心15 min；取沉淀，加入400 μL 70 % 乙醇，上下颠倒使沉淀悬于溶液中，在13400 r·min-1条件下离心洗涤沉淀10 min；经DNA浓缩仪干燥10 min，加100 μL TE (pH 8.0) 在65 ℃条件下溶解15 min，放入4 ℃冰箱保存待用。各处理重复3次。[0017] DNA样品用于PCR扩增，反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上下游引物（10 μM）各0.8 μL，DNA模板量250 ng，H2O为7.2 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s， ℃退火30 s，72 ℃延伸 30s，反应循环40次，最后72 ℃延伸5 min。通过PCR产物电泳图谱，比较各种处理的DNA提取效果。[0018] 结果分析

试验结果（表1和图1）表明：经65℃常规温浴过夜处理和经超声波各时间段处理（使用功率为100%）后提取到的DNA纯度差异不大，均在1.7～1.9之间，均符合PCR检验要求（最佳为1.8）。超声波处理后提取到的DNA浓度都略高于常规温浴过夜处理的，经超声波处理后提取到的DNA的浓度随着处理时间的延长增加趋势不明显，因此，从工作效率考虑，选择超声波处理5 min，建立应用超声波处理的DNA提取方法。[0019] 图2表明，5个超声波温育处理与常规过夜温育处理获得的DNA，其PCR反应产物没有差异，均能正常扩增出河豚鱼成物种特异成分（Cyt B基因）的PCR产物。[0020] 表1 不同超声波处理时间提取的DNA的浓度和OD 260/280值

根据省时高效的原则，选择在超声波清洗器中温育5 min的处理，建立了超声波处理DNA提取方法。

[0021] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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序 列 表

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<110> 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120> 一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法<130> 2<160> 2

<170> PatentIn version 3.3<210> 1

<211> 25<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcctcaact acaagaacct aatgg 25

<210> 2<211> 20<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggaaggaca tagcccacga 20

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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