第十章 微生物与基因工程
一、要点提示
1．基因工程，又称基因操作或重组DNA技术，是体外对DNA分子进行加工、剪切、操作及施工，把不同来源的DNA分子重新组合构建载体后，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，获得大量基因产物，或者使生物体表现出新的形状。基因工程是在分子生物学、微生物学基础上结合有关现代科学和工程学原理和方法而开拓的技术领域。它的出现改变了生物科学的面貌，促使现代生物技术迅猛发展，并带动了现代生物技术产业的兴起。
2．基因工程的基本过程是目的基因的获得→重组载体的构建→重组载体导入宿主细胞→阳性重组子的筛选→基因的测序和鉴定→基因的控制表达。基因工程的每一个环节都离不开微生物的参与。
3．基因工程给人类带来的正面影响是十分巨大的，基因工程产品及其技术在医学、工业、农业及其他领域的应用愈来愈广泛，并已经带来了令人可喜的结果。但是基因工程潜在的危害性也不容忽视，任何滥用和非和平的开发(生物战争)都会给人类带来毁灭性的灾难。
二、重点、难点剖析
1．微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。从以下6个方面可以说明。 (1)微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；目的基因的获得可以是通过构建基因文库或cDNA文库来筛选目的基因片段；或通过PCR技术进行基因的体外扩增，包括对活的不可培养微生物基因的体外扩增，并对基因进行定点诱变和分子定向进化。
(2)基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成。
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(3)基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的。 (4)微生物细胞是基因克隆的宿主，基因工程中最重要、最广泛应用的克隆载体宿主是原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母。即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中。
(5)大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导人大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，构建成工程菌，然后利用微生物发酵工程来实现。
(6)有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此，微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。 2．微生物与基因克隆载体。 (1)克隆载体的基本要求。
①载体在细胞中必须能够独立自主地复制。
②载体必须具有若干限制酶的单一切割位点，即多克隆位点，位于载体复制的非必需区，便于外源DNA的插入。
③载体必须具有可供选择的遗传标记，例如：具有抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。
④载体DNA须易于生长和操作。
(2)基因工程中使用的载体。到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括6大类：质粒载体，λ噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，真核细胞的克隆载体，人工染色体等。原核生物大肠杆菌的克隆载体比较见表10-1。
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真核生物的克隆载体主要是酵母质粒载体(穿梭载体)、真核生物病毒载体和人工染色体。酵母质粒载体都是利用其2μm质粒与细菌质粒pBR322构建而成的，主要有附加体质粒(较高拷贝数)、复制质粒(中等拷贝数)和整合质粒(整合到酵母染色体上)3种。人工染色体是一类目前能容纳最大外源DNA片段(1 000 kb)人工构建的载体，目前有酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)。 3．微生物与基因工程操作基本的工具酶。如基因与载体的切割和连接要用各种限制性内切酶和T4连接酶，DNA的体外合成、测序要用Taq酶、pfuDNA高保真聚合酶，RNA反转录要用反转录酶等。必须提出的是，基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的。表10-2列出了部分常用限制性内切酶及其微生物来源。限制性内切酶的命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。
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4．克隆载体宿主是外源基因能够在细胞中大量扩增和表达的基本条件。目前有大量的改造后的大肠杆菌和酿酒酵母菌株可以作为基因克隆宿主。 理想宿主的基本要求是： ①能够高效吸收外源DNA。
②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统。
③不具有限制修饰系统，不降解导入的未经修饰的外源DNA。
④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型(RecA-)菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组。 ⑤便于进行基因操作和筛选。
⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。 5．外源DNA导入宿主细胞。不同的宿主细胞，外源DNA导入的方式不同。 (1)外源DNA导入原核细胞。
转化：重组质粒载体+感受态细胞，效率较低；
转染：重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒+感受态细胞，效率较低； 感染：外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒+宿主细胞，效率高。
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(2)外源DNA导入真核细胞。
①酵母细胞。一般利用蜗牛酶除去酵母细胞壁形成原生质体，再用CaCl2和聚乙二醇处理，重组DNA以转化方式导入酵母细胞的原生质体，最后将转化后的原生质体置于再生培养基的平板中培养，使原生质体再生出细胞壁形成完整酵母细胞。或者采用电转化法(电穿孔法)。电穿孔(electroporation)法是把宿主细胞与外源DNA混合并置于电击槽中。在高压电脉冲作用下，使细胞膜瞬时击穿出现微孔，外源DNA通过微孔进入细胞。
②哺乳动物细胞。最简便的是微量注射法和电转化法。由于有些动物细胞体积较大，如受精卵用微量注射器可将外源DNA注入细胞内。电穿孔法十分成功用于哺乳动物细胞和植物细胞，而且也可用于通常不能进行转化的细菌。大肠杆菌应用电穿孔法也可提高转化率。
③植物细胞。最简便的是微量注射法及电穿孔法。还有两种方法，一种是将含有重组Ti质粒的土壤农杆菌与植物原生质体共培养(即共培养法)或与植物叶片共培养(即叶片培养法)，多数双子叶植物转化常用此法；另一种是基因枪法或称微弹枪(particle guan)法，利用微弹把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速射进植物的细胞或组织，可直接将外源基因导入幼苗，此法简便、有效。 6．重组体的筛选与鉴定。 (1)重组体表型特征的鉴定。
①抗生素平板法。如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，则重组体细胞具有抗性。此外，还有一些自身环化的载体和未被酶解的载体，他们的转化细胞也能在含该抗生素平板上生长并形成菌落，而只有作为对照的受体细胞不能生长。此法缺点是假阳性率高。
②插入失活法。外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因或酶基因之内，则重组体细胞失去抗性或失去酶的活性。
③插入表达法。在某些载体的标记基因(如抗生素抗性)前面连接一段负控制
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序列，当外源DNA片段插入该负控制序列中，使负控制序列失活，因而位于下游的抗性基因因解除阻遏而得到表达，重组体细胞具有抗性。
④β-半乳糖苷酶显色反应法。利用α-互补作用，若将外源DNA插入到载体上lacZ'序列中，使α-肽基因失活，重组体细胞失去α-互补作用，培养在含有χ-gal-IPTG平板上，菌落无色。 (2)重组DNA分子结构特征的鉴定。
①菌落(或噬菌斑)原位杂交。用硝酸纤维滤膜或尼龙膜转印菌落或噬菌斑后培养，滤膜上长出的菌落或噬菌斑释放DNA后，变性固定，与核酸探针进行分子杂交，筛选阳性克隆。通常影印的滤膜必须有双份，在一张滤膜上找到阳性克隆后，可在另一张滤膜的相应位置上找到活的细菌或噬菌体克隆。此法优点可在短时间内从成千上万克隆中快速筛选到阳性克隆。
②内切酶图谱鉴定。将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1～2种内切酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段的大小。
③PCR鉴定。通过与插入片段两侧互补的引物，以重组质粒DNA作为模板进行PCR分析，可快速测出插入DNA片段大小及鉴定其序列特异性。 ④DNA序列测定。最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。
(3)外源基因表达产物的鉴定。
①表达产物免疫活性测定。如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，可用抗原一抗体的免疫反应快速检测转移到滤膜上的克隆。
②表达产物生物活性检查。可根据表达产物不同情况采用不同方法检测其生物活性。若表达产物是一种酶，则可测定其酶活性；若所表达蛋白质是一种酶的抑制剂，则可测定其抑制酶活性能力的大小等。
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③表达产物氨基酸序列测定。测定表达产物“N”端氨基酸序列，对表达产物的鉴定具有特别重要意义。
7．基因工程的应用及展望。基因工程开始并已经进入人类生活活动的各个领域，并即将使人们的某些梦想和希望变为现实。
(1)基因工程药物。基因工程药物包括一些在生物体内含量甚微但却具有重要生理功能的蛋白质，如激素、酶和抑制剂、细胞因子、抗原和抗体、反义核酸和疫苗等。此外，还可利用重组DNA技术改造蛋白质，设计和生产出自然界不存在的新型蛋白质药物。目前基因工程药物在多种生物体细胞中得到重组表达：大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是采用重组细胞通过微生物发酵罐的方式大量生产药物蛋白。转基因动物和转基因植物，则以活的动、植物整体代替发酵罐生产活性肽。
(2)基因治疗。向靶细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗的目的。如用正常基因去弥补有缺陷的基因可以治疗遗传性疾病；通过转移基因以刺激免疫力用于肿瘤和艾滋病的治疗；用转移基因配合细胞或药物治疗，以增强特异性或增强疗效等。
(3)改造传统工业发酵菌种。对人类做出巨大贡献的抗生素、氨基酸、有机酸、酶制剂及维生素等传统发酵工业菌种都经过了长期的筛选和诱变育种，菌种的生产性能很难会大幅度的提高。基因工程技术为该领域打开了一个新的局面，并已经取得了成功。
(4)动植物特性的基因工程改良。近年来，除了可用转基因植物生产药物(如人的干扰素)、抗体、疫苗等，将重组DNA导入植物细胞，成功培育了许多具有新的优良性状的转基因植物。主要包括抗病虫害、抗逆(抗盐、碱等)、耐除草剂、延长水果蔬菜的贮存期等。将重组DNA导入受精卵，开辟了动物育种新途径。转基因的瘦肉型猪、高产奶的奶牛、快速生长的家畜和鱼类等已进入实用阶段。 (5)基因工程菌在环境保护中的应用。微生物在自然界中的分布具有超乎想象的多样性，几乎所有的自然界和人工合成物质都可以为不同种类的微生物所分
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解，其降解基因也表现出多样性来，为生物修复污染环境提供了大量的基因资源。通过把多种降解基因“合并”在同一种微生物细胞中，在污染物治理方面潜力巨大。
微生物产生的各种抑制其他生物生长的活性物质，可以用来防治植物病害、防霉变等。新型基因工程杀虫剂可以同时具备杀死两种以上害虫的效果。 (6)基因工程推动了微生物学的发展。这里重点强调的是微生物资源的开发。目前已经发现并研究的所有生物体中，从比例上来看，微生物物种的发现和确定是最小的。已发现并研究的细菌和真菌种类目前少于8万种，远远低于人们的估计。活的不可培养微生物(viable but nonculturable microorganisms)被证明在自然界环境中普遍存在。通过从环境中直接分离、克隆rRNA并分析其序列及其在分子进化树上的位置等方法，发现了大量的目前尚不能在人工条件下获得培养的微生物。直接从环境样品中获得有用的基因，不考虑微生物的分离培养，利用重组技术生产不可培养微生物的代谢产物或新酶蛋白正在成为国内外科学家研究的热点。
基因工程技术及其相关的应用领域中，微生物和微生物工程(发酵工程)都是必不可少的。
三、术语或名词
1．基因工程(gene engineering) 或重组DNA技术(recombinant DNA technology)是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。
2．基因文库(genomic library) 是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息(即全部DNA序列)。一般适用于原核微生物基因的分离。
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3．cDNA文库(cDNA fibrary) 是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。一般适用于真核微生物基因的分离。
4．多克隆位点(multiple cloning site) 是克隆载体上一个带有不同限制酶单一识别位点的短的DNA片段，外源基因可随意插入任何一个切点。多克隆位点常位于一个基因的编码区之中，因此，基因的插入失活极易被检测到。 5．穿梭质粒载体(shuttle plasmid vector) 是一类同时含有两种细胞的复制起点(特别是同时含有原核生物与真核生物的复制起点)，能在两种生物细胞中进行复制的质粒载体。
6．附加体质粒(episomal plasmid) 酵母穿梭质粒载体的一种，载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Ampr)。此外还有来自酵母2 μm质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因(尿嘧啶核苷酸合成酶基因3)，这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。
7．复制质粒(replicating plasmid) 酵母穿梭质粒载体的一种，质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)。还有来自酵母染色体的自主复制序列(ARS)，以及作为酵母选择标记的URA3基因和TRP1基因(色氨酸合成酶基因1)，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。 8．整合质粒(integrating plasmid) 酵母穿梭质粒载体的一种，质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、四环素抗性基因(Tetr)。以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
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9．人工染色体(artificial chromosome) 是利用已知染色体结构和功能的必须组分，人工构建的小于天然染色体但能在宿主细胞中像正常染色体一样复制、分离和传递的DNA结构。酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)，是由酵母染色体端粒、着丝粒、自主复制序列以及选择标记基因(如TRP1和URA3等)构成的线状DNA。是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。细菌人工染色体(bacteria artificial chromosome，BAC)，是以F因子为基础的载体，容纳的插入片段可达300 kb。由于是低拷贝质粒，克隆DNA较稳定，没有酵母人工染色体的嵌合现象。易通过电击转移到大肠杆菌中。
10．限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 或简称为限制性酶(restrition enzyme)，是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。
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