游泳及丙酮酸钙补充对大鼠瘦素和瘦素受体水平的影响_郭英杰

JournalofWuhanInstituteofPhysicalEducationVol.43No.8Aug.2009

游泳及丙酮酸钙补充对大鼠瘦素和瘦素受体水平的影响

郭英杰,王安利,丁 华

1

2

1

(1.沈阳体育学院运动医学教研室,辽宁沈阳110102:2.北京体育大学运动人体科学学院,北京100084)

摘 要:研究目的:以游泳大鼠为研究对象,通过检测其补充丙酮酸过程中身体成份、瘦素和瘦素受体基因表达的变化,探讨丙酮酸补充对游泳大鼠脂肪代谢的影响及机理。研究方法:选取38只健康成年雄性Wistar大鼠,随机分为安慰剂对照组、运动对照组、补充丙酮酸对照组和补充丙酮酸运动组。采用竞争放射免疫分析法测定大鼠血清瘦素和脑脊液瘦素水平;PCR法测定下丘脑瘦素受体基因表达量。研究结果:4周丙酮酸补充可明显减缓游泳大鼠体重和体脂增长速度,明显升高大鼠和游泳大鼠脑脊液瘦素水平及下丘脑瘦素受体mRNA表达水平。研究结论:丙酮酸补充可在一定程度上减慢游泳大鼠体重和体脂的增长速度,加快其能量代谢速度;并可能通过对游泳大鼠体内瘦素水平及瘦素受体基因表达量的调控,来影响游泳大鼠的脂肪代谢过程。

关键词:游泳:丙酮酸补充;瘦素;瘦素受体:大鼠

中图分类号:G804.7 文献标识码:A 文章编号:1000-520X(2009)08-0041-05

Swimmingandeffectsofpyruvatesupplementonleptinandleptinreceptorofrats

GUOYing-jie1,WANGAn-li2,DINGHua1

(1.SportsMedicineoffice,ShenyangInst.ofP.E.,Shenyang110102,China;

2.CollegeoflfumanKineticsBeijingSportUniv.,Beijing100084,China)

Abstract:Maleswimmingratsasexperimentalobjectswereselectedandtheeffectsandmechanismof

pyruvatesupplementonlipometabolismshouldbediscussedinanattempttomeasuresomechangesregardingbodycompositionandleptinandleptinreceptor.38maleWistarratswereselectedandran-domlydividedintofourgroups,placebocontrolgroup,trainingcontrolgroup,supplementcontrolgroup,trainingandsupplementgroup.TheserumandcerebrospinalfluidleptinweredeterminedbyRadioimmunoassayMethod,leptinrecptor(OB-R)mRNAinhypothalamusbyPCRmethod.Itwasseenthatfourweeks.supplementofpyruvatecouldweakenweightandbodyfatgainingremarkablyinswimmingratsandincreasecerebrospinalfluidleptinandleptinreceptorlevelinhypothalamusinratsandswimmingratsdramatically.Thesupplementofpyruvatecouldweakenweightandbodyfatga-i

ningremarkably,whichcouldacceleratethespeedofthebodyenergymetabolism.Itindicatedthatpyruvatesupplementcouldregulatelipometabolisminswimmingratsbymeansoftheeffectonleptinandleptinreceptorlevels.

Keywords:swimming;pyruvatesupplement;leptin;leptinreceptor;rat 丙酮酸(pyruvicacid,Pyr)是机体糖代谢、脂代谢以及各种氨基酸代谢的中间产物,也是细胞代谢过程中具有枢纽性地位的中间物质,对机体能量代谢有较大影响。自20世纪七、八十年代起,许多学者已就丙酮酸补充对机体健康和运动能力的影响展开了研究。一些针对动物和肥胖动物、健康肥胖人群、高

[5]

脂血症患者及健身运动人群[6]的研究证实,外源性丙酮酸补充可以降低机体的血浆脂蛋白和胆固醇水

收稿日期:2009-05-18;修回日期:2009-06-29

作者简介:郭英杰(1970-),女,辽宁沈阳人,副教授,博士,研究方向:运动营养与医务监督。[1]

[2-3]

[4]

平,减缓体重及体脂的增长速度,增加能量消耗,具有一定的减轻体重和降低体脂率的作用。本研究以游泳

大鼠为研究对象,通过观察丙酮酸补充对其身体成份、瘦素和瘦素受体水平的影响,旨在探讨它们之间可能存在的联系,以便为丙酮酸在运动医学和临床医学等领域中应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康成年雄性Wistar大鼠38只,体重200?10g,

42武汉体育学院学报第43卷

周龄8周,购自中国医科大学实验动物中心(实验动物使用许可证号:SYXK(辽)2003)0013)。动物饲养室温度22?2e,湿度在50%左右,明暗周期12h(6AM~6PM),自由饮水,并随意进食商用大鼠全价营养颗粒饲料,适应性喂养1周。按照动物随机数字表将大鼠分成四组:安慰剂对照组(placebocontrol,简称PC组);运动组对照(trainingcontrol,简称Tc组);补充丙酮酸对照组(supplementcontrol,简称SC组)和补充丙酮酸运动组(trainingandsupplement,简称ST组),各组均自由饮水、饮食。本研究是在沈阳体育学院国家体育总局冬季项目技术诊断与机能评定实验室中完成。1.1.2 丙酮酸补充方案

本实验以阿拉伯胶作为溶剂,所使用的丙酮酸为药用级丙酮酸钙粉剂(丙酮酸钙含量\\99%,由浙江大学精细化工厂提供)。实验开始后的每天上午8:00~9:00,SC组和ST组大鼠通过灌胃方式补充丙酮酸钙溶液(以10%阿拉伯胶溶液为溶剂,丙酮酸钙溶液浓度为60mg/ml阿拉伯胶)。大鼠丙酮酸钙的补充量为600mg/kg体重。同时,PC组和TC组大鼠灌服10%阿拉伯胶溶液。根据各组大鼠体重监测结果,每隔3天调整一次灌胃溶液量。

1.1.3 大鼠游泳运动方案

在水槽中(长120cm,宽60cm,高90cm)放入干净的自来水,水深超过水槽深的2/3,水温保持在30?2e。于每天上午11:00至下午1:00,TC组和ST组大鼠进行无负重游泳运动,共进行4周。1.1.4 实验动物的处死与取样

大鼠禁食12h称重并测量身长后,采用腹主动脉急性大失血方法处死。采血5~8mI,以2000rpm低速离心15min,分离血清,置于4e冰箱保存备用。称

取心脏、肝脏重量;钝性分离腹膜下脂肪垫、肾周脂肪垫和睾周脂肪垫并称重。

大鼠处死后,由专业人员在无菌状态下快速切开背部皮肤,分离颈背肌肉,从枕骨大孔进针抽取脑脊液,立即置于-20e保存,待测瘦素;而后迅速解剖其脑组织,将下丘脑定位区域(前边界为乳头体,后边界为视交叉,深约2mm)分离出来,用锡箔纸包好,粘上标签,分组装袋后,立即置于液氮内冷冻保存。1.2 实验方法

1.2.1 大鼠血清瘦素和脑脊液瘦素水平的测定利用SN一682型放射免疫C计数仪(上海核福光电仪器有限公司),采用竞争放射免疫分析法测定大鼠血清瘦素和脑脊液瘦素水平,试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。

1.2.2 大鼠下丘脑瘦素受体基因表达水平的测定1.2.2.1 样品的处理

将保存于-70e低温冰箱中的样品解冻,称取100mg组织,放入置于冰浴中的玻璃匀浆器内,并加入2mlTrizol试剂制备匀浆。1.2.2.2 主要生化试剂与工具酶

琼脂糖(Biowest,上海分装);dNTP和PCR用去离子水(RNAasefree,为上海生工生物工程有限公司产品);TaqDNA多聚酶(为Promega上海公司产品);RNA提取试剂盒(QIAampViralRNAMiniKit,Qiagen,德国);逆转录酶(M-MuLV,NewEnglandB-iolabs,英国);RNA酶抑制剂(RNaseInhibitor,Taka-ra,日本);PCR产物纯化试剂盒(为德国Qiagen公司QIAquickGelExtractionKit);引物均由上海生工生物工程有限公司合成(见表1),其余生化试剂均为国产分析纯试剂。

表1 逆转录RT-PCR扩增使用的引物

引物名称0B-R-10B-R-213-actin-113-actin-2

序列

5.-GCGGATCCGGAATGAGCAAGGTCAAAAC-3.5.-CGTCTAGAGTGACTTCCATACGCAAACC-3.

5.-GAATTCATGTTTGAGACCTTCAA-3.5.-CCGGATCCATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3.

方向正向反向正向反向

1.2.2.3 实验结果判定与半定量分析

取PcR扩增产物5L1混合1L16@加样缓冲液(Loadingbuffer),进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,来观察结果。瘦素受体(Leptinreceptor,0B-R)扩增片断长度为477bp,内对照B-actin扩增片断为326bp。如内对照和瘦素受体目的片断的扩增条带位置均正确,

则可判断该样本瘦素受体RT-PCR扩增结果阳性。对0B-R和B-actin扩增条带进行扫描分析,计算光密度(OD)。根据0B-R(OD)/B-actin(OD)的比值,对0B-RmRNA表达水平进行半定量分析。

1.2.3 统计方法

应用SPSS11.5统计分析软件进行实验数据的常第8期郭英杰,王安利,等:游泳及丙酮酸钙补充对大鼠瘦素和瘦素受体水平的影响

43规分析处理。组间数据的比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)。2 结果

2.1 实验过程中大鼠体重的变化

在实验过程中,每隔3天监测一次大鼠体重,其变化情况见表2。

表2 实验过程中各组大鼠体重变化情况(g,X?SD)

组别PC组(10)TC组(10)SC组(9)ST组(9)

p

实验前203.20?8.65204.20?8.77203.22?7.82205.00?7.95

s

第4天219.90?9.63217.90?9.64217.22?8.33219.00?12.42

第8天227.30?9.58224.70?12.77223.89?7.67220.22?16.13

w

第12天236.50?13.81234.10?14.52229.89?7.90221.33?16.64wp

第16天245.30?13.90239.60土15.99235.44?6.42221.33?18.32s

nn

第20天255.80?18.02250.90?17.12239.44?15.77227.56?30.17p

第24天267.90?19.16259.60?20.69244.89?14.62234.56?30.50p

第28天277.80?18.71266.10?22.60250.22?14.10237.11?30.70pw

与PC组相比,P<0.05;与PC组相比,P<0.01;与TC组相比,P<0.05;与SC组相比,P<0.05

结果显示,从实验第12天开始,ST组大鼠体重明显低于PC组(P<0.05),从第20天开始,SC组大鼠体重明显低于PC组(P<0.05);与TC组大鼠相比,在实验第12天和实验结束时,ST组大鼠体重明显下

降(P<0.05)。

2.2 各组大鼠脂肪组织的重量

实验结束后,大鼠身体各部位脂肪组织重量的结果对比见表3。

表3 各组大鼠腹部、睾周和肾周围脂肪垫重量变化(x?SD)

组别PC组(10)TC组(10)SC组(9)ST组(9)

w

腹部脂肪垫重量(g)睾周脂肪垫重量(g)肾周脂肪垫重量(g)

2.97?1.002.81?0.802.03?1.02wn1.66?0.63su

s

脂肪垫总重量(g)6.34?1.506.11?1.274.55?1.90wn3.95?1.07su

脂肪垫/体重(%)2.47?0.492.49?0.432.00+0.811.79?0.51su

2.44?0.402.45?0.521.87?0.61wn1.75?0.35s

n

u

0.93?0.180.85?0.180.64?0.32w0.54?0.17su

与PC组相比,P<0.05,P<0.01:

与TC组相比,P<0.05,u与TC组相比,P<0.01

由表2可见,SC组和ST组大鼠各部位脂肪组织(包括腹部脂肪、肾周脂肪和睾周脂肪)重量均明显低

于PC组(P<0.05);SC组和ST组大鼠腹部脂肪、睾周脂肪及脂肪总重量均明显低于TC组(P<0.05),

组别

样本数

血清瘦素水平(ng/m1)

PC组TC组SC组ST组

u

特别是ST组,其肾周脂肪和脂肪垫/体重(%)也分别明显低于PC组和TC组(P<0.05),这提示丙酮酸可

能有较强的促进脂肪代谢的作用。

2.3 各组大鼠血清和脑脊液瘦素水平的测定结果

脑脊液瘦素水平

(ng/m1)0.46?0.230.62?0.330.63?0.180.71?0.31u

0.78?0.380.82?0.280.8l?0.230.97?0.31脑脊液瘦素/血清瘦素

表4 各组大鼠血清和脑脊液瘦素水平(X?SD)

10999

0.76?0.560.74?0.240.82?0.280.76?0.32

与PC组相比,P<0.01

44武汉体育学院学报第43卷

大鼠血清和脑脊液瘦素(Lep)放免结果显示,各组大鼠血清瘦素水平并无显著差异,但SC组大鼠血清瘦素水平有一定的升高趋势,比TC组和PC组分别升高了7.89%和l0.8%;TC组、SC组和ST组大鼠脑脊液瘦素水平均高于PC组,其中ST组大鼠脑脊液瘦素水平明显高于PC组(P<0.01)。

2.4 各组大鼠下丘脑瘦素受体基因表达量的测定结果

用凝胶成像系统分析大鼠下丘脑瘦素受体(0B-R)的RT-PCR扩增产物灰度表达,并进行数据的统计分析,其结果见图1和表5。

P<0.05);丙酮酸补充大鼠(SC组)从第20天起,体重增长速度明显下降(与PC组相比,P<0.05),这提示丙酮酸补充可明显减缓大鼠和游泳大鼠体重增长速度。另外,研究结果还显示,补充丙酮酸可明显降低大

鼠体内脂肪垫,特别是腹部和睾周脂肪垫的增长速度(P<0.05),并且对游泳大鼠的作用效果更明显(P<0.01),可使其肾周脂肪垫增长速度也明显下降(P<0.01),这提示补充丙酮酸对游泳大鼠体重的影响可能是通过减少其内脏脂肪(腹部脂肪、睾闹和肾周脂肪)的增长量来实现,这样对其瘦体质的影响就会相对较小,从而达到安全、有效地降低游泳大鼠体重和体脂的目的。

3.2 丙酮酸补充对游泳大鼠瘦素水平的影响

瘦素(leptin,lep)是一种主要由脂肪细胞合成和分泌的脂源性蛋白类激素。1994年底zhang等人成功克隆了小鼠的ob基因,并确定了其所编码的蛋白。随后此蛋白产物很快被人工重组,并命名为lep。它的发现为体内能量代谢和脂肪沉积机理的研究开辟了新的领域,引起了学者们的普遍关注。一般认为,lep主要是通过抑制食欲来减少能量摄入、增加能量消耗和抑制脂肪合成这三种途径来调节机体脂肪的沉积

[11]

[10]

图1 各组瘦素受体(0B-R)RT-PCR扩增产物电泳结果

(M:标准分子量比对;Al:PC组;A2:TC组;A3:SC组;A4.ST组)

由图l可见,PC组、TC组、SC组和ST组均有0B-RmRNA的表达,而且各组的表达量存在着差异。表5 各组大鼠下丘脑0B-R基因表达水平对比(x?SD)

组别PC组TC组SC组ST组

p

。

研究表明,lep与神经内分泌系统之间存在着一个

双向闭合环路。一方面lep作用于下丘脑、胰腺、甲状

样本数10999

u

下丘腑0B-R基因表达水平(%)

28.73?7.7535.28?7.3237.39?6.27p40.46?7.44u

与PC组相比,P<0.01

腺、肾上腺和性腺;另一方面,又接受这些神经内分泌器官的负反馈调节,发挥其调节机体能量代谢的生理功能[12]。研究表明,脑脊液Lep浓度与下丘脑摄食控制中枢的功能有关[13]。lep由脂肪组织分泌后进入血液循环,与下丘脑瘦素受体结合,通过下丘脑来调节食欲和/或能量消耗,从而控制体重。由此可见,人体内可能存在着把lep从体循环通过血脑屏障运输至脑细胞的转运系统,从而使lep在大脑内发挥作用。Man-ks等人通过静脉注射放射性lep后发现,在大脑组织中可测到约75%的标记后lep,从而证实了转运系统的存在[14]。在生理状态下,血lep通过转运系统越过血脑屏障,作用于下丘脑,使下丘脑神经肽Y分泌减少,产生饱食感,进食减少,能量消耗增加,从而发挥其作用。

本研究中,各组大鼠血清和脑脊液Lep浓度方差分析结果显示,各组大鼠之间血清Lep水平无显著差异,但补充丙酮酸大鼠(SC组)血清lep水平有升高的趋势,分别比对照组(TC组和PC组)升高了7.89%和10.8%;与安慰剂对照组(PC组)相比,丙酮酸补充和游泳运动大鼠(TC组、SC组和ST组)脑脊液lep水平均呈升高趋势,其中进行丙酮酸补充的游泳大鼠与PC组相比,P<0.05,

由表5可见,TC组、SC组和ST组大鼠下丘脑0B-RmRNA表达量均高于PC组。与PC组相比,SC

组(P<0.05)和ST组(P<0.01)0B-RmRNA表达量有显著差异。3 讨论

3.1 丙酮酸补充对游泳大鼠身体成份的影响

目前,有关丙酮酸补充对人体和动物体重和体脂的影响,国内外学者基本达成了一致结论。大量研究都证实,补充丙酮酸能达到减缓体重增长速度及降低体脂的目的[7-8]。

在本研究中,从第12天起,进行丙酮酸补充的游泳大鼠(ST组)体重明显低于对照组(PC组和TC组,

第8期郭英杰,王安利,等:游泳及丙酮酸钙补充对大鼠瘦素和瘦素受体水平的影响

肪代谢的影响[J].营养学报,2002,24(3):229-233.

45脑脊液lep水平明显升高(P<0.01)。这提示外源性丙酮酸补充可能会通过增加血中游离的lep量和/或提高血脑屏障lep通过率来抑制大鼠和游泳大鼠的摄食量,增加能量消耗,从而达到降脂、降体重的效果。

3.3 丙酮酸补充对游泳大鼠瘦素受体表达的影响

lep进入血液循环,与下丘脑瘦素受体(1eptinre-ceptors,0B-R)结合后发挥其生理作用。0B-R主要在下丘脑的弓形核、腹内侧核、背内侧核、室旁核等区域表达,而这些核团具有调节摄食及体重的功能[16]。事实上,0B-R是lep作用于下丘脑的一座桥梁,lep与下丘脑部0B-R结合后,会引起下丘脑内某些成分的变化,如神经肽Y(NPY)合成分泌减少和黑色素细胞刺激素分泌增加。NPY产生于下丘脑弓状核,有很强的刺激食欲,减少能量消耗的作用;黑色素细胞刺激素可与脑中特异受体结合而封闭饥饿感。故可认为,lep在下丘脑的生物效应是通过0B-R来实现的。同时,有研究表明,下丘脑中lep含量的增高,可促进0B-RmRNA表达,并维持与其他激素正常的调控关系。

在本研究中,与对照组(PC组)相比,进行游泳运动和丙酮酸补充的大鼠(TC组、SC组和ST组)下丘脑0B-RmRNA表达量均呈较高水平,其中丙酮酸补充大鼠(SC组,P<0.05)和游泳大鼠(ST组,P<0.01)下丘脑0B-RmRNA表达量显著升高。这提示丙酮酸补充可能通过影响大鼠和游泳大鼠体内lep的分泌和转运,进而影响下丘脑0B-R表达量,从而对大鼠和游泳大鼠的摄食行为和体重的变化产生影响。不过,对其生理作用机制还有待于进一步研究。4 小结

本研究表明,丙酮酸补充可在一定程度上减慢游泳大鼠体重和体脂的增长速度,加快其能量代谢速度;并可能通过调控游泳大鼠体内瘦素及瘦素受体基因表达水平,来影响游泳大鼠的脂肪代谢过程。参考文献:

[1]StankoRTandAdibiSA.Inhibitionoflipidaccumulation

andenhancementofenergyexpenditurebytheadditionofpyruvateanddihydroxyacetonetoaratdiet.[J].Metabolism,1986,35:182-186.

[2]朱惠莲,许月初,蒋卓勤,等.丙酮酸对肥胖大鼠体重和脂

[18]

[16]

[3]陈世伟,刘翠娥,张杰,等.丙酮酸钙对肥胖大鼠脂质代谢

及肥胖基因表达产物的影响[J].郑州大学学报(医学版),20003,38(5):771-774.

[4]StankoRT,TietzeDL,ArchJE.Bodycomposition,energy

utilization,andnitrogenmetabolismwitha4.25-MJ/dlow-energydietsupplementedwithpyruvate[J].AmJClinNutr,1992:56:630-5.

[5]StankoRT,ReynoldsHR,HoysonR,eta1.Pyruvatesup-plementationofa10w-cholesterol,low-fatdiet:effectsonplasmalipidconcentrationsandbodycompositioninhyper-lipidemicpatients[J].AmJClinNutr,1994,59:423-7.[6]KalmanD,ColkerCM,WiletsI,eta1.Theeffectsofpyru-vatesupplementationonbodycompositioninoverweightin-dividuals[J].Nutrition,1999,15(5):337-40.

[7]StankoRT,FergusonTL,NewmanCW,eta1.Reductionof

carcassfatinswinewithdietaryadditionofdihydroxyace-toneandpyruvate[J].JAnimSci.1989:67(5):1272-8.[8]张平.丙酮酸钙抑制大鼠脂肪的堆积[J].大庆高等专科学

校学报,2001,21(4):62-66.

[9]周春宝,陈宏军,王锦锋,等.丙酮酸对生长肥育猪日增重

和膘厚的影响[J].当代畜牧业,2004(5):22-23.

[10]ZhangYY,ProencaR,MaffeiM,eta1.Positionalcloning

ofthemouseobesegeneanditshumanhomologue[J].Na-ture,1994,373:425.

[11]王嘉玺,邹民吉.瘦素(Leptin)的研究进展[J].中国医学

研究与临床,2004,2(5):37-41.

[12]刘庸.关注产科领域瘦素的研究[J].中华妇产科杂志,

2000,35(7):272.

[13]田成功,金嘉琳.Leptin抵抗[J].中国糖尿病杂志,2002,

10(3):188-189.

[14]OstlundRE,YangJW,KleinS,eta1.Relationbetween

plasmaleptinconcentrationandbodyfat,genderdiet,ate,andmetaboliccovariates[J].JClinendocrinolMetab,1996,81:3909-3913.

[15]吴坚,邹大进.瘦素受体的研究进展[J].生理科学进展,

2000,31(2):143-147.

[16]YonekuraS,SenooT,KobayashiY,eta1.Effectsoface-tateandbutyrateontheexpressionofleptinandshort-formleptinreceptorinbovineandratanteriorpituitarycells[J].GenCompEndocrinol,2003,133(2):162-172.[17]刘国光.Leptin对雌性大鼠下丘脑一垂体一性腺轴作用的

分子机理研究[D].甘肃农业大学,2002:24.