兽药GMP检验规程

污水监测方法

根据生产生物制品种类选用下列动物，每月对污水监测1次，报中监所，注射的动物观察10日，应全部健活。

家兔 体重1.5～2kg 2只 各皮下注射2ml 豚鼠 体重300～400kg 2只 各皮下注射1ml

鸡 2～6月龄 2只 各皮下或肌肉注射1ml 小白鼠 体重18～22g 2只 各皮下注射0.5ml 生产化学药品者，按环保部门的要求进行监测。

汞类防腐剂含量测定法

1 对照品溶液的制备 精密称取于硫酸干燥器干燥中至恒重的二氯化汞0.13g，置100ml量瓶中，加硫酸液（0.5mol/L）使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。每1ml溶液中含1.0mg的Hg，此液为汞浓溶液。

精密量取汞浓溶液5ml于100ml量瓶中，用硫酸液（0.5mol/L）稀释至刻度，摇匀，即得。每1ml溶液中含50μg的Hg。 2 测定法

2.1 油乳剂疫苗消化 用经标定的1ml注射器（附15cm长针）正确量取摇匀的本品1ml，置25ml凯氏烧瓶（瓶口加小漏斗）中，加硫酸3ml、溶液（1→2）0.5ml，小心加热，待泡沸停止，稍冷，加硫酸溶液（1→2）0.5～1ml，在加热消化，如此反复加溶液（1→2）0.5～1ml消化，加热达白炽化，直至白炽化加热15分钟后，溶液与上次加热后的颜色无改变为止，放冷（溶液应无色），加水20ml，放冷至室温，即得。 2.2 其他疫苗消化 精密量取摇匀的本品（约相当于汞25～50μg）置25ml凯氏烧瓶（瓶口加小漏斗）中，加硫酸2ml、溶液（1→2）0.5ml，加热沸腾15分钟，如溶液颜色变深，在加溶液（1→2）0.5～1ml，加热沸腾15分钟，放冷，加水20ml，放冷至室温即得。

2.3 滴定 将上述消化液移入125ml分液漏斗，用水分多次洗涤凯氏烧瓶，使总体积为80ml，加20%盐酸羟胺试液5ml，摇匀，用0.00125%双硫腙滴定液滴定，开始时每次滴加3ml左右，以后逐渐减少，至每次0.5ml，最后可少至0.2ml，每次加入滴定液后，强烈振摇10秒钟，静置分层，弃去四氯化碳层，继续滴定，直至双硫腙的颜色不变，即为中点。

2.4 对照品滴定 精密量取对招品溶液1ml（含汞50μg），置125ml分液漏斗中，加硫酸2ml，水80ml，20%盐酸羟胺溶液5ml，用双硫腙滴定液滴定，操作同2.3。

汞类含量%（g/ml）= 供试品滴定毫升数 × 0.0101 %

对照品滴定毫升数 供试品毫升数

以上计算公式用于非油乳剂疫苗。油乳剂疫苗应为上述计算公式结果在除以0.6。

附注：试液制备

1 0.05%双硫腙浓溶液 取双硫腙50mg，加氯仿100ml使溶解，即得。本品应置棕色瓶内，在冷暗处保存。

2 0.00125%双硫腙滴定液 取0.05%双硫腙浓溶液2.5ml，用四氯化碳稀释至100ml，即得。本液应临用新制。

3 20%盐酸羟胺试液 取盐酸羟胺1g，加水5ml使溶解，即得。

苯酚（石炭酸）含量测定法

1 对招品溶液的制备 取苯酚（精品辅助4）适量，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

2 供试品溶液的制备 取供试品1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。 3 检查法 分别取精密量取对照品溶液各5ml，置100ml量瓶中，加水30ml，分别加醋酸钠试液2ml。对硝基苯胺、亚钠混合试液1ml，混合，在加碳酸钠试液2ml，加水至刻度，充分混匀，放置10分钟后，照分光光度法（《中华人民共和国兽药典》2000年版第一部附录17页）在550nm的波长处测定吸收度，计算即得。

供试品溶液的吸收度

苯酚含量%（g/ml）=0.5× %

对照品溶液的吸收度

附注：

1 碳酸钠试液 取碳酸钠10.5g，加水100ml使溶解。 2 对硝基苯胺、亚钠混合液

2.1 取对硝基苯胺1.5g，加盐酸40ml，加水至500ml，加热使溶解。 2.2 取亚钠10g，加水100ml使溶解。 使用时取2.1液25ml加2.2液0.75ml混合。

3 醋酸钠试液 取醋酸钠25g，加水溶解成100ml，即得。 4 苯酚精品的制备及其含量标定

4.1 取苯酚，直火蒸馏，弃去初馏液，接收181～182℃的馏分。

4.2 苯酚含量标定 取本品约0.5g，精密称定，置500ml量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取25ml，置碘瓶中，精密加溴滴定液（0.1mol/L）25ml，在加盐酸5ml，立即密塞，充分振荡后，加氯仿1ml，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液

（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果，用空白试验校正，即得。每1ml溴滴定液（0.1mol/L）相当于1.569mg的C6H6O。

甲醛含量测定法

1 对照品溶液的制备 取以标定的甲醛溶液适量，配成每1ml含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5ml与50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。如被测样品为油乳剂疫苗，则精密量取上述每1ml含甲醛1.0ml的溶液5ml于50ml量瓶中，加20%土温-80乙醇溶液10ml，再加水至刻度，摇匀，即得。 2 供试品溶液的制备

2.1 油乳剂疫苗 用5ml刻度吸管量取本品5ml，置50ml量瓶中，用20%土温-80乙醇溶液10ml，分次洗涤试管，洗液并入50ml量瓶中，摇匀，加水至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如不澄清，过滤，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。

2.2 其他疫苗 用5ml刻度吸管量取本品5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，溶液如不澄清，过滤，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。

3 检查法 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.5ml，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10.0ml，乙酰丙酮试液10.0ml，置60℃恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，照分光光度法（《中华人民共和国兽药典》2000年版第一部附录17页），在410nm的波长处测定吸收度，计算，即得。

供试品溶液的吸收度

甲醛溶液（40%）含量%（g/ml）=0.25× %

对照品溶液的吸收度

附注：试液制备

1 醋酸-醋酸铵缓冲液（pH6.25）

醋酸液 醋酸（AR）12.9ml加水至100ml

醋酸铵液 醋酸铵（AR）173.4g加水至1000ml溶解。 醋酸液40ml与醋酸铵液1000ml混合，置冷暗处保存。

2 乙酰丙酮试液 乙酰丙酮（AR）7ml，加乙醇14ml混合，加水至1000ml。

甲醛溶液含量标定 取甲醛溶液约1.5ml，精密称定，置锥形瓶中，加水10ml，与溴麝香草酚蓝指示液2滴，滴加氢氧化钠滴定液（1mol/L）至溶液呈蓝色，加过氧化氢试液25ml，再精密加入氢氧化钠滴定液（1mol/L）25ml，瓶口置一玻璃小漏斗，在水浴上加热15分钟，不时振荡，冷却，用水洗涤漏斗，加麝香草酚蓝指示液2滴，用盐酸滴定液（1mol/L）滴定至溶液显黄色，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液（1mol/L）相当于30.03mg的CH2O。

禽白血病病毒检验法（COFAL试验）

用对禽白血病病毒易感的9～11日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，凡附录442页进行。

1 样品的处理及接种

1.1 毒种和疫苗样品的处理 每批毒种或病毒性活疫苗均用M-199液（不含牛血清）复原，2000r/min离心10分钟，然后加入相当的抗血清，37℃左右中和60分钟。

1.1.1 含新城疫病毒（NDV）的制品 取0.8ml（含200羽份）疫苗，加入等量NDV抗血清进行中和，全部接种到细胞瓶中。

1.1.2 含鸡马立克氏病毒和腱鞘炎病毒制品 加入无菌蒸馏水或去离子水10ml，通过0.2μm滤器滤过1～2次，将滤液（含500羽份）接种到细胞中。

1.1.3 含鸡痘病毒（FPV）的制品 每瓶疫苗加稀释液10ml，通过0.65μm滤器滤过1次，在通过孔径为0.2μm滤器滤过2次，将滤液（含500羽份）接种到细胞中。

1.1.4 含禽脑脊髓炎病毒（AEV）的制品 取稀释的疫苗2ml（含500羽份）加入等量的AE抗血清中和（AE-POX产品，则先按POX进行滤过处理），接种到细胞中。

1.1.5 鸡传染性支气管炎（IB）和传染性喉气管炎（LT）制品，不用中和，直接取稀释后的制品2ml（含500羽份）接种到细胞中。

1.1.6 含鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的制品 取2ml（含500羽份）稀释过的疫苗，加适量的抗血清中和后接种到细胞中。

1.1.7 细胞液 取最后的细胞悬液5ml作为样品。

1.2 接种与培养 接种后，37℃吸附30分钟，弃去接种液，加入细胞生长液，次日换成维持液。同时设立正常细胞和培养液作对照。

2 细胞培养的传代和处理

2.1 待细胞培养5～7日后，按常规方法消化、收获细胞，其中1/2细胞做上标记，放-60℃以下作检验用（P1），其余细胞分散到两个瓶中。培养7日后，按同样方法收获细胞，留样（P2）。如此继续传第三代，收获（P3）。所有对照组亦同样处理。

2.2 处理 将P1、P2、P3的细胞培养物（包括样品和所有对照组）冻融3次，并做上标记。

3 阳性病毒独照的设立 去掉细胞生长液，分别加入RAV1和RAV20.5ml，37℃吸附30分钟，直接加入培养液，任何一代阳性对照应在最后进行。

4 COFAL试验（两日试验） 4.1 第一日试验

4.1.1 在96孔微量板中，按表示加入缓冲液0.025ml，独照孔A、B各0.025ml；C、D、E各0.05ml，F加0.1ml。

96孔板样板

A1:2 B1:4 C1:8 D1:2 E1:2 F1:4 G1:8 H1:2

1 NCP1

2 NCP2 S3P2 3 NCP3 4 S1P1 5 S1P2 RAV1 P2 6 S1P3 7 S2P1 8 S2P2 RAV2 P2 9 S2P3

10 标 准 比 色 板 孔

11

12 其 他 对 照 孔

S3P1 S3P3 RAV1 P1 RAV1 P3 RAV2 P1 RAV2 P3

注：NC正常细胞对照。

P1P2P3:分别为第一代、第二代、第三代。 S1S2S3：分别为样品1、样品2、样品3。

4.1.2 样品的加入与稀释：在A和D、E和横排各孔中分别加入0.025ml样品，并用微量移液管从A→B→C和E→F→G进行联系稀释，最后C孔和G孔中弃去0.025ml，D和H孔中混合后弃去0.025ml；其他对照孔中B、G各加病毒对照0.025ml。

4.1.3 在D和H排各孔中加入缓冲液0.025ml。

4.1.4 在A、B、C和E、F、G排各孔中加入灭活血清0.025ml，其他对照孔中A、G各加入0.025ml，混匀包板后，室温下作用30～45分钟（期间配制补体）。

4.1.5 所有孔中均加入适量浓度的补体（全量）0.05ml，对照孔中A、B、C、G各加入0.05ml（全量）补体，D孔加0.05ml（1/2浓度），E孔加入0.05ml（1/4浓度）的补体，轻摇平板，混匀密封后，置4℃左右过夜。

4.2 第二日试验

4.2.1 配制2.8%绵羊红细胞悬液（附录439页）。

4.2.2 致敏红细胞的制备 在2.8%的绵羊红细胞中缓缓加入等量作适当稀释（如1：2000）的溶血素，磁力搅拌混合10分钟后，放37℃水浴30分钟，其间搅动2～3次。

4.2.3 制备标准比色板

4.2.3.1 将2.8%绵羊红细胞悬液用缓冲液稀释成0.28%绵羊红细胞悬液。

4.2.3.2 取2.8%绵羊红细胞悬液1ml加无菌去离子水7ml，然后加5倍缓冲液2ml，即为溶解红细胞液。

4.2.3.3 按顺序加入下列试剂，第12管只加缓冲液1ml。 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 溶解红细胞液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.28%绵羊红细胞悬液 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 溶血率（%） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

4.2.3.4 在标准比色板中，从0%溶血率开始，在11列的A→H和10列的H→F相应孔内加入上述红细胞悬液0.125ml。

4.2.4 其余各孔内加入致敏红细胞悬液0.025ml，并用胶带密封好，37℃水浴30分钟，在1500r/min离心5分钟或4℃放3～6小时。

4.2.5 判定 以50%为反应终点，任何孔溶血率高于50%判为阳性，低于50%判为阳性。

外源病毒检查法

本方法用于生产用细胞、种子毒及病毒性活疫苗的检验。 1 禽源细胞（原代或细胞系）及制品的检验

1.1 样品处理 取样品2～3瓶，种子毒或活疫苗混合后，用相应的单特异性血清中和后作为检品（除另有规定外）。细胞经3次冻融后混合作为检品。用鸡检查法，样品不处理。

如对检品中的病毒中和不完全，可用效价高的血清重做，或用制品使用对象进行检验。

1.2 检查法 根据制品的要求按下列不同的方法进行检查。 1.2.1 鸡胚检查法

1.2.1.1 选9～11日龄SPF鸡胚20个，分成2组，第一组10个胚经尿囊腔内接种0.1ml（如为疫苗，至少含10个使用剂量）；第二组10个胚经绒毛尿囊膜接种0.1ml（如为疫苗，至少10个使用剂量），在37℃培养7日。弃去在接种后24小时内的死胚，但每组胚至少存活8/10，试验方可成立。

1.2.1.2 判定 胎儿应发育正常，绒毛尿囊膜无病变。取鸡胚液作血球凝集试验，作为阴性，此批制品判为合格。

用鸡胚检查无结果或可疑时，可用鸡检一次。

1.2.2 鸡检查法 用适于接种本疫苗日龄的SPF鸡20只，点眼、滴鼻接种10个使用剂量的疫苗；肌肉注射100个使用剂量的疫苗，接种后21日，按上述方法重复1次，第1次接种后42日采血，进行有关病原（见下表）的血清抗体检验。在42日内，不应有疫苗引起的局部或全身症状和呼吸道症状或死亡。如有死鸡，应作病理学检查，证明是否由疫苗所致。血清抗体检验，除本疫苗所产生的特异性抗体外，不应有其他病原的抗体存在。

用鸡检查禽源活疫苗中的外源病毒 病 原 鸡传染性支气管炎病毒 鸡新城疫病毒 禽腺病毒 禽流感病毒 检 验 方 法 HI/ELISA HI HI AGP/HI 鸡传染性喉气管炎病毒 禽呼肠孤病毒 鸡传染性法氏囊病毒 禽网状内皮增生症病毒 鸡马立克氏病毒 禽白血病病毒 禽脑脊髓炎病毒 鸡痘病毒 中和抗体 AGP AGP/ ELISA IFA/ ELISA AGP ELISA ELISA AGP（临床观察） 1.2.3 细胞检查法 1.2.3.1 细胞观察 取2个方瓶（100ml容量）的CEF（培养24小时左右），接种以中和后的疫苗0.2ml，培养5～7日，观察细胞，应不出现CPE。

1.2.3.2 红细胞吸附试验 上述培养的细胞弃去培养液，用PBS洗细胞面3次，加入0.1%（V/V）鸡红细胞悬液覆盖细胞面，4℃放置60分钟后，用PBS轻轻洗涤细胞1～2次，在显微镜下检查红细胞吸附情况，应不出现由外源病毒所致的红细胞吸附现象。 1.2.3.3 COFAL试验（检查白血病病毒） 见附录4页。 2 非禽源细胞（原代或细胞系）及制品的检验 2.1 荧光抗体检查法

2.1.1 选样 对细胞或细胞系检查时，选用连传2代后培养4日以上的细胞单层；对其制品的检验时，样品用相应的单特异性血清中和处理后，接种细胞单层培养4日，传第二代，选用第二代培养物。

2.1.2 荧光抗体的选择 视被检细胞来源不同，选用不同病毒的特异荧光抗体。

猪源细胞应检查：牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDV）、伪狂犬病病毒（PRV）、狂犬病病毒（RV）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（HCV）。

牛羊源细胞应检查：BVDV、RV、PRV、PPV、BTV（蓝舌病病毒）。 马源细胞应检查：马传染性贫血病毒 犬源细胞应检查: RV、PRV、PPV、BVDV。

2.1.3 检验 样品分别经丙酮固定后，以适宜的荧光抗体进行染色、镜检。检查每种病毒时，应各用2组细胞单层，一组为被检组一组为由中国兽医药品监察所提供的接种100～300FAID50特异病毒的细胞固定片，作为阳性对照。被检组至少取4个细胞覆盖率在75%以上的细胞单层，总面积不少于5cm2。

2.1.4 判定 若被检组出现任何一种特异荧光，为不合格。若阳性对照组不出现特异荧光或荧光不明显，为无结果，可以重检。若被检组出线不明显荧光，必须重检，重检仍出现不明显荧光，为不合格。

2.2 绿猴肾（vero）传代细胞检查法 毒种及疫苗经相应的特异性血清中和后，用3瓶Vero细胞单层（总面积不少于100cm2），每瓶接种检样1ml，连传2代，每代7日，应不出现细胞病变。同时进行红细胞吸附病毒检测（按2.3进行）和荧光抗体检查（按2.1项进行），应无红细胞吸附因子和特异性荧光。

2.3 致细胞病变和（或）红细胞吸附性外源病毒的检查

2.3.1 致细胞病变外源病毒的检测 取经传代后培养至少7日的细胞单层（每个6cm2）一个或多个进行检验。

2.3.1.1 用适宜的染色液，对细胞单层进行染色。

2.3.1.2 观察细胞单层，检查包涵体、巨细胞或其他由外源病毒引起的细胞病变的出现情况。

2.3.2 红细胞吸附性外源病毒的检测 取经传代后至少培养7日的细胞单层（每个6cm2）一个或多个进行检验。

2.3.2.1 以PBS洗涤细胞单层数次。

2.3.2.2 加入0.2%红细胞悬液适量，以覆盖整个单层表面为准。红细胞悬液应是洗涤过的豚鼠红细胞、人“O”型红细胞的等量混合悬液，可在加入前混合，亦可分别滴加于不同的细胞单层上。选2个细胞单层分别在4℃和20～25℃培养30分钟，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。

2.3.3 判定 若出现外源病毒所致的特异性细胞病变或红细胞吸附现象，判为不合格；若疑有外源病毒的污染，但又不能通过其他试验排除这种可能时，则作不合格论。

支原体检查法

用于由细胞、禽胚或动物组织制成的活疫苗和用于配制细胞培养液的各种畜禽血清的检验。 1 培养基

1.1 检测由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗 用改良Frey氏培养基。 1.2 检测其他种类的病毒活疫苗 用支原体培养基。 1.3 检测血清 用无血清的支原体培养基。 2 检查法

2.1 样品处理 每批样品取样3～5瓶，混合后备用。如为冻干制品，则加液体培养基复原成混悬液后混合血清直接接种。接种时不得用口吹吸吸管。 2.2 疫苗的检测

2.2.1 接种与观察 每个样品需同时用以下两种方法检测。

2.2.1.1 液体培养基培养 将疫苗混合物5ml，接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中取0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管放37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，若无变化，则在最后一次移植小管观察14日后，停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，在原pH值变化达±0.5时，应立即移植于小管液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。

2.1.1.2 琼脂固体平板培养 在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1～0.2ml接种于琼脂平板，置含5%～10%二氧化碳潮湿的环境、37℃下培养。此外在液体培养基颜色出现变化，在原pH值变化达±0.5时，也同时接种琼脂平板。每5～7日，在低倍显微镜下观察，检查各琼脂平板有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落者停止观察。

2.2.2 每次检查需同时设阴、阳性对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。

2.3 血清的检测 取被检血清50ml代替培养基中的马、猪血清，按（附录339页）培养基配方配成大瓶培养，按2.2.1.2项稀释、移植、培养，观察小管培养基pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。 3 结果判定

3.1 接种被检物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落，判疫苗或血清不合格。

3.2 若阳性对照中至少一个平板出现支原体菌落，而隐性对照中无支原体生长，则检验有效。

注：上述小瓶培养基是指100ml小瓶中盛培养基20ml；小管培养基是指试管（1.0×10cm）中盛入1.8ml培养基。小管与小瓶皆须用胶塞或螺旋塑料塞封口。

禽沙门氏菌检验法

本方法适用于用非SPF鸡胚制造的疫苗。

将被检物用划线法接种麦康凯琼脂平板或S.S琼脂平板2个，经37℃培养18～24小时，如无可疑菌落出现继续培养24～48小时，挑选无色半透明、边缘整齐、表面光滑并稍突起的菌落，用0多价1沙门氏菌因子血清作玻片凝集试验，如为阳性即证明为沙门氏菌污染，该批制品应废弃。

杂菌计数和病原性鉴定

1 杂菌计数 每批有杂菌污染的制品至少抽样3瓶，用肉汤或蛋白胨水分分别按组织量作50倍稀释，接种于含4%血清及0.1%裂解血球全血的马丁（或G.A）琼脂平板上，每个样品接种平板2个，置36℃培养48小时后，再移植室温24小时，数杂菌菌落（CFU），然后分别计算杂菌数。任何1瓶每1g组织（或每头剂）的非病原菌数，不应超过该制品规程的规定。如污染霉菌时，亦作为杂菌计算。 2 病原性鉴定

2.1 检查需氧性细菌时，将污染需氧性杂菌管培养物移植1支T.G管或马丁汤，置同条件下培养24小时，取培养物用蛋白胨水稀释100倍，接种体重10～22g小鼠3只，每只皮下注射0.2ml，观察10日。

2.2 检查厌氧性细菌时，将杂菌管培养时间延长至96小时，取出置65℃水浴加温30分钟后移植T.G管或厌气肉肝汤1支，在同条件下培养24～72小时。如有细菌生长，将培养物接种体重350g～450g的豚鼠2只，每只肌肉注射1ml，观察10日。

2.3 如发现制品同时污染需氧性及厌氧性细菌，则按上述要求同时注射小鼠及豚鼠。 2.4 判定 小鼠、豚鼠应健活。如有死亡或局部化脓、坏死，证明有病原菌时，该批制品应废弃。

无菌检验或纯粹检验

生物制品（除另有规定外）都不应有外源微生物污染。灭活疫苗不应含有活的本菌或本毒。各类生物制品必须按规定作无菌检验或纯粹检验，全部操作应在无菌条件下进行。

1 抽样 应随机取样并注意代表性。

1.1 制造疫苗用的各种原菌液、毒液和其他配苗组织乳剂、稳定剂及半成品的无菌或纯粹检验，应每瓶（罐）分别进行抽样进行，抽样量为2～10ml。

1.2 成品的无菌或纯粹检验应按每批或每个亚批进行，每批按瓶数百分之一抽样，但不应少于5瓶，最多不超过10瓶，分别进行检验。 2 检验用培养基 2.1 无菌检验

2.1.1 厌氧性及需氧性细菌的检验 用硫乙醇酸盐培养基（T.G）及酪胴琼脂（G.A）。 2.1.2 霉菌及腐生菌检验 用葡萄糖蛋白胨汤（G.P）。

2.2 活菌纯粹检验 用适于本菌生长的培养基。

2.3 灭活检验 用适于本菌生长的培养基，或对本毒敏感的细胞、组织和动物。 2.4 杂菌计数 用马丁琼脂或（G.A）培养基。

2.5 病原性鉴定 用T.G培养基或其他适宜培养基。 3 检验方法与结果判定

3.1 细菌原菌液及活菌苗半成品的纯粹检验 取供试品接种T.G小管及适宜于本菌生长的其他培养基斜面各2支，每支0.2ml，1支置37℃培养；1支置25℃培养，观察3～5日，应纯粹。

3.2 病毒原毒液和其他配苗组织乳剂、稳定剂及半成品的无菌检验 取供试品接种T.G小管及G.A斜面各2支，每支0.2ml，1支置37℃培养；1支置25℃培养，观察3～5日，应无细菌生长。

3.3 灭活检验 细菌灭活后，用适于本菌生长的培养基2支，各接种0.2ml，置37℃培养5日，应无细菌生长。病毒液灭活后和细菌毒素脱毒后接种对本毒敏感的细胞、禽胚或试验动物，应正常。

3.4 含甲醛、苯酚、汞类等防腐剂和抗生素的制品的无菌检验 用T.G培养基50ml，接种供试品（冻干制品先做10倍稀释）1ml，置37℃培养，3日后自小瓶中吸取培养物。分别接种T.G小管和G.A斜面各2支，每支0.2ml，1支置37℃培养；1支置25℃，另取0.2ml，接种1支G.P小管置25℃，均培养5日，应无细菌生长。

如制品允许含一定数量的非病原菌，应进一步作杂菌计数和病原性鉴定。

3.5 细菌性活疫苗（冻干制品恢复原量）及不含防腐剂、抗生素的其他制品或稀释液，将供试品直接接种T.G小管、G.A斜面或适用于本菌生长的其他培养基各2支，每支

0.2ml，，1支置37℃培养；1支置25℃，另取1支G.P小管，接种0.2ml置25℃，均培养5日。细菌性活疫苗应纯粹，其他制品应无细菌生长。

3.6 血液制品和混浊制品如不加防腐剂或抗生素，可直接用不加琼脂的T.G小管和G.A斜面，接种量、培养条件、时间和判定标准同3.5项。如加防腐剂或抗生素，检验方法和判定同3.4项。

3.7 如培养后混浊不易判定时，可移植1次，再判定。

3.8 每批抽检的样品必须全部无菌或纯粹生长。如发现个别瓶有杂菌或结果可疑时，可重检原瓶（如为安瓿或冻干制品，可重抽样品），应无细菌或无杂菌生长，可作无菌或纯粹通过。如仍有杂菌，可抽取加倍数量的样品重检，个别瓶仍有杂菌，则作为污染杂菌处理。

附注：

1 T.G培养基上层1/3变红时，需煮沸驱氧后再用，但不宜反复驱氧。 2 无菌检验用培养基灵敏度测定方法和标准 2.1 菌种

2.1.1 需氧和兼性厌氧菌菌株 大肠杆菌C839株、乙型溶血性链球菌C55943株。 2.1.2 厌氧菌菌株 破伤风梭状芽孢杆菌C067株。 2.1.3 霉菌菌株 杂色曲霉菌、腊叶芽枝霉菌。 2.2 方法

2.2.1 大肠杆菌接种于普通琼脂斜面；乙型溶血性链球菌接种于血液琼脂斜面；破伤风梭状芽孢杆菌接种于厌气肉肝汤培养基，置35～37℃培养24～48小时。乙型溶血性链球菌和大肠杆菌的培养物刮入0.1%蛋白胨水内制成均匀菌液；破伤风菌先将菌液吸入灭菌

的离心管内，经3000r/min离心15分钟，弃去上清液，沉淀菌泥用0.1%蛋白胨水制成菌悬液，将菌液稀释至与麦氏比浊管第3管相同浓度，然后用0.1%蛋白胨水作10倍系列稀释。

2.2.2 霉菌菌株杂色曲霉和腊叶芽枝霉菌接种马铃薯培养基，置24～26℃培养5～7日，用0.1%蛋白胨水洗下菌苔，移入装有玻璃珠的大管中，将孢子打散，经装有脱脂棉注射器滤过，将菌液稀释至与麦氏比浊管第3管相同浓度，然后用0.1%蛋白胨水作10倍系列稀释。

2.2.3 将10-5～10-9菌液各1ml，分别接种试验用培养基9ml，每个稀释度至少接种3管，并用未接种过的培养基作对照。需氧菌、厌氧菌置35～37℃培养5日，霉菌置24～26℃培养5日，逐日观察。

2.3 判定 以接种后培养基管数的至少2/3数量的管中有菌生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，重复3次试验，以其中2次达到的最高灵敏度为判定标准。

乙型溶血型链球菌（C55943株）及大肠杆菌（C839株）的灵敏度应达到10-8；破伤风梭状芽孢杆菌（C067株）的灵敏度应达到10-7；杂色曲霉菌、腊叶芽枝霉菌的灵敏度应达到10-6。

静脉致病指数（IVPI）的测定

取6周龄SPF鸡10支，静脉接种10-1稀释的含量尿液0.1ml，另取2只接种生理盐水作对照。每日在接种的相应时间观察，记录接种鸡情况，分正常、发病（鸡只蜷缩在一起不愿运动，不愿采食和饮水，但无明显翅、腿麻痹表现）、麻痹（翅、腿明显不协调，翅膀下垂）和死亡。

观察10日后，累计正常、发病、麻痹和死亡动物数，根据不同权值（正常为0，发病为1，麻痹为2，死亡为3）累计总分数。

IVPI为累计总分除以正常、发病、麻痹和死亡动物的累计总数。如：

静脉致病指数测定表 观 察 天 数 接种鸡总和 权值 总分 状态 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 正常 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 发病 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 麻痹 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 8 2 16 死亡 0 2 10 10 10 10 10 10 10 10 82 3 246 总和 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 100 262 262

IVPI= =2.62

100

脑内致病指数（ICPI）的测定

取1日龄SPF雏鸡10只，各脑内注射10-1稀释的新鲜的含毒尿液0.05ml（接种针头直径0.45mm，长5mm）。另取2只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05ml。

接种后，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常（活动灵活，行动无供济失调现象）、发病（包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡）和死亡。

观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值（正常为0，发病为1，死亡为2）累计总分数。

ICPI为累计总分除以正常、发病、和死亡鸡的累计总数的平均值。如表：

脑内致病指数测定表 观 察 天 数 接种鸡总和 权值 总分 状态 1 2 3 4 5 6 7 8 正常 10 9 9 6 6 6 6 6 58 0 0 发病 0 1 0 3 0 0 0 0 4 1 4 死亡 0 0 1 1 4 4 4 4 18 2 36 总和 10 10 10 10 10 10 10 10 80 40 40

IVPI= =0.5

80

鸡胚最小致死量的平均致死时间（MDT/MLD）的测定

用灭菌生理盐水将新收获的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度，分别接种10日龄鸡胚，上午8点每个稀释度接种5个鸡胚，每胚尿囊内注射0.1ml，作记号“B”。接种后，每日上午8点，下午5点，A、B组各照蛋1次，记录每一鸡胚的死亡时间，并测定每胚血凝（HA）活性。

观察7日后，将所有活胚冷却‘，测定每胚HA活性。

上午和下午接种的鸡应全部死亡的最高稀释度即为最小致死量。然后计算最小致死量的平均死亡时间。

中和试验法

1 固定病毒稀释血清法 将病毒稀释成每单位剂量含200或100LD50（EID50、TCID50）,与等量系列稀释的待检血清混合，37℃放置1小时（另有要求除外）。每一稀释度接种3～6只动物（鸡胚、细胞培养物）。接种后记录每组动物（鸡胚、细胞培养物）的存活数和死亡数（或有无CPE的细胞培养物数），然后计算其半数保护量（PD50）或半数感染量（EID50、TCID50），能使50%动物（鸡胚、细胞培养物）保护的最高血清稀释度即为该血清的中和效价。

试验示例 血清稀释度 死亡（CPE） 死亡 存活 累计结果 （病毒定量） 比例 （CPE） （无CPE） 死亡（CPE） 存活（无CPE） 死亡（CPE）% -0.601：4（10） 0/4 0 4 0 9 0 -1.201：16（10） 1/4 1 3 1 5 17 -1.811：（10） 2/4 2 2 3 2 60 -2.411：256（10） 4/4 4 0 7 0 100 -3.011：1024（10） 4/4 4 0 11 0 100 从表可见PD50介于10-1.20和10-1.81之间，按Read和Muench法计算。

50% －低于50%的死亡（CPE）百分率

距离比例=------------------------------------------------------------

高于50的死亡（CPE）百分率－低于50% 的死亡（CPE）的死亡率

50－17

= ---------- = 0.77

60－17

按公式：低于50%死亡（CPE）百分率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释系列对数= －1.20＋0.77×lg1/4=－1.20+0.77×（－0.6）=－1.20－0.46=－1.66。

查对数表得－1.66的反对数=0.0218（1：45.9），表明该血清在1：45.9稀释时刻保护50%的动物（鸡胚、细胞培养物）免于死亡（或出现CPE）。

2 固定血清稀释病毒法 将病毒原液作10倍系列稀释，分装到两列无菌试管中，第一列加等量正常血清（对照组），第二列加待检血清（试验组），混合后37℃放置1小时（另有要求除外），然后每组分别接种3～6只实验动物（鸡胚或细胞培养物），记录每组实验动物（鸡胚或细胞培养物）死亡数（或出现CPE数）分别计算两组的LD50（EID50、TCID50），求中和指数。

试验示例 病毒稀释度 10-1 10-2 10-3 104 10-5 10-6 10-7 LD50 中和指数 对照血清度 4/4 3/4 1/4 0/4 10-5.5 10-3.3=1995 -2.2待检血清度 4/4 2/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10 -2.2

-3.3试验组LD10 50 中和指数=--------------- = ------- = 10=1995

-5.5

对照组LD50 10

病毒半数致死（感染）量（LD50、EID50、TCID50）的测定

将病毒悬液作10倍系列稀释，取适宜稀释度的病毒定量接种动物（鸡胚、细胞培养物），由最高稀释度开始，每一稀释度接种4～6只（管、瓶、孔），观察记录动物（鸡胚、细胞培养物）死亡数或病变情况，计算各稀释度死亡或病变动物（鸡胚、细胞培养物）的百分率。按Read和Muench法计算病毒半数致死（感染）量（LD50、EID50、TCID50）。

试验举例（以TCID50为例），接种量为0.1ml。 观察结果 累计结果 病毒稀释 CPE数 无CPE数 CPE（%） CPE数 无CPE数 CPE（%） 10-4 6 0 100 13 0 100 10-5 5 1 83 7 1 88 10-6 2 4 33 2 5 29 10-7 0 6 0 0 11 0 88%－50% 距离比例 = ------------ = 0. 88%－29% logTCLD50=高于50%的病毒稀释度的对数+稀释系列的对数=－5+0.×（－1）=－5.

则：TCLD50=10-5./0.1ml

即：将病毒悬液作10-5.稀释后，给细胞培养物接种0.1ml，可以使50%的细胞产生CPE。

细胞培养用营养液及溶液配制

配制细胞培养液和各种溶液，应使用分析纯级化学药品和灭菌双蒸水或去离子水。 1 平衡盐溶液

1.1 汉克氏液（Hank’s液）

10倍浓缩液 每1000ml含

甲液 氯化钠 80g 氯化钾 4g 氯化钙 1.4g 硫酸镁（含7个结晶水） 2g 乙液 磷酸氢二钠（含12个结晶水） 1.52g 磷酸二氢钾 0.6g 葡萄糖 10g 1%酚红溶液 16ml

甲于乙按顺序分别溶于双蒸水中450ml中，然后将乙液缓缓加入甲液，边加边搅拌。补双蒸水至1000ml，用滤纸滤过后，加入氯仿2ml，置2～8℃保存。使用时，用双蒸水稀释10倍，经116℃灭菌15分钟。使用前，以7.5%碳酸氢钠溶液将PH值调至7.2～7.4。

1.2 欧氏液（Earle’s液）

10倍浓缩液 每1000ml含

氯化钠 68.5g 氯化钾 4g 氯化钙 2g 硫酸镁(含7个结晶水) 2g 磷酸二氢钠（含1个结晶水） 1.4g 葡萄糖 10g 1%酚红溶液 20ml

其中氯化钙应单独用双蒸水100ml溶解，其他试剂顺序溶解后，在加入氯化钙溶液，燃后补足双蒸水至1000ml。用滤纸滤过后，加入氯仿2ml，置2～8℃保存。使用时，用双蒸水稀释10倍，经116℃灭菌15分钟。使用前，以7.5%碳酸氢钠溶液将PH值调至7.2～7.4。

1.3 磷酸缓冲盐水（0.01mol/L）PBS

1.3.1 磷酸二氢钠（0.2mol/L）溶液和磷酸二氢钠（0.2mol/L）溶液的配制（附录427页）。

1.3.2 按所需的PH值，查表（附录427页），按比例混合二液，即为磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）（PB）母液。

1.3.3 将上述的母液用双蒸水稀释20倍，并按0.85%加入氯化钠，即得。

2 7.5%碳酸氢钠溶液

碳酸氢钠 7.5g 双蒸水 100ml

用微孔或赛氏滤器滤过除菌，分装于小瓶中，冷冻保存。 3 指示剂 3.1 1%酚红溶液

3.1.1 氢氧化钠液（1mol/L）的制备 取澄清的氢氧化钠饱和液56ml，加新煮沸过的冷双蒸水使成1000ml，即得。

3.1.2 称酚红10g加氢氧化钠（1mol/L）20ml搅拌，溶解并静置片刻，将以溶解的酚红溶液倾入1000ml刻度容器内。

3.1.3 未溶解的酚红再加氢氧化钠溶液（1mol/L）20ml，重复上述操作。如未完成溶解，可再加入少量氢氧化钠（1mol/L），但总量不超过60ml。 3.2 0.1%中性红溶液

氯化钠 0.85g 中性红 0.1g 双蒸水 100ml

溶解后，116℃灭菌15分钟，2～8℃保存。

4 细胞分散液

4.1 0.25%胰蛋白酶溶液

氯化钠 8g 氯化钾 0.2g 枸橼酸盐（含5个结晶水） 1.12g 磷酸二氢钠（含2个结晶水） 0.056g 碳酸氢钠 1g 葡萄糖 1g 胰蛋白酶 （1：250）2.5g 双蒸水 加至1000ml

放2～8℃过夜，待胰酶充分溶解后，用0.2μm的微孔滤膜或G6型玻璃滤器滤过除菌。分装于小瓶中，-20℃保存。 4.2 EDTA-胰蛋白酶分散液

10倍浓缩液每1000ml含

氯化钠 80g 氯化钾 4g 葡萄糖 10g 碳酸氢钠 5.8g 胰蛋白酶（1：250） 5g 乙二胺四醋酸二钠（EDTA） 2g 1%酚红溶液 2ml 青霉素溶液（10万单位/ml） 10ml 链霉素溶液（10万μm/ml）10ml

前6种成分依次溶解于双蒸水900ml中，再加入后3种溶液。补足双蒸水至1000ml，用0.2μm的微孔滤膜或G6型玻璃滤器滤过除菌。分装于小瓶中，-20℃保存。

使用时加双蒸水稀释10倍，分装小瓶，-20℃冻存备用。

分散细胞前，先将细胞分散液经35～37℃预热，用7.5%碳酸氢钠将pH值调至7.6～8.0。

5 营养液 5.1 0.5%乳汉液

水解乳蛋白 5g 汉克氏液 1000ml

完全溶解后分装，经116℃灭菌15分钟，2～8℃保存备用。同时，以7.5%碳酸氢钠溶液将PH值调至7.2～7.4。 5.2 0.5%乳欧液

水解乳蛋白 5g 欧氏液 1000ml

完全溶解后分装，经116℃灭菌15分钟，2～8℃保存备用。同时，以7.5%碳酸氢钠溶液将PH值调至7.2～7.4。

5.3 依格氏最低要素培养基（E-MEM）和119培养基；按商品说明现配现用。 5.4 3%谷氨酰胺溶液

L-谷氨酰胺 3g 双蒸水 100ml

溶解后，经滤器滤过除菌，分装小瓶，-20℃保存备用。使用前，每100ml细胞营养液中加3%谷氨酰胺溶液1ml。 5.5 5%胰蛋白眎磷酸盐肉汤

5.5.1 先配制磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）

氯化钠 8g 氯化钾 0.2g 磷酸二氢钠 0.91g 按顺序溶于双蒸水中至1000ml。 5.5.2 称取牛肉浸膏20g，加PBS液500ml。 5.5.3 称取胰蛋白眎50g，加PBS400ml。

5.5.4 将5.5.2和5.5.3两种溶液混合，补足PBS至100ml。

5.5.5 用普通滤纸滤过，用氢氧化钠溶液（1mol/L）将批pH值调至7.2～7.4。分装小瓶中，116℃灭菌15分钟。置2～8℃保存备用。

细胞制备方法

1 鸡胚成纤维细胞（CEF）单层的制备 选择9～10龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿内，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌的剪刀剪成米粒大的小组织块，再用汉克氏液洗2～3次，然后加0.25%的胰酶溶液（每个鸡胚约加4ml），在37.5～38.5℃水浴中消化20～30分钟，吸出胰酶溶液，用汉克氏液洗2～3次，再加入适量的营养液（用含5%～10%犊牛血清乳汉液，加适宜的抗生素适量）吹打，用4～6层纱布滤过，制成每1ml含活细胞数约100～150万的细胞悬液，分装于培养瓶中（每1000ml圆瓶加入细胞悬液1000ml），进行培养（每小时转速以9～11转为宜）。形成单层后备用（一般在24小时内应用）。

2 鸡胚皮肤细胞单层的制备

方法（1） 选择12～13日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精脱脂棉脱碘，无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃器皿中，用汉克氏液洗涤胚体，再用灭菌的眼科镊子将皮肤轻轻扒下，用剪刀在广口玻璃瓶中剪碎并用汉克氏液洗2次后，用0.25%的胰酶溶液（每个鸡胚约加4ml）在37.5～38.5℃水浴消化20～25分钟，然后吸出胰酶溶液，加入适当的营养液吹打，用4层纱布滤过，制成每1ml含活细胞数约100万的悬液，分装于培养瓶中（1000ml克氏瓶加入细胞悬液120ml），放入30℃培养箱培养。形成单层后即可进行病毒接种（一般在培养后24小时内应用）。

方法（2） 选择12～13日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘，无菌取出鸡胚，方灭菌的烧杯中，用汉克氏液洗涤胚体，再用灭菌的镊子将胚夹入另一个放磁棒的灭菌三角瓶中，加37℃的0.25%胰酶溶液（每个鸡胚8～10ml），放在磁力搅拌器上以低速搅拌消化约20～25分钟，取出加入适量的含血清的汉克氏液中止消化。然后将胰酶及消化下来的细胞（即鸡胚皮肤细胞）液倒出，底部液用一层纱布滤过。经1000r/min离心10分钟，去上清液，加入适当的培养液吹打分散细胞，用4层纱布滤过。根据细胞数和加入所需的营养液，制成每1ml含活细胞数约100

万的细胞悬液，分装于培养瓶中（1000ml克氏瓶加入细胞悬液120ml），培养向上，并用于接毒。

3 鸡胚肝细胞的制备 选择12～14日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉再用酒精棉消毒气室部位，以无菌手术取出胎儿的肝脏，剪碎后，用汉克氏液洗2～3次，加入0.25%的胰蛋白酶溶液，置室温消化2～5分钟，吸出胰酶液，用汉克氏液洗2～3次。加入适量汉克氏液吹打后，以1000r/min离心5分钟。弃上清液，用营养液将沉淀细胞悬浮并用一层铜网（80～100目）或4～6层纱布过滤，制成细胞悬液，营养液为199或MEN，10%小牛血清，10%胰蛋白眎 磷酸盐肉汤及适量抗生素，用7.5%碳酸氢钠液调PH至7.0～7.2。稀释成每1ml含细胞数约5×106，分装于细胞瓶中，37℃进行培养，形成单层后即可接种。

4 地鼠或乳兔肾细胞单层的制备（用于牛、羊伪狂犬病疫苗） 选10～20日龄的地鼠或乳兔，放血致死后，无菌采集肾脏，将其皮质组织剪成1～2mm小块，用汉克氏液洗2～3次后，按组织重量的五倍，加入0.25%胰酶-汉克氏液（PH7.4～7.6），置36～37℃水浴消化30～40分钟，除去胰酶溶液后，用细胞生长液制成每1ml含60～80万细胞的悬液。细胞置37℃培养，2～4日形成单层。