学习目标：利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数。 重点与难点：对土样的选取和选择培养基的配制、对分解尿素的细菌的计数 自主预习
一、课题背景 1、尿素是一种重要的氮肥，农作物_________（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为 ，这是因为细菌能合成 。
2、科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为 这样也适用于实
验室中微生物的筛选，原理是 。
点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等
选择目的微生物。
〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是 ，提供氮源的的是 ，琼脂的作用是 。 〖思考2〗该培养基对微生物 （具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是 。
3、在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是 。除此之外，
也是测定微生物数量的常用方法。
【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。
公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量
4、 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于 。通过统计 ，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。 〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是 。〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是 。 〖思考5〗第 位同学的结果接近真实值。你认为这两位同学的实验需要改进的操作
是 。 5、统计的菌落数比活菌的实际数目 。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是 菌落。因此，统计结果一般用 来表示。
6、设置对照的主要目的是 。 7、对照实验是指除了 的条件外，其他条件都 的实验。满足该条件的称为 ，未满足该条件的称为 组。
〖思考6〗请设计本实验的对照实验组：
。 二、实验设计
1、实验设计的内容包括 、 、 和 等。 2、根据图示2－7填写以下实验流程：
3 、土壤微生物主要分布在距地表 cm的近 性土壤中，约 为细菌。
4、分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是 ，其目的是保证获得 的平板。细菌稀释度为 ，放线菌稀释度为 ，真菌稀释度为 。
5、 培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在 ℃培养1～2d，放线菌一般在 ℃培养5～7d，霉菌一般在 ℃的温度下培养3～4d。
6、在菌落计数时，每隔 h统计一次菌落数目。选取 时的记录作为结果，以防止因 而导致遗漏菌落的数目。 点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉
眼可观察到的菌落。
7、菌落的特征包括 等方面。 〖思考7〗土壤微生物种类最多、数量最大的原因 8、 实验过程 1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要 。 2）应在 旁称取土壤 g。将称好的土样倒入盛有 mL无菌水的 中，塞好棉塞。 3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在 旁进行。
4）实验时要对 作好标记。注明 等。
5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当 。
〖思考8〗在研究未知微生物时务必规范操作，以防被 感染，实验后一定要洗手。 三．结果分析与评价 1、对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助 的方法。
2、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 将尿素分解成了 。氨会使培养基的碱性 ，PH 。因此，我们可以通过检测培养基 变化来判断该化学反应是否发生。 3、在以 为唯一氮源的培养基中加入 指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变 ，说明该细菌能够 。
〖思考9〗测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现 ，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取 个水样。 （三）课堂总结、点评 土壤有利于目的菌株生长 中尿分离筛选微生物的原理 人为 条件 抑制或阻止其他微生物生长 素分 解菌微生物计数方法与原理 稀释涂布平板法 的分显微镜直接计数
离与对照设置与重复设置
计数 实验设计 实验方案 实验操作 结果与分析 参考答案：
一、基础知识
1．不能 氨和CO2 脲酶 2．热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物 原理是：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 〖思考1〗 葡萄糖 尿素 凝固剂
〖思考2〗 具有 只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长 3．稀释涂布平板法 显微镜直接计数 4．样品稀释液中一个活菌 平板上的菌落数 30～300 〖思考3〗（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数 〖思考4〗 恰当的稀释度
〖思考5〗二 第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验 5．低 一个 菌落数 6．排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 7． 被测试 相同 对照组 实验
〖思考6〗方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。 方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。
二．实验设计
1．实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。 2．根据图示2－7填写以下实验流程：
配制土壤溶液 系列稀释 涂布平板与培养 菌落计数 3． 3～8cm 近中 70％～80％ 4．不同微生物在土壤中含量不同， 菌落数在30～300之
间、适于计数 104、105、106， 103、104、105， 102、103、104
。 5． 30～37 25～28 25～28 6． 24 菌落数目稳定 培养时间不足 7． 形状、大小、隆起程度、颜色 〖思考7〗土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。 8．实验过程 1）灭菌。 2） 火焰 10 g。 90mL 锥形瓶 3） 火焰 4） 培养皿 培养基类型、培养时间、稀释度、培养物 5）事先规划时间。 〖思考8〗致病微生物 三．结果分析与评价
1．生物化学 2．脲酶 氨 增强 升高 pH 3．尿素 酚红 红 分解尿素 〖思考9〗伊红美蓝 黑 三 四、自测
1、（2010·全国1高考）下列是与微生物培养有关的问题，请回答：
某细菌固体培养基的组成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是 ，碳源是 ，氮源是 。已知只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于 培养基。按照化学成分分类，该培养基属于 ＿培养基。从同化作用类型上看，用该培养基培养的细菌属于 。
2．某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。
（1）培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了氮源和 。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是 和 。
（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是 。
（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于 中培
养，培养的温度设定在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种 作为对照进行实验。
（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有 种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越 。
（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐 细菌，这种培养基（按功能分）被称为 。
3.下图是生物兴趣小组为研究“某品牌酸奶中乳酸菌种类及其耐药情况”而制定的流程图。请分析回答：
（1）与酵母菌相比，乳酸菌在结构上的主要区别是 。
（2）本研究使用的细菌培养基中特别加入了一定量的碳酸钙，乳酸菌在 （生理过程）中产生的乳酸能与不溶性的碳酸钙生成可溶性的乳酸钙，从而在菌落周围形成溶钙圈。从物理形态分析，本研究使用的培养基属于 （类型）。分离的方法可用 。 （3）在利用高压蒸汽灭菌锅对培养基灭菌时，锅内水加热煮沸后，必须 ，以保证锅内气压上升，达到121 ℃。灭菌后的培养基应适当冷却后，在 附近倒平板。 （4）请完善“检测乳酸菌对青霉素、四环素耐药性”实验操作步骤：
步骤1：分别取 、四环素、 加入三组无菌培养皿中，再加入灭菌并冷
却到50 ℃左右的培养基，立即混匀，静置凝固成平板。
步骤2：向三组培养基中分别接种待检测的乳酸菌菌种。
步骤3：将接种后的三组培养基和一个 都置于适宜温度等条件下培养若干
天，观察比较培养基中菌落生长情况。 4.Ⅰ.白僵菌高孢粉是国家林业局推广的高效生物杀虫剂之一，应用于多种林木和农作物害虫的防治。白僵菌分生孢子在寄主表皮、气孔或消化道上，遇适宜条件开始萌发，生出芽管。同时产生脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶等溶解昆虫的表皮，通过芽管入侵虫体，在虫体内生长繁殖，消耗寄主体内的养分，产生各种毒素，形成大量菌丝和孢子，布满虫体全身。 请根据上述材料回答下面的问题。
(1)从自然菌样中筛选较理想的生产用菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→ →性能测定。白僵菌的菌样应从 中采集。
(2)分离白僵菌菌种的培养基属于 培养基。在配制白僵菌培养基时常加入蔗糖、硫酸铵、硝酸钾等成分，蔗糖属于 (营养物质)。
Ⅱ.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。步骤如下： (1)制备稀释倍数为102
、103
、104
、105
、106
的系列稀释液。 (2)用“稀释涂布平板法”接种样品。 (3)适宜温度下培养。
①为测定大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106
的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是
A．一个平板，统计的菌落数是23
B．两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24 C．三个平板，统计的菌落数分别为21、5和52，取平均值26 D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25
②一同学在对应稀释倍数为106
的培养基中，测得平板上菌落数的平均值为，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为 mL) 。 ③用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量 。
④某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了 。
5.[2014高考生物——选修1：生物技术实践]（15分）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是__________________________________________；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37, 据此可得出每升水样中的活菌数为___________。
（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过___________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是___________。 （3）示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
（4）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养，结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。 参考答案：1、琼脂 葡萄糖 尿素 选择 合成 异养型 2、（1）碳源 无机盐 水 （2）高压蒸汽灭菌 （3）恒温培养箱 无菌水 （4）多 高（5）盐（或NaCl） 选择性培养基
3.（1）细胞内没有核膜包被的细胞核（或“没有核膜”） （2）无氧呼吸 固体培养基 平板划线或稀释涂布平板法 （3）将锅内冷空气彻底排除 酒精灯火焰 （4）步骤1：等量的青霉素、 无菌水 步骤3：未接种的培养基
4．(1)纯种分离 感病昆虫 (2)选择 碳源 ①D ②×108
③多 ④不能 5、（1）检测培养基平板灭菌是否合格
×10
7
（2）灼烧 将聚集的菌体逐步稀释
以便获得单个菌落 （3）B （4）溶解氧 营养物质 1、下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是 ( )
A．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂、水 B．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、琼脂、水 C．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、尿素、琼脂、水
D．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水；
2、某同学在稀释倍数为106
的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为 ( ) A．×108
B．×109
C．234 D．
3、在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106
培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因可能有( )
①由于土样不同 ②由于培养基污染 ③由于操作失误 ④没有设置对照 A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④ 4、关于土壤取样的叙述错误的是( )
A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤 B．先铲去表层土3cm左右，再取样 C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌 D．应在火焰旁称取土壤 5、下列关于从土壤中分离细菌的操作步骤中，正确的是( )
①土壤取样 ②称取10g土壤取出加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取进行平板涂布 ④依次稀释至101
、102
、103
、104
、105
、106
、107
稀释度
A．①→②→③→④ B．①→③→②→④ C．①→②→④→③ D．①→④→②→③ 6、下列关于测定土壤中细菌数量的叙述，正确的是( ) A．一般选用103
～107
倍的稀液分别涂布
B．测定放线菌的数量，一般选用103
、lO 4
和105
倍稀释 C．测定真菌的数量，一般选用103
、104
和105
倍稀释
D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将101
～107
倍的稀释液分别涂布到平板上培养 7、下列关于微生物的培养叙述错误的是( ) A．细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2 d B．放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7 d C．霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4 d
D．不同种类的微生物，一般需要相同的培养温度和培养时间 8、下列操作需要在火焰旁进行的一组是( )
①土壤取样 ②称取土壤 ③稀释土壤溶液 ④涂布平板 ⑤微生物的培养
A．①②③④⑤ B．②③④⑤④⑤ C．③④⑤ D．②③④ 1A 2．B 3．A 4．C 5．C 6．B 7．D 8．D
9、下列可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是 ( ) A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂 C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂 D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
10、土壤取样时最好选择哪种环境中的土壤做分离细菌的实验( )
A．街道旁 B．花盆中 C．农田中 D．菜园里
11、分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂糖 ④不加琼脂糖 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧ C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦ 9．A 10．D 11C
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