(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105648040 A (43)申请公布日 2016.06.08
(21)申请号 201410632658.4(22)申请日 2014.11.11
(71)申请人上海派森诺生物科技有限公司
地址200231 上海市徐汇区银都路388号16
幢第2层291室(72)发明人孙子奎 高文学 丁方美 王锋
何再平(74)专利代理机构上海晨皓知识产权代理事务
所(普通合伙) 31260
代理人成丽杰(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)C40B 50/06(2006.01)
权利要求书1页 说明书9页 附图2页
(54)发明名称
一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系及文库构建方法(57)摘要
本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系及文库构建方法。该PCR扩增体系包含下述组份：超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mM dNTP 5μl；热启动DNA聚合酶1μl。将该种PCR扩增体系用于全基因组重亚硫酸盐测序过程中对盐处理后的目的片段的PCR扩增步骤，可提高PCR扩增反应的产物浓度，为测序提供足够的上机量。本发明也提供包含上述PCR扩增步骤的重亚硫酸盐测序文库构建方法，该方法可构建足够上机量的甲基化测序文库，有助于全基因组重亚硫酸盐测序的顺利进行。 C N 1 0 5 6 4 8 0 4 0 A CN 105648040 A
权 利 要 求 书
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1.一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包含下述组份：
超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mM dNTP5μl；热启动DNA聚合酶1μl。
2.根据权利要求1所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，其特征在于，所述反应缓冲液为Pfu Turbo Cx反应缓冲液，所述热启动DNA聚合酶为Pfu Turbo Cx热启动DNA聚合酶。
3.一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于，包含下述步骤：
(1)将待测基因组DNA样品片段化，然后对DNA片段进行纯化；(2)将所述DNA片段进行末端修复，得到经末端修复的DNA片段；(3)在所述经末端修复的DNA片段的3’端添加碱基A，得到具有甲基化接头的连接产物；
(4)对所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，回收目的片段；(5)将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，得到盐处理后的目的片段；(6)对所述盐处理后的目的片段进行纯化，然后进行PCR扩增，得到扩增产物：其中，所述PCR扩增的扩增体系包含下述组份：超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mM dNTP5μl；热启动DNA聚合酶1μl；
(7)分离纯化所述扩增产物，即得到全基因组重亚硫酸盐测序文库。
4.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的待测基因组DNA样品的用量为5μg以上。
5.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的待测基因组DNA来源于细菌或病毒。
6.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中将待测基因组DNA样品片段化时，采用超声打断仪对待测基因组DNA进行打断。
7.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用2％的琼脂糖凝胶电泳的方法对具有甲基化接头的连接产物进行片段选择。
8.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中对纯化后的目的片段进行PCR扩增时，PCR扩增反应程序为：95℃5分钟；98℃30秒；以98℃10秒、65℃30秒、72℃30秒为一个循环，进行12个循环；72℃5分钟；最后在4℃下保存。
9.根据权利要求3所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中采用磁珠法对扩增产物进行分离纯化。
10.根据权利要求3至9中的任一项所述的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，其特征在于，所述的全基因组重亚硫酸盐测序为采用高通量测序仪进行的测序。
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说 明 书
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一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系及文
库构建方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序
技术中的PCR扩增体系及文库构建方法。
[0001]
背景技术
DNA甲基化修饰是一种基因表达调控的重要手段，对个体的正常发育起至关重要
的作用，若甲基化调控机制出现问题，可使机体功能发生异常，导致一些疾病的发生，因此DNA甲基化的检测对一些基因相关疾病的研究具有重要意义。DNA甲基化主要发生于GC含量较高的CpG岛。甲基化测序的方法有很多种，如全基因组甲基化测序，甲基化DNA免疫共沉淀测序，甲基结合蛋白测序，简化甲基化测序等。
[0003] 重亚硫酸盐测序(Bisulfite-Seq)即是将Bisulfite处理与高通量测序技术相结合，从而来绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，用于研究特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联，为疾病发生、治疗相关的研究提供研究基础。通过全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)可以检测甲基化状态：DNA样品经重亚硫酸氢盐处理后，非甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶保持不变；盐处理的DNA样品经PCR扩增后，尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T)；对PCR产物进行测序，并与未处理的序列比对，检测甲基化的位点[0004] 在重亚硫酸盐测序的文库构建过程中，目的片段经重亚硫酸盐处理后，需进行PCR扩增。但是，按照目前常规方法，经盐处理后大部分的DNA已破坏，纯化后的DNA浓度已经很低，经分装每管的DNA浓度更低，导致PCR产物少，甚至达不到2100检测浓度的最低要求。
[0002]
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种应用于重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，通过对体系组成的改变，提高PCR扩增反应的产物浓度，为测序提供足够的上机量。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种应用于重亚硫酸盐测序的文库构建方法，该文库构建方法包含了利用上述的PCR扩增体系对目的片段进行扩增的步骤，使所构建的文库达到上机测序量的要求。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，所述扩增体系包含下述组份：[0008] 超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mM dNTP 5μl；热启动DNA聚合酶1μl。[0009] 优选地，本发明的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系中，反应缓冲液为Pfu Turbo Cx反应缓冲液，热启动DNA聚合酶为Pfu Turbo Cx热启动DNA聚合酶。
[0005]
本发明的实施方式所提供的上述应用于全基因组重亚硫酸盐测序的PCR扩增体
系，相对于常规的重亚硫酸盐测序的PCR扩增体系，在反应体系组成的成分配比上进行了
[0010]
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改变，将该种体系用于重亚硫酸盐测序过程中对目的片段进行PCR扩增，可实现提高PCR扩增产物的浓度的目的。
[0011] 本发明的实施方式还提供了一种应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法，该方法包含下述步骤：
[0012] (1)将待测基因组DNA样品片段化，然后对DNA片段进行纯化；[0013] (2)将所述DNA片段进行末端修复，得到经末端修复的DNA片段；[0014] (3)在所述经末端修复的DNA片段的3’端添加碱基A，得到具有甲基化接头的连接产物；
[0015] (4)对所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，回收目的片段；[0016] (5)将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，得到盐处理后的目的片段；[0017] (6)对所述盐处理后的目的片段进行PCR扩增，得到扩增产物：[0018] 其中，所述PCR扩增的扩增体系包含下述组份：[0019] 超纯水19μl；DNA模板15μl；反应缓冲液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mM dNTP 5μl；热启动DNA聚合酶1μl；[0020] (7)分离纯化所述扩增产物，得到全基因组重亚硫酸盐测序文库。[0021] 优选地，在本发明的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(1)中的待测基因组DNA样品的用量为5μg以上，且待测基因组DNA来源于细菌或病毒。[0022] 优选地，在本发明的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(1)中将待测基因组DNA样品片段化时，采用超声打断仪对待测基因组DNA进行打断。
[0023] 优选地，在本发明的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(4)中采用2％的琼脂糖凝胶电泳的方法对具有甲基化接头的连接产物进行片段选择。
[0024] 优选地，在本发明的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(6)中对盐处理后的目的片段进行PCR扩增时，PCR扩增反应程序为：95℃5分钟；98℃30秒；以98℃10秒、65℃30秒、72℃30秒为一个循环，进行12个循环；72℃5分钟；最后在4℃下保存。[0025] 优选地，在本发明的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，步骤(7)中采用磁珠法对扩增产物进行分离纯化。[0026] 此外，在本发明的实施方式所提供的应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，所述的全重亚硫酸盐测序为采用高通量测序仪进行的测序。
[0027] 本发明的实施方式所提供的上述应用于全基因组重亚硫酸盐测序的文库构建方法中，由于使用了改进的PCR扩增体系进行对目的片段的PCR扩增，达到了以下效果：(1)使扩增后的PCR产物量有了明显的增加，用2100芯片进行检测，达到上机测序的要求；(2)
减少了扩增反应中所用到的试剂的消耗量；只用一个反应体系进行目的片段的PCR扩增，
(3)为后续纯化步骤减少工作量，很大程度上提高了工作效率。附图说明
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图1是实施例1中对目的片段进行PCR扩增后产物的凝胶电泳图；
[0029] 图2是对比实验例中采用常规方法对目的片段进行PCR扩增后产物的凝胶电泳图；
[0030] 图3是用2100芯片对实施例1制备得到的测序文库进行检测的结果图；
[0031] 图4是用2100芯片对对比实验例中采用常规方法制备得到的测序文库进行检测的结果图。
具体实施方式
[0032] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
[0033] 实施例1
[0034] 本实施例所使用的试剂、试剂盒：[0035] (1)安捷伦(Agilent)：高保真CX热启动DNA聚合酶(Pfu Turbo cx Hotstart DNA Polymerase)
[0036] (2)德国凯杰(QIAGEN)：亚硫酸氢盐处理试剂盒(EpiTect Bisulfite Kit)
[0037] (3)Illumine DNA建库试剂盒(TruSeq DNA Sample Preparation Low Throughput(LT)Kit)
[0038] 1.DNA起始量定量[0039] 注：本试验所使用的DNA起始量为5μg。[0040] 2.DNA片段化
[0041] (1)提前将超声打断仪打开降温至6℃以下；
[0042] (2)DNA样品(虎纹蛙病毒(TFV)DNA)用1×TE稀释至130μl，用枪吹打混匀，转移全部溶液至洁净干燥雾化杯中，打断至200bp。[0043] 3.DNA片段的纯化
[0044] (1)在片段化的DNA中加入3倍体积的PCR-A溶液，混匀转入纯化柱每次最多700μl，10000rpm离心1min,弃掉废液；[0045] (2)加入700μl W2溶液，10000rpm离心1min，弃掉废液；[0046] (3)重复一次步骤(2)；[0047] (4)12000rpm空离2min；[0048] (5)打开管盖室温晾3min后，将柱子转到一个新的1.5ml管上；[0049] (6)加入55μl Elute溶液，盖上柱子管盖，室温孵育2min；[0050] (7)12000rpm离心2min，将溶液重新吸入柱子再离心，弃掉柱子，盖紧管盖。[0051] 4.末端修复
[0052]
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调枪至100μl，上下吹打10次混匀，盖紧管盖；[0054] 将PCR管放入30℃的PCR仪中，盖紧热盖，孵育30min。[0055] (2)AMPure XP Beads纯化
[0056] a将AMPure XP Beads震荡均匀，取160μl至产物PCR管中，调枪至200μl，上下吹打10次混匀，室温孵育15min；[0057] b将PCR管置磁力架上，室温孵育15min，珠子吸附成团，溶液变透明，用枪将上清液移去，不要碰到珠子；
[0058] c加入200μl 80％的乙醇，室温孵育30s，弃掉废液；[0059] d重复步骤c一次；
[0060] e保持PCR管在磁力架上，室温孵育10-15min，观察到珠子有裂纹后，将PCR管取下；
[0053]
f加入17.5μl Resuspension Buffer，用枪上下吹打10次混匀，盖好管盖，室温
孵育2min；
[0062] g将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min，溶液变透明；
[0063] h转移15μl上清液至新PCR管中(-20℃保存过夜或进行下一步骤)。[0064] 5.3，端加A[0065] 准备：A-Tailing Control、A-Tailing Mix、Resuspension Buffer置于冰上解冻；0.3ml PCR管，设置37℃PCR恒温。
[0061] [0066]
调枪至30μl，上下吹打10次混匀，盖紧管盖；[0068] 将PCR管放入37℃的PCR仪中，盖紧热盖，孵育30min，取出后立即进行下一步骤。[0069] 6.接头连接
[0067] [0070]
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调枪至37.5μl，上下吹打10次混匀，盖紧管盖；[0072] 将PCR管放入30℃的PCR仪中，盖紧热盖，孵育10min取出；[0073] 加入5μl Stop Ligation Buffer，调枪至42.5μl，上下吹打10次混匀。[0074] (2)AMPure XP Beads一次纯化[0075] a将AMPure XP Beads震荡均匀，取42.5μl至产物PCR管中，调枪至85μl，上下吹打10次混匀，室温孵育15min；[0076] b将PCR管置磁力架上，室温孵育15min，珠子吸附成团，溶液变透明，用枪将上清液移去，不要碰到珠子；
[0077] c加入200μl 80％的乙醇，室温孵育30s，弃掉废液；[0078] d重复步骤c一次；
[0079] e保持PCR管在磁力架上，室温孵育10-15min，观察到珠子有裂纹后，将PCR管取下；
[0080] f加入52.5μlResuspension Buffer，用枪上下吹打10次混匀，盖好管盖，室温孵育2min；
[0081] g将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min，溶液变透明；[0082] h转移50μl上清液至新PCR管中。[0083] (3)AMPure XP Beads二次纯化
[0084] a将AMPure XP Beads震荡均匀，取50μl至一次纯化产物PCR管中，调枪至100μl，上下吹打10次混匀，室温孵育15min；[0085] b将PCR管置磁力架上，室温孵育15min，珠子吸附成团，溶液变透明，用枪将上清液移去，不要碰到珠子；
[0086] c加入200μl 80％的乙醇，室温孵育30s，弃掉废液；[0087] d重复步骤c一次；
[0088] e保持PCR管在磁力架上，室温孵育10-15min，观察到珠子有裂纹后，将PCR管取下；
[0089] f加入22.5μlResuspension Buffer，用枪上下吹打10次混匀，盖好管盖，室温孵育2min；
[0090] g将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min，溶液变透明；
[0091] h转移20μl上清液至新PCR管中(-20℃保存过夜或进行下一步骤)。[0092] 7.凝胶回收(片段选择)[0093] 准备：2％琼脂糖凝胶、100bp DNA Marker、6×Loding Buffer、EP管、凝胶纯化试剂盒。
[0071]
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(1)加4μl 6×Loding Buffer到含有接头连接产物的PCR管中，震荡混匀；[0095] (2)将24μl样品加入2％凝胶点样孔中，并点入5-10μl 100bp DNA Marker，120V电泳60min左右。
[0096] (3)电泳结束后在凝胶成像系统下拍照，保存至项目文件夹中；[0097] (4)在紫外灯下切胶，选择300-450bp的范围，转入1.7ml EP管中，称重；
[0098] (5)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A溶液(100mg＝100μl)置70℃干式加热器中融化胶块；
[0099] (6)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B溶液，混匀后转入2ml收集管上的过滤柱中(每次不超过700μl)，DNA片段＜400bp，加入1个凝胶体积的异丙醇，震荡混匀；
[0100] (7)10000rpm离心1min，弃收集管中的废液；[0101] (8)加入500μl W1溶液至柱子中，10000rpm离心1min，弃去废液；[0102] (9)加入700μl W2溶液至柱子中，10000rpm离心1min，弃去废液；[0103] (10)重复步骤(9)一次；[0104] (11)12000rpm空离2min；
[0105] (12)将柱子放入新的1.7ml EP管中，打开管盖，室温晾3min；[0106] (13)加入30μl Elute溶液，盖紧管盖，室温孵育2min；[0107] (14)12000rpm离心2min，将液体重新吸入柱子，再离心一次，弃去柱子，盖紧管盖。
[0108] (15)取3μl回收样品加1μl 6×Loding Buffer混匀，加入1％琼脂糖凝胶孔中，点3μl 2000bp Marker，120V电泳20min，在成像系统拍照保存，剩余样品在-20℃保存或进行下一步骤。[0109] 8.盐处理
[0110] (1)盐处理试剂按下表混合后震荡混匀，稍离心；
[0111]
组分DNA(1ng-2ug)Rnase-free waterBisulfite MixDNA Protect Buffer总体积
[0112]
体积(ul)可变(1-20)可变8535140
DNA solution和RNase-free water的总体积是20μl。[0113] (2)放入PCR仪中，盐处理条件见下表：
[0114]
步骤
温度
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时间
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说 明 书
变性孵育变性孵育变性孵育维持
95℃60℃95℃60℃95℃60℃20℃
5min25min5min85min5min175min∞
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[0115] [0116] [0117] [0118] [0119] 9.纯化
(1)从PCR仪取出盐处理后的产物，稍离心，转入新的1.5ml EP管中；(2)加入310μl含有RNase-free-water-carrier RNA的Buffer BL，震荡离心；(3)加入250μl酒精(96％-100％)，震荡15s，稍离心；(4)将液体转入EpiTect吸附柱中，最大转速离心1min，弃掉废液，柱子放回收集
管中；
(5)加入500μl已加入乙醇的Buffer BW，最大转速离心1min,弃掉废液；(6)加
入500μl已加入乙醇的Buffer BD,盖好盖子，室温孵育20min，最大转速离心1min,弃掉废液；
[0121] (7)加入500μl已加入乙醇的Buffer BW，最大转速离心1min,弃掉废液；[0122] (8)重复步骤(7)一次；
[0123] (9)将吸附柱放入新的2ml收集管中，最大转速离心1min；[0124] (10)将吸附柱放入新的1.5ml EP管中，打开盖子，56℃孵育5min；[0125] (11)将吸附柱放入新的1.5ml EP管中，加入20μl Buffer EB,12000rpm离心1min；
[0126] (12)再加入20μlBuffer EB，最大转速离心1min，弃掉柱子；[0127] (13)加入3倍体积(120μl)的PCR-A溶液，混匀转入新的纯化柱，10000rpm离心1min,弃掉废液；
[0128] (14)加入700μl W2溶液，10000rpm离心1min，弃掉废液；[0129] (15)重复一次步骤(14)；[0130] (16)12000rpm空离2min；
[0131] (17)打开管盖室温晾3min后，将柱子转到一个新的1.5ml管上；[0132] (18)加入17μl Elute溶液，盖上柱子管盖，室温孵育2min；[0133] (19)12000rpm离心2min，弃掉柱子，盖紧管盖。[0134] 10.PCR扩增[0135] (1)反应体系：
[0120] [0136]
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说 明 书
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(2)扩增条件：[0138] a 95℃for 5min[0139] b 98℃for 30s[0140] c 12cycles of:[0141] 98℃for 10s[0142] 65℃for 30s[0143] 72℃for 30s[0144] d 72℃for 5min[0145] e Hold at 4℃
[0146] 11.AMPure XP Beads纯化
[0147] (1)将AMPure XP Beads震荡均匀，取50μl至产物PCR管中，调枪至100μl，上下吹打10次混匀，室温孵育15min；[0148] (2)将PCR管置磁力架上，室温孵育5min，珠子吸附成团，溶液变透明，用枪将上清液移去，不要碰到珠子；
[0149] (3)加入200μl 80％的乙醇，室温孵育30s，弃掉废液；[0150] (4)重复步骤(3)一次；[0151] (5)保持PCR管在磁力架上，室温孵育10-15min，观察到珠子有裂纹后，将PCR管取下；
[0152] (6)加入32.5μlResuspension Buffer，用枪上下吹打10次混匀，盖好管盖，室温孵育2min；
[0137]
(7)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min，溶液变透明；
[0154] (8)转移30μl上清液至新PCR管中，保存于-20℃。[0155] 12.文库检测及定量[0156] (1)1％凝胶电泳检测：取3μl文库跑胶检测，其电泳图见附图1。[0157] (2)浓度检测：用TBS 380检测浓度。[0158] (3)质量检测：取1μl文库用2100芯片进行检测，检测结果如附图3所示。[0159] 实施例2对比试验例
[0160] 采用常规方法制备用于全基因组重亚硫酸盐测序的甲基化文库，其余步骤与实施例1中相同，区别在于操作步骤10，即PCR扩增时，采用下述常规的PCR扩增体系：
[0153]
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说 明 书
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将12μl经盐处理且纯化后的DNA分装于3个PCR管，每管反应体系为：[0162] DNA 4μl[0163] Ultra Pure Water 33.75μl[0164] Pfu Turbo Cx Reaction Buffer 5μl[0165] 10 mM dNTP Mix 1.25μl[0166] PCR Primer Cocktail 5μl[0167] PfuTurbo Cx Hotstart DNA Polymerase 1μl[0168] Total Volume 50μl[0169] 对PCR产物进行凝胶电泳检测，其电泳图参见附图2；同样使用2100芯片对采用上述常规方法所值得文库进行检测，检测结果如附图4所示。[0170] 从附图1和附图3的对比可以看出：在附图1中明显出现了PCR扩增产物的电泳条带，而附图3中则并没有PCR扩增产物的电泳条带。[0171] 此外，从附图2和附图4的对比可以看出：附图2为实施例1中以本发明所提供PCR扩增体系进行扩增后的检测结果，出现明显的目的峰值(273)，附图4为按常规体系扩增的检测结果，未出现相应的目的峰值。因此，常规体系扩增得到的PCR产物浓度较低，不足以满足最低上机测序量；而实施例1中根据本发明所获得的PCR产物的浓度有显著提高，满足后续测序步骤中的上机测序量。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，
而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
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说 明 书 附 图
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图1
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图3
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说 明 书 附 图
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图4
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