VDR基因ApaⅠ,TaqⅠ与慢性阻塞性肺疾病易感性关系研究

顾文超;袁亚平;杨华;吴浩;王林宣;唐志君;邓国平;李珊珊

【摘 要】目的 探讨维生素受体(VDR)基因ApaⅠ(rs7975232)位点和

TaqⅠ(rs731236)位点多态性与慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)发病率之间的关系,以及炎性因子TNF-α、IL-8在不同VDR基因型中的表达情况.方法 收集2015年06月-2016年12月,入住上海市浦东新区人民医院呼吸科,慢阻肺患者80例,同期住院的非慢阻肺患者45例,运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对其血样DNA进行VDR基因ApaⅠ位点及TaqⅠ位点多态性进行检测,分析其基因型、基因频率,并与临床特征比对,统计分析其相关性.结果 慢阻肺患者与非慢阻肺患者(对照组)比较,ApaⅠ位点基因型分布具有差异(χ2=6.266,P=0.039),慢阻肺患者ApaⅠ基因位点上GT基因型较非慢阻肺患者常见;TaqⅠ位点基因型分布在慢阻肺患者与非慢阻肺患者中无显著差异(χ2=0.425,P=0.369);ApaⅠ位点及TaqⅠ位点基因型频率与TNF-α、IL-8含量无显著相关性(TNF-α:PApaⅠ=0.979,PTaqⅠ=0.857;IL-8:PApaⅠ=0.747,PTaqⅠ=0.764).结论 慢阻肺发病率与VDR基因ApaⅠ(rs7975232)位点的SNP间存在遗传相关性,GT基因型患者可能更容易发生慢阻肺. 【期刊名称】《临床肺科杂志》 【年(卷),期】2018(023)010 【总页数】5页(P1756-1760)

【关键词】维生素受体;基因多态性;慢性阻塞性肺疾病

【作 者】顾文超;袁亚平;杨华;吴浩;王林宣;唐志君;邓国平;李珊珊

【作者单位】201299 上海,上海市浦东新区人民医院 呼吸科;201299 上海,上海市浦东新区人民医院 呼吸科;201299 上海,上海市浦东新区人民医院 呼吸科;201299 上海,上海市浦东新区人民医院 呼吸科;201299 上海,上海市浦东新区人民医院 呼吸科;201299 上海,上海市浦东新区人民医院 呼吸科;201299 上海,上海市浦东新区人民医院 呼吸科;201299 上海,上海市浦东新区人民医院 呼吸科 【正文语种】中 文

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease, 慢阻肺 )是一种以气流受限、不完全可逆为主要特征的呼吸系统疾病，其病情呈进行性发展。慢阻肺所致的长期慢性缺氧可累及机体多个组织器官，后期可导致肺源性心脏病、呼吸衰竭等严重疾病，给患者造成巨大痛苦，也给家庭和社会带来沉重的经济负担[1]。慢阻肺的发生机制复杂，涉及细胞损伤、炎症反应等多个方面。近年来，许多研究发现，机体维生素D(V itamin D, VitD)的合成及维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)的表达除与骨骼代谢密切相关外，其在慢阻肺的发生、发展中也具有重要作用。一些研究表明，VitD可促进气道上皮细胞合成、分泌抗菌肽、β-防御素2[2] ，增强巨噬细胞吞噬功能[3]，从而增强肺部抗感染能力，减少肺部疾病的发生。VitD通过与VDR结合形成复合物，作用于DNA特定序列而发挥功能。而VDR基因单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism, SNP) 决定了基因表达的差异，从而也影响了与之相关的疾病易感性。VDR基因多态性与疾病相关性已有多篇报道，包括肿瘤、1型糖尿病，结核、牙周炎等免疫性及感染性疾病[4-7]，但尚未见到与慢阻肺易感性关系的报道。因此，本研究收集了本院慢阻肺患者80例，对照45例，对其血样进行Taq Ⅰ、Apa I位点多态性检测，以探究其与慢阻肺易感性关系。

资料与方法 一、研究对象

2015年06月-2016年12月，入住上海市浦东新区人民医院呼吸科的慢阻肺患者80例，诊断标准符合中华医学会呼吸病学分会 2016年制定的慢性阻塞性肺疾病诊断标准。同时选取同期住院的非慢阻肺患者45例。对所有入选人员进行抽血采样检测提取DNA，检测TNF-α、IL-8含量，测量肺功能，并对相应数据进行记录。 二、 方法

1 基因组DNA的提取：两组受试者经过知情同意原则后抽取外周静脉血2 mL用 EDTA抗凝。采用标准盐法从白细胞提取基因组DNA，TE液溶解，定量后-20 ℃保存。

2 PCR对目的基因扩增：参照韩睿[8]文中所述条件，ApaⅠ位点：共 35 个循环：94℃预变性3 min，94℃变性20 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，反应完成后，72℃再延伸 6 min。TaqⅠ位点：共35个循环：94℃预变性 5 min，然后 94℃变性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s。反应完成后，72℃再延伸 6 min。 引物序列参照(见表1)。

表1 VDR基因ApaⅠ及TaqⅠ位点位点引物序列VDR基因SNP位点序列ApaⅠ(rs7975232)5’-3’: GTGTGTTGGACAGGCGGT 3’-5’: GCAGTGGTATCACCGGTCA TaqⅠ(rs731236)5’-3’:

GGTGGGATTGAGCAGT-GAG 3’-5’: CTTCTGGATCATCTTG-GCATA 3 酶切鉴定基因型：PCR 扩增产物分别用 Apa I、TaqⅠ限制性核酸内切酶(由 MBI Fermentas 公司提供)酶切后，置于2%的琼脂糖凝胶电泳确定基因型。ApaⅠ位点、TaqⅠ位点核苷酸序列测定，交由上海生工生物工程有限公司进行检测。

三、统计学处理

计量资料采用χ2检验，计数资料中多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。基因型频率用χ2检验进行统计学分析。数据采用SPSS 17.0 统计软件分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。 结 果

一、一般资料比较

对纳入研究的慢阻肺患者和非慢阻肺患者进行肺功能检查，TNF-α、IL-8检测，以及一般情况分析。结果发现：① 性别与慢阻肺发生具有相关性，男性更容易发生慢阻肺；② 吸烟对慢阻肺的发生具有重要影响，具有吸烟史的患者其慢阻肺发生率高；③ 检测结果显示人血清中炎症因子TNF-α、IL-8表达水平在慢阻肺及非慢阻肺人群中并无明显差异(见表2)。

表2 纳入研究慢阻肺患者及对照组一般情况分析一般资料慢阻肺组(n=80)对照组(n=45)t值χ2值P值性别 男7327 女718125.00<0.01年龄(岁)73.81±8.3564.89±9.685.41<0.05吸烟史 有6826 无

1219119.69<0.01FEV1(L)43.65±16.5579.37±20.5910.59<0.01FEV1/FVC(%)51.97±11.6877.74±10.8512.14<0.01TNF-α(ng/L)8.29±3.3210.19±5.672.37>0.05IL-8(μg/L)10.80±23.448.53±5.210.64>0.05

二、VDR基因ApaⅠ位点及TaqⅠ位点基因型和等位基因分布频率比较 对慢阻肺患者及非慢阻肺患者进行ApaⅠ位点基因型及基因频率分析。(见表3)所示，慢阻肺患者与非慢阻肺患者比较其基因型分布存在显著差异(χ2=6.266，P=0.039)，慢阻肺患者ApaⅠ基因位点上GT基因型较非慢阻肺患者常见；但G和T等位基因频率在慢阻肺患者与对照组间无显著差异(χ2=0.839，P=0.226)。TaqⅠ位点基因型频率分布(见表4)。其在慢阻肺患者和非慢阻肺患者间差异无统计学意义(χ2=0.425, P=0.369)，T和C等位基因频率在慢阻肺患者与对非慢阻肺

患者间也无显著差异(χ2=0.398，P=0.374)。

表3 慢阻肺患者与非慢阻肺患者ApaⅠ位点基因型分布情况例(%)组别n基因型GGGTTT等位基因GT慢阻肺组7539(52)35(46.67)1(1.33)113(75.3)37(24.7)对照组4326(60.5)13(30.2)4(9.3)65(75.6)21(24.4)

表4 慢阻肺患者与非慢阻肺患者TaqⅠ位点基因型分布情况例(%)组别n基因型TTTCCC等位基因TC慢阻肺组7565(86.67)10(13.33)0(0)140(93.33)10(6.67)对照组4339(90.70)4(9.30)0(0)82(95.35)4(4.65)

三、VDR基因ApaⅠ位点及TaqⅠ位点基因型与TNF-α, IL-8表达量关系比较 对所有入选病例进行TNF-α, IL-8水平检测，同时分析其与VDR基因ApaⅠ位点及TaqⅠ位点基因型频率的关系，结果显示：① ApaⅠ位点不同基因型(GG，GT，TT)人群中TNF-α及IL-8表达水平并无显著差异(见表5，TNF-α：F=0.227，P=0.979；IL-8：F=0.293，P=0.747)② TaqⅠ位点不同基因型(TT，TC)人群中TNF-α及IL-8表达水平也无显著差异(见表6，TNF-α：t=-0.818，P=0.857；IL-8：t=-0.324，P=0.764)。

表5 ApaⅠ位点基因型与TNF-α, IL-8表达量关系基因型nTNF-α数值方差齐性检验F值统计量概率IL-8数值方差齐性检验F值统计量概率

GG649.19±5.01P=0.1930.227P=0.97911.73±26.68P=0.3380.293P=0.747GT498.63±3.548.64±5.74TT59.11±1.827.78±2.25

表6 TaqⅠ位点基因型与TNF-α, IL-8表达量关系基因型nTNF-α数值独立样本t检验t值P值IL-8数值独立样本t检验t值P值TT1059.04±4.52-0.8180.8579.96±20.55-0.3240.764TC139.28±4.0211.55±6.30 讨 论

近年来越来越多的研究已经发现ViD及VDR在肺部疾病中的作用。如Nnoaham KE等[9]发现25-(OH)-D3 体内水平与肺结核的活动性相关，认为处于肺结核活动

期的患者其体内25-(OH)-D3水平偏低。Ginde等[10]对第三次全国健康与营养调查研究结果进行了再分析，发现25-(OH)-D3水平与上呼吸道感染独立相关，认为是冬季光照减少时引起冬季上呼吸道疾病发生的重要原因。而近期的一项研究更是表明，慢阻肺患者中VitD缺乏相当常见并与VitD结合蛋白基因变异有关[11]。ViD及VDR影响肺部疾病的作用机制，目前一般认为与VDR促进气道上皮细胞合成、分泌抗菌肽、β-防御素2[2]，增强巨噬细胞吞噬功能有关。而VDR基因的多态性往往导致VDR作用的差异，从而使得与之相关疾病的易感性不同。VDR基因多态性与疾病相关性已有多篇报道，包括肿瘤、1型糖尿病，结核、牙周炎等免疫性及感染性疾病[4-7]，但缺乏与慢阻肺易感性关系的报道。因此，本研究主要探讨了维生素受体(VDR)基因ApaⅠ(rs7975232)位点和TaqⅠ(rs731236)位点多态性与慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)发病率之间的关系，从而为慢阻肺的防治，尤其是易感人群的筛查、诊断提供参考依据。

收集2015年06月-2016年12月入住上海市浦东新区人民医院呼吸科的80例慢阻肺患者以及同期住院的45例非慢阻肺患者(对照组)血样进行VDR基因ApaⅠ位点及TaqⅠ位点多态性检测。发现慢阻肺患者与非慢阻肺患者间ApaⅠ位点基因型分布具有显著差异，且慢阻肺患者GT基因型更为常见，提示GT基因型人群可能更容易罹患慢阻肺。但VDR基因另一常见的SNP，TaqⅠ位点却没有发现明显差别。过去有研究表明，ApaⅠ(rs7975232)的mRNA位于3’末端的非翻译区，主要调控着mRNA的稳定性，对RNA十分敏感，因而其碱基的改变会显著影响 VDR 基因的转录效率及 mRNA 稳定性。但TaqⅠ(rs731236)位点虽在编码区，但其多态性是由无意义突变造成，一般认为不影响氨基酸序列[12]。所以，推测两组不同位点对慢阻肺的不同易感性可能与此有关，但确切的结论还需要更多的数据和临床试验加以证明。我们的结果与Shaheen SO等[13]的报道不同，他们的研究表明机体肺功能和慢阻肺发病与血清25-(OH)-D3水平具有相关性，但与VDR

基因的多态性却没有显著联系。产生差异的原因可能包括人种差异，样本量不同以及地区环境的影响。但仍可以看到，VitD与慢阻肺之间具有较为密切的关系，但其受体VDR的作用效果可能更为复杂。不同VDR基因的单核苷酸多态性(SNPs)位点根据其所在的区域不同，导致编码的VDR结构、数量等方面均可能存在差异，因此在分析VitD对慢阻肺影响的过程中，除了需要检测血清25-(OH)-D3水平，更应结合其VDR基因SNPs位点的序列来综合分析，才能得出更为可靠的结论。 目前大多数学者认为，VitD及VDR影响肺部疾病主要机制之一是调控了免疫系统，增加抗感染能力。因此，我们还检测了患者血清TNF-α及IL-8水平。结果显示，ApaⅠ及TaqⅠ位点不同基因型患者间TNF-α及IL-8水平无显著差异。事实上，目前国际上对TNF-α、IL-8等炎性因子与慢阻肺间的关系尚有许多争议，有的研究认为TNF-α、IL-8等炎性因子与慢阻肺之间存在密切关系[14-15]，但也有研究表示两者间没有明显的相关性[16]。我们的研究只检测了TNF-α及IL-8水平，不能代表其他炎性因子的情况，且纳入的人群之间存在较大的个体差异，所以，但更确切结论也还需要更多的临床数据和基础研究来加以支持。

综上，我们的研究发现了VDR基因ApaⅠ位点多态性与慢阻肺发病率之间具有相关性，GT基因型人群具有更高的慢阻肺易感性。该研究或可为慢阻肺的防治和易感人群的筛查提供新的思路。 参考文献

【相关文献】

[1] HOGG J C,CHU F,UTOKAPARCH S,et al.The nature of small airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease[J].N Engl J Med,2004,350(26):2645-2653. [2] HANSDOTTIR S,MONICK M M,HINDE S L,et al.Respiratory epithelial cells convert

inactive vitamin D to its active form:Potential effects on host defense[J].J Immunol,2008,181(10):7090-7099.

[3] LIU P T,STENGER S,LI H,et al.Toll like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response[J].Science,2006,311(5768):1770-1773.

[4] ASHMORE J H,GALLAGHER C J,LESKO S M,et al.No Association Between Vitamin D Intake,VDR Polymorphisms,and Colorectal Cancer in a Population-Based Case-Control Study[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2015,24(10):1635-1637.

[5] TIZAOUI K,KAABACHI W,HAMZAOUI A,et al.Contribution of VDR polymorphisms to type 1 diabetes susceptibility: Systematic review of case-control studies and meta-analysis[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2014,143:240-249.

[6] FERNNDEZ-MESTRE M,VILLASMIL ,TAKIFF H,et al.NRAMP1 and VDR Gene Polymorphisms in Susceptibility to Tuberculosis in Venezuelan Population[J].Dis Markers,2015,2015:860-628.

[7] TANAKA K,MIYAKE Y,HANIOKA T,et al.VDR gene polymorphisms,interaction with smoking and risk of periodontal disease in Japanese women:The Kyushu Okinawa maternal and child health study[J].Scand J Immunol,2013,78(4):371-377.

[8] 韩睿，董霞，苏炳驰，等.维生素D受体TaqⅠ、ApaⅠ基因多态性与昆明汉族2型糖尿病肾病的相关性研究[J].中国医药导报，2015，12(9)：69-72.

[9] NNOAHAM K E,CLARKE A.Low serum vitamin D levels and tuberculosis:A systematic review and meta-analysis[J].Int J Epidemiol,2008,37(1):113-119.

[10] GINDE A A,MANSBACH J M,CAMARGO C A JR.Association between serum 25-hydroxyvitamin D level and upper respiratory tract infection in the Third National Health and Nutrition Examination Survey[J].Arch Intern Med,2009,169(4):384-390.

[11] JANSSENS W,BOUILLON R,CLAES B,et al.Vitamin D deficiency is highly prevalent in COPD and correlates with variants in the vitamin D-binding gene[J].Thorax,2010,65(3):215-220.

[12] BASIRI A,SHAKHSSALIM N,HOUSHMAND M,et al.Coding region analysis of vitamin D receptor gene and its association with active calcium stone disease[J].Urol Res,2012,40(1):35-40.

[13] SHAHEEN S O,JAMESON K A,ROBINSON S M,et al.Relationship of vitamin D status to adult lung function and COPD[J].Thorax,2011,66(8):692-698.

[14] DEVECI Y,DEVECI F,ILHAN N,et al.Serum ghrelin,IL-6 and TNF-α levels in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Tuberk Toraks,2010,58(2):162-172.

[15] TSOUMAKIDOU M,TZANAKIS N,SIAFAKAS N M.Induced sputum in the investigation of airway inflammation of COPD[J].Respir Med,2003,97(8):863-871.

[16] KOSACKA M,POREBSKA I,KORZENIEWSKA A,et al.Serum levels of apoptosis-related

markers(sFasL,TNF-a,p53 and bcl-2) in COPD patients[J].Pneumonol Alergol Pol,2016,84(1):11-15.