纤维素科学与技术JournalofCelluloseScienceandTechnology
Vol.Jun. 2000
过氧化物酶研究进展
*
刘 稳 李 杨 高培基 齐 飞
(山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 250100)
文 摘:对过氧化物酶(Peroxidase,EC1.11.1.7)的生物化学与分子生物学研究进展作了简要评述,包括酶分子的结构、酶的催化反应机制、酶基因表达与调控等。重点对植物过氧化物酶超家族的结构特性与功能关系及真菌的木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的遗传学研究新进展进行了概括。
关键词:过氧化物酶,表达与调控,超家族,结构与功能中图法分类号:Q554.6
0 过氧化物酶简介
过氧化物酶(Peroxidase,PX,EC1.11.1.7)催化过氧化氢和有机过氧化物对各种有
机物和无机物的氧化作用[1]
。其分子量范围35000~100000,其中含铁PX是一类结构相似、功能相同的酶,它们都通过一个二质子二电子还原过程催化H2O2对底物AH的氧化:
H202+2AHv2H2O+A2
反应过程可简单描述为:
Heme[Fe(Ó)](PX)+H+#
2O2vHeme[O=Fe(Ô)-R](ComÑ)+H2O(1)Heme[O=Fe(Ô)-R+#
](ComÑ)+AHvHeme[O=Fe(Ô)](ComÒ)+A#
(2)Heme[O=Fe(Ô)](ComÒ)+AHvHeme[Fe(Ó)](PX)+A#
(3)2A#
vA2(或在底物为AH2时歧化生成A2+A2H4)
(4)
首先由PX与H2O2反应生成复合物Ñ(ComÑ),这相当于失去2个电子,ComÑ含有一个Fe(Ô)=O中心和一个有机阳离子自由基(R+#
),该自由基依酶种类和来源不同或定位于血红素或定位于蛋白质多肽链中;随后,ComÑ氧化一分子外源底物(AH),得一氢原子和一电子,产生底物自由基(A#
)和ComÒ,而有机阳离子自由基(R+#
)则被
还原为原初态,接着ComÒ被另一分子外源底物还原为初始态形式Fe(Ó),但又形成一
个A#
;最后,两个A#
或结合形成A2或歧化为A2+A2H4。
PX为一大类有共同活性的酶,但并不都具有相同或相似的结构和作用机理。多数PX含Fe(Ó)-原卟啉IX辅基,属氧化血红素蛋白质。血红素(铁卟啉)的基本结构成分是由吡咯组成的卟吩,带上侧链后形成卟啉,再和一分子铁构成铁卟啉化合物即为血
收稿日期:1998-11-18
山东大学微生物技术国家重点实验室开放基金项目(A9914E06)第2期
刘 稳等:过氧化物酶研究进展
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红素。有关血红素衍生物的变化均在卟啉环的侧链上进行。血红素作为PX的辅基,在这类酶蛋白中是电子传递反应的载体。PX中以辣根过氧化物酶(HRP,HorseradishPeroxidase)的结构和作用机理研究得较为透彻,在含铁PX中也有代表性,它代表一大类非特异性的PX。
HRP为结合了氧化血红素的糖蛋白。除Fe外每分子中还含有两个Ca。肽链由308个氨基酸组成。另有8个糖链(占分子质量的18%)分别与13、57、158、186、198、214、255和268位的Asn残基连接,它们分布在分子表面。肽链N-末端为一个吡咯烷酮羧基所封闭,C-末端为Ser。不同来源的同类型PX的氨基酸组成相似,这类PX的2+
[2]
活性中心除Fe(Ó)-原卟啉IX基本结构外,轴向配体一个是His42的咪唑氮,另一个位置是空的(也可能有水分子疏松配位),由此可使得Fe呈S=5P2的高自旋态。该空位与和它相对的His的咪唑基共同起调控铁的反应性的作用,有实验证明HisN1H或失去质子、或通过氢键与底物结合。这一解质子作用可能在使PX稳定在高氧化态中起作用。
血红素在PX中有五种相关的氧化态:Fe(Ò)-PX、Fe(Ó)-PX、ComÑ、ComÒ和ComÓ;ComÑ和ComÒ分别是原酶失去2个和1个电子形成的,它们的形式氧化态都是Fe(Ô),ComÑ中的铁呈Fe(Ô)=O结构。在铁氧离子中,铁呈低自旋d4构型,而且很可能有S=1(两个未成对电子);而轴向零场分裂D为30~60cm-1
。整个ComÑ则以大P阳离子自由基形式存在。从这一设想出发,PX与H2O2作用形成中间物ComÑ时反应为:Heme[Fe(Ó)](PX)+H2O2vHeme[O=Fe(Ô)-R+#
](ComÑ)+H2O。其中铁的形式氧化数为4,卟啉环形成有单电子的阳离子基(R+#
)。上述反应过程可以表示为图1。概括地说,先是H2O2对Fe(Ó)-PX的向核性进攻使H2O2失去一个质子变成HO--2,而Asp43的羧酸根被质子化。同时HO2与Fe(Ó)配位,而Arg的胍基通过氢键使这种配位稳定化。然后羧基转动使其羟基逼近H2O2的B氧原子,后者从羧基获得氢生成水而离去,羧基和胍基复原,PX则变成含Fe(Ô)=O的中间复合物)ComÑ。ComÒ是由ComÑ再与一个底物AH作用形成的,它的有效氧化数在ComÑ与PX原型之间,其形成过程可设想为(R
+#
)Fe(Ô)=O与底物AH作用时获得一个带一个电子的氢
原子的反应,所以此时底物变成自由基A#
。
图1 过氧化物酶复合物I的形成机制
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1 植物PX超家族的结构特性与功能关系
1.1 植物PX超家族
PX广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。基于序列相似性比较分析,可将含血红素PX划分成两个PX超家族(Superfamily),一个由真菌、细菌和植物来源的PX组成;另一个则由动物来源的PX组成;目前,对于真菌、植物和细菌来源的PX的研究已经拓宽到几十种,依来源不同,可将植物PX超家族内的成员进一步归为三类:Ñ类PX是胞内型PX,包括酵母细胞色素c过氧化物酶(CCP,位于线粒体电子传递链中的一种可溶[3]
性酶蛋白,主要保护细胞免受有毒的过氧化物损害),抗坏血酸过氧化物酶(AP,主要存在于高等植物的叶绿体和胞液中,负责H2O2的清除),和细菌来源的触酶-过氧化物酶(同时兼具过氧化氢酶和PX两种活力,为细胞应激高氧化环境压力提供保护);Ò类PX是来源于真菌的胞外型PX,包括各种真菌产生的木素过氧化物酶(LiPs)和锰过氧化物酶(MnPs),在木质素的生物降解中起重要作用;Ó类PX是来源于高等植物的分泌型PX,参与多种不同的生理功能,如机体内毒性过氧化物的清除,细胞壁的合成,组织愈伤,生长素合成与代谢等。
80年代初,研究得到了第一个PX-CCP的X-射线晶体结构,很长时间内有关PX的结构及功能研究一直以CCP的晶体结构为基础,近年来,相继又获得了多个不同种类及来源的PX晶体结构,包括来自Arthromycesramosus和Coprinuscinereus的PX,来自Phanerochaetechrysosporium的LiP和MnP,以及来自豌豆胞质的PX
[4,5]
。多序列比较分
析表明,尽管这些PX之间的序列同源性较小(<20%),但其二级结构的折叠方式却是高度保守的。PX分子由两个不同的结构域组成,中间包埋着血红素辅基,结构域部分由10~11个A-螺旋组成,螺旋之间由环区和转角连接,很少有B-折叠结构。结构域中存在几个保守的Gly和Pro残基,决定着蛋白质主链骨架的正确走向和蛋白分子的柔性,而由Asp107和Arg132(LiP)残基构成的深埋型盐桥是所有PX中都存在的保守结构,这种盐桥结构的主要作用是稳定两结构域之间的长环结构。
Ñ类PX分子中不存在二硫键,也不含糖基侧链和Ca2+
;而Ò,Ó类PX均含有二硫键,其位置虽有差异,但数量基本相同(4~5个),赋予了PX分子高度的刚性结构。另外,Ò类和Ó类PX分子中还含有两个Ca2+
,已由X-射线晶体结构确定了其结合位点。Ò类和Ó类PX在其分子表面还都具有程度不同的糖基化侧链,其具体的生物学功能有待深入研究。真菌来源的PX中除LiP的一个同功酶组分外,其余的都不含有Tyr残基,这不同于其他PX(Ñ,Ò类)。尽管存在上述差异,但不同PX家族的酶分子却都有相似的分子折叠模式。
将另一类血红素酶Cyt-P450(主要结构也是由A-螺旋组成)与PX进行比较分析,发现PX分子间具有很强的拓扑结构类似性。Li等人
[6]
对LiP和CCP(15%序列同
源性)及两个Cyt-P450分子(17%序列同源性)的A-螺旋区进行比较研究,揭示LiP和CCP分子中A-螺旋区的CA存在0.16nm的原子偏差,而两个Cyt-P450分子中A-螺旋区的CA却有0.28nm的原子偏差,后者这种较大的结构偏差归因于Cyt-P450底物结合的复杂性。就P450而言,其底物结合必须在血红素活性中心的疏水空穴内完成且需有准确的定向以便能与Fe(Ô)=O的氧原子反应,完成底物的羟基化。而对于PX,第2期
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底物并非直接与血红素疏水中心结合,而是由底物通过蛋白质分子向血红素辅基进行远程电子传递,从而使PX自身不必有较大的结构变化就可适于不同类型的底物。1.2 PX的辅基(血红素)微环境
多序列比较分析表明,尽管PX分子间的序列同源性较低,但Fe的配位环境和活性位点的多数氨基酸残基却是严格保守的。图2是LiP的活性位点局部结构及其保守残基,可见Fe总是以近基His作轴向第五个配体,近基His残基咪唑环上的氮原子(ND1)与邻近保守的Asp(LiP的Asp238)之间存在很强的氢键作用,致使近基His残基以荷负电形式出现,与Fe配位后赋予Fe一个较低的负还原电势,从而稳定了Fe的高氧化态,这对于酶活性中间体复合物ComÑ和ComÒ的稳定也是必需的。相比较而言,作为氧载体的珠蛋白,其血红素Fe具有与PX相同的五配位态,但其还原电势为正,故而稳定的是Fe的还原态,在这类蛋白中近基His仅与主链羰基氧原子以微弱氢键力结合。
图2 木素过氧化物酶(LiP)活性位点结构及保守氨基酸残基
目前普遍认为PX酶分子的还原电势高低(从HRP的-278mV到MnP的-90mV)
由轴向配基与血红素Fe的配位态调节[7,8]
,具体地说,是受Fe-ND2键合力决定的,而Fe-ND2键合力的大小又是由近基His与Fe之间的相对位置及距离决定的。对于LiP和MnP,其近基His残基归位于310F螺旋,与CCP的近基His相比,LiP和MnP分子由于其侧链Ser177与Asp201之间存在很强的氢键力而使近基His残基偏离了血红素平面0.1nm,换言之,氢键的形成迫使F螺旋结构远离了血红素;而CCP分子中对应于LiP的Ser177位置上是一个最没有/个性0的Ala残基,极大地削弱了Fe-ND2键合力,使血红素得电子趋势增强,从而造成Fe的氧化态稳定性减弱。事实也是如此,实验测定
[9]
MnP的还原电势比CCP高出近100mV。另外,在PX近基位点附近还存在一个芳香族氨基酸,Ñ类PX中该残基为Trp,Ò、Ó类PX中则为Phe。研究其作用,发现Ñ类PX中Trp残基参与构成ComÑ阳离子自由基的活性位点,但对于Ò、Ó类PX,由于相应位置上的Phe具有过高的还原电势,不易被H2O2氧化,故而不能直接参与ComÑ的形成,其阳离子自由基直接定位于血红素辅基上。
PX分子中血红素平面上方的远端/空穴0是H2O2的作用位点,该位点包含两个保守氨基酸残基)远端His和远端Arg,它们共同构成一个亲水性/口袋0结构,这是PX不同于其他血红素蛋白的又一个结构特征;PX中血红素Fe的疏水性五配位态是由远端/空穴0的特殊性质和近基His残基的强配位性共同决定的,尤其是后者使Fe偏离血红54
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素平面,从而防止了水分子从另一侧轴向位置与血红素Fe结合配位。另外,远端/空穴0的亲水性/口袋0结构可籍氢键网和Fe-ND2键的共同作用,稳定周围环境中的水分子,使其不能与Fe原子结合配位。相反,对于肌红蛋白分子,虽然其远端/空穴0中也含有一个His残基,但其整个/口袋0结构是高度疏水的,正是这个疏水性的/口袋0结构诱导了周围环境中的水分子与Fe的第六个空位配位结合。值得一提的是,PX分子中远端/空穴0的这两个保守残基(His和Arg)在酶中间体复合物ComÑ的形成和稳定方面起重要作用:ComÑ的形成要求PX分子远端His残基必须是去质子化形式,以便能够接受来自外源H2O2的质子,而远端His去质子化形式的稳定则依赖于该His残基的ND1与Asn84及Glu78的羰基氧三者之间的氢键作用,在所有PX中,这两个位点的残基(Asn84,Glu78)是高度保守的;远端Arg保守残基的作用目前认为主要有两个,一是加快质子向远端His的传递以促进HO-
2与血红素铁的结合;二是在O-O键断裂时,Arg的胍基可移进远端/空穴0与ComÑ和ComÒ的Fe=O形成氢键,籍此稳定中间体结构,这已由CCP的ComÑ晶体结构和定点突变实验结果所证实
[10]
。
对现有的PX晶体结构研究发现,在血红素活性位点附近至少存在4个排列有序的水分子,其中3个定位于远端/空穴0中,并与邻近的亲水性氨基酸残基形成广泛的氢键网(图3),籍此将远端His,远端Arg,血红素的丙酸根侧链及就近的亲水性氨基酸残基联结起来;另一个水分子位于近端并与近基Asp形成氢键,这些水分子都具有一定的刚性结构,分子力学(MD)模拟的结果与x-射线晶体学研究的结果基本一致[11]
。另外,利用核磁共振(NMR)技术研究溶液酶分子构象,包括CCP,LiP,MnP和CiP,发现即使是溶液状态中的酶分子也保持了晶体结构中检测到的近基和远端His及远端Arg残基的定位状态
[12]
。
图3 木素过氧化物酶(LiP)血红素活性位点附近的氢键网(虚线部分表示氢键)
1.3 底物结合位点
PX的底物特异性受多种因素影响,其中酶复合物中Fe=OR
+#
中心的还原电势最
为重要。该电势由酶蛋白分子与血红素辅基间的共价作用和静电作用共同决定,其中第2期
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共价作用主要是由轴向配体与血红素吡咯氮原子间形成共价键能力大小决定,这在所有PX中是基本相同的。另外,蛋白分子中荷电残基所产生的局部静电场亦对还原电势产生影响。与底物特异性密切相关的另一重要因素是酶蛋白分子的结构特性。酶蛋白分子的结构决定了底物、中介体和某些不溶性底物大分子的特异性结合位点,研究表明酶蛋白是通过分子表面拓扑结构的微小变化和少数氨基酸残基的改变控制着反应底物的特异性,这些微小的变化对蛋白质的分子折叠和二级结构不会产生很大影响。
2+
目前已获得的PX-底物复合物晶体结构仅有两种,即Cytc-CCP和Mn-MnP复合物。Cytc-CCP复合物中维系完整结构的主要作用力是疏水作用和范德华力,而分
[13]
子内氢键作用则极小。研究较深入的是Mn2+
-MnP复合物,目前已经通过晶体学技术对其Mn2+
结合位点作了精确定位(图4):首先Mn2+
与结合位点处第六位丙酸根的羧基氧原子配位,随后周围的酸性氨基酸残基(Glu35,Glu39,Asp179)侧链上三个不同的羧基氧原子及另外两个水分子也进一步参与配位,最终形成一个六配位的多面体结构。Mn2+
结合位点对MnP是高度保守的,而LiP、CCP以及C.cinereus和A.ramosus的PX分
子中在相应于MnP的Mn2+
结合位点位置上均不存在酸性氨基酸残基,取而代之的是中性或碱性残基,因而也就不能形成适合于Mn
2+
结合的结构位点。
图4 锰过氧化物酶(MnP)中锰离子结合位点结构
某些二羧酸盐(如草酸盐)能够通过螯合反应促进Mn2+vMn3+
的酶促氧化,从而
提高酶反应转换数,不过目前还未有任何晶体结构数据证明Mn2+
结合位点处有二羧酸根的存在。Banci等人[14]
利用NMR技术研究溶液态MnP中Mn2+
结合位点的定位情况,
并证实了络合剂(草酸盐)的存在不影响Mn2+
与MnP的亲和力,他们检测的溶液态MnP中Fe-Mn原子间距与由X-射线晶体结构获得的原子间距基本一致,并指出二羧酸盐的作用可能就是通过络合反应促进Mn2+
的氧化并稳定氧化态的Mn3+
。根据对Mn
2+
结合位点定位研究的结果,Pordus认为由Mn2+
向血红素Fe的电子传递是通过6-丙酸根侧链和血红素环进行的[7]
。
MnP氧化还原中心附近阳离子的存在,大大降低了氧化态的稳定性,从而使MnP具有相当高的还原电势。Poulos等人[7]
在解析AP的ComÑ晶体结构时也指出酶分子氧化还原中心还原电势的增高是由周围阳离子的静电作用所致。AP和CCP都含有一个近基Trp残基,而TrP残基的吲哚环均与近基His的咪唑环平行,但两者的ComÑ却有迥然不同的电子结构,CCP中阳离子自由基定位于近基Trp;而AP中在近基Trp附近56
+
+
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还含有一个K,正是这个K的存在大大提高了Trp的还原电势,从而使AP中阳离子自由基不再定位于Trp残基。
关于LiP,目前普遍认为该酶催化的木素降解反应需要小分子芳香化合物作中介体,LiP可将这些小分子中介体氧化为阳离子自由基,随后通过一系列非酶促反应氧化木素大分子
[15]
。在酶反应系统中加入藜芦醇(VA,一种真菌次级代谢产物),能明显促
进木素和其他大分子底物的氧化降解。但至今对VA作为中介体的具体作用仍未搞
[16]
清,初步的研究证明VA是LiP由ComÒ还原为天然态所必需的。有人根据LiP的晶体结构信息推测出一个潜在的VA结合位点,该位点位于血红素辅基边缘并靠近酶蛋白分子表面,构成一个开放的/沟槽0结构。Khindaria等人[17]
应用EPR技术结合快速流
动反应系统,追踪了LiP的ComÒ催化的VA+#
自由基形成过程,并指出VA自由基是在LiP的正常催化循环中形成的。VA的加入对LiP活性中心的两个His及血红素的质子NMR信号均无影响,提示VA的结合位置远离活性中心。1.4 Ca2+
的作用
在Ò类和Ó类PX分子中都含有两个具有维系结构作用的Ca2+
,且两个Ca2+
结合位点在全部真菌和植物来源的PX中高度保守[18]
。其中一个结合位点定位于近端结构域内,由五个氨基酸残基(Ser177,Asp194,Asp196,Ile199和Asp201)主链及侧链上的八个氧原子构成,这五个氨基酸残基在Ò类、Ó类PX中也是高度保守的。由于该结合位点是溶剂不可及(疏水)的,所以可以预料此处的Ca2+
结合应是非常紧密的。另一个Ca2+
结合位点定位于远端结构域内,由Gly66-Ser70(Gly66,Asp68,Ser70)主链及侧链上的七个氧原子,Asp48主链及侧链上的两个氧原子和两个水分子共同构成,其位置靠近分子
表面且是溶剂可及(亲水)的,故而此处的Ca2+
结合较为疏松。真菌和植物来源的PX中远端Ca2+
结合位点的同源性也是较高的,四个相关氨基酸残基中有三个完全相同。目前认为,PX分子中的这两个Ca2+
的主要作用是维系并稳定酶活性中心结构。与Ca2+配位的氨基酸残基都分属于形成远端和近基位点的螺旋,且每个Ca2+
均有一个配位残基紧邻于远端或近基组氨酸。对于植物来源的PX,去除其中的Ca2+
会明显降低酶催化活力,尤其是ComÒ的还原效率,同时也还会改变铁的氧化还原性质,从而也影响
ComÑ的还原效率。NMR研究结果[19]也表明Ca2+
对酶活性中心结构起着稳定作用。最近,分子力学模拟结果[20]
显示Ca2+
的去除使远端位点结构发生了较大改变,尤其是远端组氨酸残基经历了一个较大的位移,其结果导致了ComÑ形成过程中远端组氨酸残基不能与外源的过氧化氢直接作用,因而不能稳定Fe=O,相反,若将Ca2+
重新引入Ca2+
结合位点,则活性位点及远端组氨酸残基均恢复至正常结构态。Ca2+
对于PX分子结构的稳定作用亦由此可见一斑。
2 两类与木素降解密切相关的PX(LiPPMnP)
木素是存在于高等植物细胞壁中的含量仅次于纤维素的高分子生物多聚体,和半纤维素一起充填于微原纤维之间起加固粘连组织的作用。它是由类苯丙烷单元结构通过自由基聚合成的异质的、光化学惰性、交连且具高度分散性的芳香多聚物,高度抗生物降解。木素的结构和生物合成途径在本世纪70年代初已基本搞清楚,但有关其生物第2期
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降解机制的研究直至在Phanerochaetechrysosporium中发现LiP和MnP后,才在世界范围内掀起研究热潮,其工作主要是以白腐菌P.chrysosporium进行的。
2.1 LiPPMnP的生化特性及氧化状态
LiP是一系列含有铁原卟啉IX(血红素)辅基的同功酶,分子量在38000~43000,其中约15%为糖基组分;Kirk等人
[21]
从P.chrysosporium菌培养液中分离出10个含血红
[22]
素蛋白,其中6个为LiP,主组分为H8,Leisola则利用制备等电聚焦电泳技术从中分
离出21种不同的血红素蛋白,其中15种为LiP,其余6种为MnP。LiP和MnP在免疫学和氨基酸序列方面均有较强的同源性,但LiP的抗体不与MnP反应,且LiP和MnP在氨基酸组成(特别是Gly、Leu和Ile)上也有较大差异。LiP同功酶在分子量、表观Km和Vmax等方面都很相近,且能氧化具有高氧化还原电位的非酚型芳香化合物。研究表明25e时LiP中的铁处于高自旋五配位状态,而2e以下血红素辅基主要以高自旋的六配位态形式存在,这种随温度变化而改变配位状态的现象和细胞色素c相似,在MnP中则没有。光谱学研究表明LiP与HRP一样,也有五种氧化态。天然态的LiP含有高自旋的Fe(Ó),LiP被H+#
2O2氧化失去两个电子形成LiP-Ñ[Fe(Ô)=OR],LiP-Ñ经单电子还原形成LiP-Ò[Fe(Ô)=O],再经一次单电子还原,LiP-Ò恢复至天然态,从而完成了整个催化循环;在H2O2过量条件下,LiP-Ò可进一步与H2O2反应生成无活性的LiP-Ó[Fe(Ó)-O#
2P或Fe(Ò)-O2P]。与HRP相似,LiP-Ñ和LiP-Ò也可被同一种酚型化合物还原,另外,LiP-Ñ还可被单或双甲氧基非酚型芳香化合物还原,而LiP-Ò只能被含有两个甲氧基以上的非酚型芳香化合物还原,且LiP-Ò的还原与LiP-Ó(无催化活性或催化活性极低)的生成相竞争。双甲氧基化合物如藜芦醇、二甲氧基苯等能还原LiP-Ò回至天然态,为保持催化循环提供了一条可能的途径,在这个过程中,藜芦醇和双甲氧基苯分别形成相应的阳离子自由基
[23]
。
在白腐菌的木素降解系统中除LiP外,还有MnP。MnP也是一系列含血红素辅基的同功酶,在Mn(Ò)和H[24]
2O2存在时能氧化酚型木素和木素模型物
。MnP催化Mn
(Ò)vMn(Ó),Mn(Ó)反过来又氧化酚型化合物,并保护MnP不受反应活性自由基的破坏。MnP可在Mn(Ò)及螯合物(如乳酸盐)存在下催化由苯基上夺取氢的反应,这与LiP催化的正离子反应机制有根本区别。近年来由于对MnP研究的日益深入,它在木素降解过程的作用越来越受到重视。
有关LiPPMnP的催化机理研究目前仍在深入进行。依据前人研究,现已基本确定,在H2O2存在下,LiPPMnP触发启动高度活性的自由基中间体形成(LiP氧化酚型化合物为其芳香正离子自由基,LiPPMnP氧化酚型化合物为其苯氧自由基),继而以链反应过程(非酶促反应)产生许多不同种类的自由基促使底物氧化。这种自由基反应是高度非特异性和无立体选择性的,解释了酶反应的底物结构的多变性、酶与一类乃至多类底物的关系。
2.2 LiPPMnP的基因结构及其表达与调控2.2.1lip基因结构
编码序列:lip基因编码一条由343~345个氨基酸残基组成的成熟多肽,该多肽含58
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[25]
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有一个27~28氨基酸残基的先导序列。成熟LiP的分子量约为38000~43000,其中6%~12%的氨基酸残基是糖基化的,糖基部分约为2500~3000
。lip基因中有一个
潜在的N-糖基化位点,该位点编码Asn-X-Thr-Ser特征序列,此外,序列中还存在众多潜在的O-糖基化位点。LiP众多的同功酶可能是由同一基因编码,但转录后修饰(包括糖基化或磷酸化的数量和类型)不同。近基和远端保守氨基酸残基(近基His,远端His和远端Arg)为PX活性所必需。LiP和MnP中的近基Asp是保守结构,与近基His以氢键相连,在ComÑ形成中起重要作用,疏水簇分析表明不同PX中该Asp位置严格保守。LiP同功酶的C-末端,除P.chrysosporiumOGC101(LG2)中的H8和BKM-F-1767(CLG4)中的H2外,均由相同的氨基酸序列IPPPPGA组成
[26]
。LG2的C-末端为
IPPHKA,CLG4的C-末端为IPPPPSPN,可见LiP同功酶的C-末端均富含Pro残基,其意义有待研究。lip基因编码区G+Cmol%为60%~65%,而3.末端的非编码区G+Cmol%为44%~49%,其中以OGC101菌株H8同功酶基因LG2(单拷贝)的G+Cmol%最高
[27]
。
先导序列:对信号肽断裂位点的分析表明LiP最初是作为一种前体酶合成的,前体酶含有一个28氨基酸的先导序列,先导序列中则含有一个21氨基酸的信号肽,由前体酶先导序列Ala-21位点处断裂产生,该信号肽含有一个荷正电的N端区域、一个中央疏水区域和一个极性的C端区域,由此决定了LiP是典型的分泌型蛋白
[28]
。
内元结构:P.chrysosporium的lip基因中含有8~9个内元(Intron)结构,大小从49~78bp不等。其中6个内元结构的位置在所有lip基因中是相同的,内元P外元(Exon)的连接序列和其他丝状真菌相似,在5.-末端是GT,在3.-末端是AG
[29]
。内元P外元连
接处的序列通常也是保守的,除BKM-F-1767菌株H2同功酶的GLG1外,其他lip基因中先导序列与信号序列间均存在内元结构。据内元P外元结构的不同可将P.chrysos-porium的lip基因分为4个亚群,亚群Ñ包含H8基因及其相关序列;亚群Ò包含H10基因(GLG2)及其等位基因GLG5;亚群Ó由GLG6构成,亚群Ò和Ó除在其最大的外元结构中各有一位置不同的内元结构外,其余内元结构位置均与亚群Ñ相同;亚群Ô由GLG1构成,其内元较特殊,缺少其他三个亚群共有的1位和4位内元结构,但其最大的外元结构中却存在两个位置不同的内元结构
[30]
。
调控序列:所有lip的5.-非编码区在翻译起始密码上游66~81bp位置均有一个TATA盒结构。在-107bp和-228bp间有一个CAAT序列。S1核酸酶图谱证实转录起始于这些序列的下游。几乎所有的lip基因翻译起始密码(ATG)均落在真核生物公有序列GNNATGG中,且大多数lip基因在此位置的序列为GACATGG。相比较而言,3.端的poly(A)信号则变化较大,LG2的cDNA其poly(A)尾端上游24bp处有AACTAAA序
列,而另外两个LiP的cDNA其poly(A)尾端上游14bp处则是AATATPCA序列[31]
。2.2.2 mnp基因结构
编码序列:MnP同功酶由多基因编码,从P.chrysosporiumOGC101获得的mnp1基因编码一条357氨基酸的成熟多肽(内含一个21氨基酸的信号肽),而mnp2基因则编码一条358氨基酸的成熟多肽(内含一个24氨基酸的信号肽)。mnp1和mnp2的编码区核苷酸序列同源性为70%,而氨基酸同源性则可达88%。MnP和LiP的cDNA,其核苷酸序列同源性约为60%,氨基酸同源性约为50%~65%。两类酶都富含酸性氨基酸第2期
刘 稳等:过氧化物酶研究进展
59
(Asp和Glu),这与其等电点较低(pI3.5~5.0)相一致。MnP的信号肽中也包含着一个荷正电的N端区域、一个中央疏水区域和一个极性的C端区域,与LiP的C-末端不同,MnP的C-末端没有富含Pro的特征结构。MnP1有3个潜在的N-糖基化位点,而MnP2则有4个潜在的N-糖基化位点;此外,MnP1和MnP2均含有多个潜在的O-糖基化位点。与lip基因编码区相似,mnp基因的编码区同样也有较高的G+Cmol%含量
[32]
。
内元结构:mnp1基因富含6个57~72bp大小的内元,而mnp2则含有7个50~55bp大小的内元;mnp2中有6个内元结构的位置与mnp1完全相同,另外一个内元结构则位于mnp1第三个外元中远端His编码位置,这提示mnp1和mnp2可能分属于不同的亚群。mnp基因中内元P外元连接序列也都遵循类似lip中的GT)AG规则。mnp与lip基因的内元位置基本无相似之处,与lip不同,mnp的先导序列和信号肽序列间不存在内元结构,mnp基因靠近C-端处也无内元结构
[33]
。
调控序列:mnp基因的起始密码和其他真核基因的位置相同,隐于公有序列GCAATGG中。mnp基因的启动子区域都含有通用转录因子SP-1的识别位点(GGGCGG),mnp1中还含有转录因子AP-2的识别位点(TGGGGA)。mnp1和mnp2的启动区也都含有以下序列模式(sequencemotif):mnp1翻译起始密码子上游400bp内存在4个与公有序列C-GAA-TTC)G相似的热激感应子(Heatshockelements,HSEs);mnp2起始密码上游1100bp内存在6个HSEs[34]
。另外,mnp启动子区域也还含有与鼠金属蛋白基因中调控区公有序列相同的金属感应子(Metalresponseelements,MREs),mnp1中为5个,而mnp2中为3个。mnp1中的4个MREs和mnp2中的2个MREs成对重叠排列形成一个4bp大小的回文结构,此排列方式在其他MREs中未见发现。有证据表明mnP
启动区中的MREs和HSEs对mnp表达调控可能有重要的生理学意义[35]
。2.2.3 LiPPMnP的基因表达调控
氮源和碳源的调控:LiP和MnP是白腐菌在次级代谢过程中产生的,在菌丝停止生长时才表现酶活性;研究表明限氮(F2.4mmolPL)或限碳(F0.01molPL)是LiPPMnP产生的重要条件。用体外poly(A)-RNAs转录和Northern印迹分析法已经证明LiP是在mRNA翻译水平上受氮源营养调控,而MnP是在转录水平上受氮源营养调控。但目前已获得一些突变菌株其LiPPMnP的产生不受氮源调控;另外,Tien等人[36]
筛选到一株P.chrysosporium赖氨酸营养缺陷株,在高氮营养条件下也能大量产生LiP。有证据表明LiP和MnP同功酶受碳源和氮源的调控是有差异的,如对于BKM-F-1767菌株,限氮条件可诱导产生H2和H8同功酶,而限碳条件只能诱导产生H2,研究证实
[37]
编码H2
同功酶的基因(GLG4)在限碳条件下转录水平最高,比在富碳或限氮条件下转录水平高约一千倍。编码H10同功酶的GLG5基因转录只在限氮条件下才可检测到。而H8的基因在限氮和限碳条件下其转录水平基本相同。mnp基因转录也需限氮和限碳条件,限碳条件下MnP同功酶中H4最先产生,H3稍后出现,而H5始终未产生;限氮条件下,三种MnP同功酶组分均出现。此外,菌株的差异和培养条件如通气量、缓冲液组成、微量元素浓度均可影响LiPPMnP的产生。有证据表明
[38]
MnP在限碳条件下比在限氮条件
下更稳定,但无论在限碳或限氮条件下LiP都要比MnP更稳定些。
cAMP和芳环化合物的调控:P.chrysosporium等的木素降解酶活力和胞内cAMP水60
[39,40]
纤维素科学与技术
第8卷
平密切相关。cAMP抑制剂抑制或延缓LiP和MnP的产生是通过降低胞内cAMP水平实现的活
[41,42]
。芳环化合物对LiPPMnP活性的影响是多方面的,如藜芦醇(Veratrylalco-
hol,VA)的作用既能诱导酶合成,又能保护LiP和MnP在高浓度H2O2条件下不致失
,但苯乙醇则无此作用。另外,有些芳环化合物是LiPPMnP的底物,但却不能作为诱导物;而另一些芳环化合物既是LiPPMnP的底物,又是其诱导物。目前对于芳环化合物产生的LiPPMnP诱导机制仍不清楚。
Mn(Ò)对MnP的调控:限氮条件下MnP活性的出现依赖于Mn(Ò)的存在。West-ern免疫印迹分析表明MnP只有在限氮和Mn(Ò)存在条件下才产生,体外Poly(A)-RNAs转译时也只有补充Mn(Ò)才生成MnP活性蛋白,缺乏Mn(Ò)的培养基中无MnP生成
[43]
。Mn(Ò)对MnP-mRNA的累积影响受放线菌素D(ActinomycinD)而不受放线
菌酮(Cycloheximide)抑制,则表明Mn(Ò)是在基因转录水平调控MnP的生成[37]
。其他金属离子都不能替代Mn(Ò)作为诱导剂诱导MnP-mRNA的生成。Mn(Ò)对菌丝增重、氮源或碳源的消耗及对次生代谢产物藜芦醇的生成均无显著影响,此外,mnp启动子区的MREs可能与Mn(Ò)调控MnP的转录有关,白腐菌细胞中的Mn(Ò)结合转录因子可能类似于酿酒酵母中负责激活金属硫蛋白基因转录的铜结合蛋白(Ace1),能够激活mnp,调控MnP的生成,这一点值得深入研究。
热激调控:Northern印迹分析表明,即使在无Mn(Ò)条件下,45e、1h的热激作用仍能诱导mnp1基因产生mRNA;当培养基从37e移至45e条件下,10min后即可检测到mnp1基因转录产物;如Mn(Ò)对mnp基因的诱导作用一样,热激作用也只有在限氮条件下才奏效,其作用受放线菌素D抑制;当培养温度回至37e,1h后即已检测不到mnp基因转录产物。热激和Mn(Ò)对mnp基因转录的调控似乎有累加性
[44]
。热激作
用能够诱导MnP的生成表明mnp基因中HSEs序列的存在可能有重要的生理意义。然而,热激对mnp基因转录的诱导在缺乏Mn(Ò)时并不产生MnP活性,在胞内或胞外通过Western印迹分析都检测不到MnP活性蛋白的存在,这可能与mnp没有典型的热激蛋白基因结构有关,mnp缺乏热激蛋白所共有的内元结构和5.-末端非转录的长先导序列。对于lip基因其启动子区域不存在HSEs序列,因而基因不受热激调控
[44]
。
3 大豆种皮过氧化物酶(SHP)的应用前景
目前对于木素生物降解的研究主要是以白腐菌Phanerochaetechrysosporium开展的,研究主要集中在LiP和MnP。在一定程度上,LiPPMnP与其他来源的PX存在相似之处,其作用机理现在普遍接受的一个观点是:先由H2O2与酶分子作用而将酶氧化激活,处于氧化活性态的酶(复合物Ñ)再与底物反应,生成一个不稳定的正碳离子自由基中间体,由该自由基中间体再进行一系列的非酶促反应,反应为单电子氧化[45]
。白腐菌类虽然具有降解木素的能力,但培养时间很长,而且酶活较低,酶性能不稳定,不适于实际应用。LiP和MnP只能氧化木素模型物,对天然木素不表现氧化能力。LiP和MnP都是含血红素辅基的糖蛋白,对这两种酶的核酸和蛋白质序列分析表明,其活性位点氨基酸残基与其它来源的PX有较高的相似性
[46]
。各种植物中或多或少都存在PX,但各种PX
的性质不尽相同。研究人员从多种植物、真菌和原核生物中通过大规模的筛选和检验第2期
刘 稳等:过氧化物酶研究进展
[47]
61
工作,发现来源于大豆种皮的SHP最为理想。在木素的生物降解中,能够适于大批
量应用的理想的PX应该是来源容易、底物作用范围宽、耐热且在较宽的pH范围内保持稳定,SHP在这几方面都体现出LiPPMnP所无法比拟的优势(生产原料来源是易得的农作物废弃物-大豆皮,且该酶在大豆种皮中的含量也相当可观,提取SHP后的豆皮还可以作为饲料添加剂)
[47]
,是一种最有望于替代LiPPMnP而应用木素生物降解理论研
究和实际生产的PX。
来自英特网(Internet)的信息表明,SHP在食品、医药、环保和化工等行业中已经初露锋芒。就目前的实际应用来看,SHP独特的稳定性和优良的反应性能已使其成为同类酶中/惟我独尊0的一员:欧洲面包制作行业中以SHP替代传统的溴化钾添加剂;美国环保部门应用SHP处理工业废水;美国的EnzymolInternational和AmericanQualex公司将SHP应用于医药诊断试剂盒生产,其产品的性能与质量均超过了传统的HRP-试剂盒;在树脂生产工业中SHP成功地替代了传统合成工业中的甲醛,大大降低了生产成本;此外,许多大公司争先恐后地研究开发SHP在计算机芯片、多种塑胶材料及建筑材料胶合剂生产中的应用;甚至有人认为,有朝一日SHP可以作为/环境卫士0在污染水和污染土壤的生物性修复中大展宏图。目前,世界上最大的PX技术开发公司当属美国的EnzymolInternational公司,仅与SHP应用有关的注册专利就多达17项,SHP的应用范围之广由此可见一斑。
4 过氧化物酶的模拟研究
无论是LiP、MnP,还是其他来源的非特异性PX,其分子活性中心均含有一个Fe(Ó)-原卟啉IX(血红素)辅基,而且这类酶的底物特异性均较低。Fe为第Ñ过渡态金属元素,具有未充满的d电子壳层,能以多种氧化态参与生物体内的一系列氧化还原反应。Fe与原卟啉IX结合形成的血红素具有以大P-电子共轭体系及铁原子价态改变为基础的氧化还原性质,以及铁对轴向配体的配位能力。研究表明多种血红素化合物在特定条件下都能成功地模拟PX的酶活性。如Shimada等人发现氯化高铁四苯基卟啉环在叔丁基过氧化氢存在时,常温条件下即能模拟LiP氧化木素模型物;Habe等人报道血红素在室温条件下,在H2O2或叔丁基过氧化氢存在时即可催化B-1型化合物中CA-CB键断裂。但血红素不稳定,而且不溶于中性或酸性水相系统。如何制备出结构更稳定的可溶性血红素结构,以利于催化反应的高效进行,这一点值得深入研究。
参 考 文 献
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LiuWen LiYang GaoPeiji QiFei
(TheStateKeyLaboratoryofMicrobialTechnology,ShandongUniversity,Jinan250100,China)
Abstract:Advancesinbiochemicalandmolecularbiologicalstudies,includingenzymestructure,catalyticmechanismandgeneexpressionandregulationofperoxidasesarereviewed.Thisreviewfocusonthestructure-functionrelationshipofplantperoxidasesuperfamilyandtherecentstud-iesontwofungiperoxidases,ligninperoxidaseandmanganeseperoxidase.Keywords:peroxidase,expressionandregulation,superfamily,structureandfunction
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