国外医药抗生素分册２０１８年３月第３９卷第２期 １０５ 基于结构设计的三肽分子对ＮＤＭ．１的抑制活性研究 陈姣一，一，孙影。，陈超凡 ，郑珩３， （１南京中医药大学附属中西医结合医院，南京２１００２８； ２江苏省中医药研究院，南京２１００２８； ３中国药科大学，南京２１０００９； ４南京航空航天大学，南京２１１１０６） 摘要：产生ｐ－内酰胺酶是致病菌对抗生素耐药性的最主要原因。虽然丝氨酸Ｄ一内酰胺酶抑制剂已经广泛用于临床，但是针 对金属１３－内酰胺酶目前尚无有效药物通过临床试验。因此新型ＭＢＬｓ抑制剂的研发成为了热点。鉴于抗菌肽在自然界发挥的快速 有效的抗菌活性及其不易导致耐药性的特点，结合不断被报道的卡托普利与青霉素的结构特征，本研究设计了一系列含有半胱 氨酸的小分子肽，并测定了其对ＮＤＭ－１的抑制活性，发现ＦＣｆＹ￣ＮＤＭ．１的抑制活性最好，ＩＣ 为２６．５９１ｘｍｏｌ／Ｌ，能够使头孢呋辛 对ＮＤＭ－１重组菌的ＭＩＣ降低４倍。Ｃｙｓ和Ｎ端Ｐｈｅ构型的改变都会使三肽分子的活性降低，Ｃ端引入Ｐｒｏ也会导致活性下降。本研究 可为合理设计新型ＭＢＬｓ抑制剂提供借鉴。 关键词：细菌耐药性；金属酶Ｄ．内酰胺酶；ＮＤＭ．１；三肽；抑制剂 中图分类号：Ｒ９７８．１＋６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１．８７５１ ０１８）０２．０１０５—０６ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ Ｍｅｔａｌｌｏ－ＩＭａｃｔａｍａｓｅ－１ Ｃｈｅｎ Ｊｉａｏ１，一，Ｓｕｎ Ｙｉｎｇ ，Ｃｈｅｎ Ｃｈａｏ．ｆａｎ４，Ｚｈｅｎｇ Ｈｅｎｇ３ （１ Ｎａｍｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００２８； ２ Ｊｉｎｇｓａｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００２８； ３ Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ，Ｎａｎｔｊｉｎｇ ２１０００９； ３ Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ ｔｏｆＡｅｒｏｎａｕｔｉｃｓ ａｎｄＡｓｔｒｏｎａｕｔｉｃｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１１０６） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ—ｌａｃｔａｍａｓｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇＹ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｓｅｒｉｎｅ Ｂ—ｌａｃｔａｍａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃ，ｎＯ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｔａｌ １３－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ（ＭＢＬ）ｈａｖｅ ｐａｓｓｅｄ ｈｅ ｃｌｔｉｎｉｃ ｔｒｉａｌｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ＭＢＬｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｈａｓ ｂｅｃｏｍｅ ａ ｈｏｔｓｐｏｔ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ｈａｔｔ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｈａｖｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｏｔ ｅａｓｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｗｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃａｐｔｏｐｒｉｌ（ｒｅｐｏｒｔｅｄ ＭＢＬｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）ａｎｄ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｙ ｔａｇａｉｎｓｔ Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ ｍｅｔａｌｌｏ—Ｂ １ａｃｔａｍａｓｅ一１（ＮＤＭ一１）．Ｗ＿ｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ＦＣｆ ｅｘｈｉｂ ｉｔｅｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｙ，ｗｉｔｈ ｔＩＣ ０ｆ ２６．５９￣ｔｍｏ１／Ｌ ａｇａｉｎｓｔ ＮＤＭ一１．ＦＣｆ ｃａｉ１ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ＭＩＣ — Ｊｕ ｏｆ ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ ａｇａｉｎｓｔ ＮＤＭ．１ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ４ ｏｌｆｄｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ Ｃｙｓ ａｎｄ Ｎ—ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｐｈｅ ｗｉｌｌ ｒｅｄｕｃｅ ｈｅ ｔａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅｓ．ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏ ａｔ ｈｅ Ｃ—ｔｔｅｒｍｉｎａ１ ｗｉｌｌ ａｌｓｏ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｈｅｌｐｆｕｌ ｃｌｕｅｓ ｏｒｆ ｈｅ ｔｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｎｅｗ ＭＢＬｓ ｉｈｉｎｂｉｔｏｒｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；Ｍｅｔａｌｌｏ—Ｄ—ｌａｃｔａｍａｓｅ；ＮＤＭ一１；ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅｓ；ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ 收稿日期：２０１７—１２．１１ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（项目编号：８１５０３３１１）。 作者简介：陈姣，助理研究员，主要研究方向是计算机辅助药物设计。 通信作者：郑珩，副教授，主要研宄方向是药物生物信息学。 １０６ Ｗｏｄｄ Ｎｏｔｅｓ ＯＩ７ｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２０１８，Ｖｏ１．３９，Ｎｏ．２ １前言 复抗生素的抗菌活性。 近年来，细菌对Ｂ一内酰胺类抗生素的耐药性逐 渐成为临床上抗感染治疗的巨大威胁，其中ｐ．内酰 胺酶的产生是导致细菌耐药的主要机制之一。Ｂ一内 ２材料与方法 ２．１ 三肽抑制剂的设计及分子对接 不少含有巯基的化合物已被报道对ＭＢＬｓ有较 好的抑制活性，其中不乏基于氨基酸结构设计的巯 基衍生物［１５ ］，结合卡托普利结构特点，我们首先 酰胺酶被分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四类。其中Ａ、Ｃ、Ｄ类 依赖活性位点中的Ｓｅｒ残基发挥水解活性，而Ｂ类依 赖活性中心的金属离子，故被称为金属Ｂ一内酰胺酶 （Ｍｅｔａｌｌｏ。Ｂ—ｌａｃｔａｍａｓｅ，ＭＢＬ）ｍ。基于氨基酸序列同源 考虑半胱氨酸（Ｃｙｓ）作为首选组分。图１所示氨苄西 性以及锌离子个数，又将ＭＢＬｓ分为Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３三 林和卡托普利的结构，其侧链类似于苯丙氨酸（Ｐｈｅ） 和脯氨酸（Ｐｒｏ），因此也将Ｐｈｅ和Ｐｒｏ Ｉ入到多肽中。 个亚类［ｚ］。２００９年首次报道的新德里金属Ｂ．内酰胺酶 ＮＤＭ一１『３１，就属于Ｂ１类金属酶，表达该酶的菌株对 几乎所有Ｂ．内酰胺类抗生素都具有耐药性，人们形象 地称之为“超级细菌”，不到一年时间，ＮＤＭ一１便 在多个国家被报道并引起全世界的广泛关注［４］。迄今 为止，ＮＤＭ的突变体己达１７种之多（ＮＤＭ．１—１７）￣５１， 而人们所熟知的三种经典Ｄ．内酰胺酶抑制剂（克拉维 酸，三唑巴坦和舒巴坦）与ｐ．内酰胺抗菌药联合应 用，是目前对抗Ｂ．内酰胺酶介导的广泛耐药性比较 成功的策略。但是这些抑制剂仅能够有效灭活丝氨 酸类（尤其Ａ和Ｃ类）ｐ．内酰胺酶，临床上尚未发现有 用的ＭＢＬ抑制剂【６］。 虽然越来越多的金属酶抑制剂被报道【，】，如含巯 基或硫酯类、二羧酸类、三唑类、硼酸盐类、天然产 物类化合物等［ｓ－１１１，但还需考虑其广谱抑制活性，与 抗生素的协同作用，合成难度以及体内分布、代谢、 毒性等问题。多肽类抗生素的研发也因日益严重的细 菌耐药性而备受关注，ＰＨ２００１年上市的链阳菌素， ２００６年上市的达托霉素等，以及临床上应对ＮＤＭ一１ 耐药菌感染最有效的药物一一多黏菌素，均为多肽类 抗生素。由于多肽类抗生素的耐药性发展相对较慢， 且对临床上多重耐药菌的治疗效果可观［１２］，因此，新 型多肽类抗生素或者多肽类ＭＢＬｓ抑制剂的开发具有 重要的应用价值。目前公认的对多种ＭＢＬｓ表现良好 抑制效果的卡托普利，可以看作脯氨酸与半胱氨酸 组成的多肽类似物，与ＮＤＭ一１的晶体复合物衍射结 果表明，卡托普利发挥抑制作用的主要官能团是巯 基【¨］。对卡托普利结构的改造是许多研究者关注的 热点，其中Ｙ．ｕｓｏ潜【１４１也证实了卡托普利结构中巯基 的重要性。而作为ＮＤＭ．１水解底物的Ｄ．内酰胺类抗 生素的母核结构中含有两个肽键，同样可以看作三 肽类似物。基于以上几点，我们设计了一系列含有 半胱氨酸的三肽化合物，试图模拟ＭＢＬｓ的底物竞争 性与ＮＤＭ一１结合，起到抑制其活性的作用，进而恢 考虑到青霉素的特殊构型，我们设计了序列为Ｐｈｅ． Ｃｙｓ－｛Ｄ—Ｐｈｅ｝（ＦＣｆ）和Ｐｈｅ－Ｃｙｓ一｛Ｄ—Ｐｒｏ｝（ＦＣｐ）的三肽 （ＦＣｆ，图ｌ１。然后考察Ｃｙｓ的构型对三肽分子活性的 影响，设计得到多肽分子Ｐｈｅ一｛Ｄ—Ｃｙｓ｝一｛Ｄ．ＰｈｅＩ（Ｆｃｔ） ￣ｔｌＰｈｅ一｛Ｄ—Ｃｙｓ｝一｛Ｄ—Ｐｒｏ｝（Ｆｃｐ）；进而在分子ＦＣｐ和 Ｆｃｐ的基础上，考察Ｎ端Ｐｈｅ构型的影响，将Ｌ．Ｐｈｅ替 换成Ｄ—Ｐｈｅ，得到分子｛Ｄ—Ｐｈｅ｝．Ｃｙｓ－｛Ｄ—Ｐｒｏ｝（ｆＣｐ）和 ｛Ｄ—Ｐｈｅ｝一｛Ｄ－Ｃｙｓ｝一｛Ｄ－Ｐｒｏ｝（ｆｃｐ）。 然后用分子对接的方法模拟三肽分子与ＮＤＭ一１ 的结合模式。对接过程在ＭＯＥ２０ｌ４中完成，ＮＤＭ一１ 的晶体结构取自ＰＤＢ数据库（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｑ６Ｘ）。首先 对蛋白结构加氢、质子化，将结构中的原有配体周 围口袋定义为活性位点。构建三肽分子并进行结构 优化及质子化处理，对接方法选择Ｐｒｏｘｙ Ｔｒｉａｎｇｌｅ， 打分函数选择Ｌｏｎｄｏｎ ｄＧ。 ２．２ ＮＤＭ一１金属酶的获取及动力学参数测定 实验室前期己构建ｐＥＴ一２８ａ．ＮＤＭ．１一Ｅ．ＣＯｌｉ ＢＬ２ｌ（ＤＥ３）的重组菌株，ＮＤＭ．１的表达、纯化方法 参考文献【＂】。采用前期摸索成熟的方法，得到了纯 化后的金属酶ＮＤＭ．１冻干粉［１８】。为了选择合适的报 Ｐｈｅ．．Ｃｇｓ．．Ｐｈｅ ’ ０Ｈ ￣ －－－ ＩＮ。 Ｈ 国外医药抗生素分册２０ｌ８年３月第３９卷第２期 告底物方便后续实验的进行，我们测定了ＮＤＭ—ｌ 的动力学参数［１９］。ＮＤＭ．１水解底物的速率可以通过 监测反应过程中吸光度的变化来确定，根据Ｈａｎｅｓ— 浓度重复三次。 ３结果与讨论 ３．１金属酶的表达纯化及动力学参数 实验室前期己构建好ｐＥＴ－．２８ａ—ＮＤＭ一１．Ｅ．ｃｏｌｉ ｗｏｏｌｆｆ￣以［ｓ］／ｖ对［Ｓ］作图，其中【Ｓ］为底物浓度，Ｖ 为反应初始速率。所得直线的横轴截距绝对值为 米氏常数Ｋ ，斜率为最大反应速率的倒数ｌ／ｖ。 …ＢＬ２１（ＤＥ３）的重组菌株（ＮＤＭ一１的Ｎ端添加了Ｈｉｓ—ｔａｇ 以便后续纯化），在２０℃下诱导表达２０ｈ后收集菌 体，经超声破碎后对上清中的ＮＤＭ—ｌ采用镍柱亲和 层析法进行分离、纯化，纯化结果如图２所示。以青 Ｖ ／［Ｅ］Ｎ７以求出转化常数Ｋ ，［Ｅ】是酶浓度。酶 促反应在含有１ ００ｇｍｏｌ／Ｌ ＺｎＣＩ 的５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ 缓冲液中进行，首先利用干式恒温器（杭州朗基科 学仪器有限公司）３０℃孵育ＮＤＭ一１ ５ｍｉｎ，让缓冲液 霉素（氨苄西林）、头孢菌素（头孢呋辛、头孢唑肟）及 碳青霉烯类（美罗培南）抗生素为底物，测定ＮＤＭ—ｌ 水解动力学参数见表Ｉ。结果显示ＮＤＭ １对经典青霉 素类抗生素氨苄西林的水解速率（Ｋ…）最高，对头孢 呋辛的水解速率最低，故后续抑制剂活性测定的底 物选择头孢呋辛。 中的金属Ｚｎ 充分占据酶的活性中心，然后用ＵＶ一 １ ８００Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（上海美谱达仪器有限公司１连 续测定１２０ｓ内反应时底物的吸光度变化，取线性变 化部分计算反应的初速度。 ２．３ 三肽分子对ＮＤＭ．１抑制活性的测定 ２．３．１ 三肽分子对ＮＤＭ一１的抑制活·，ｌ￣ｉｃ 的测定 在吉尔生化（上海）有限公司合成三肽分子。依据 ３．２三肽分子的结构及其与ＮＤＭ一１的相互作用分析 ＮＤＭ一１属于Ｂ１类金属ｐ一内酰胺酶，其活性位点 处有两个Ｚｎ离子，Ｚｎｌ与Ｈ１２０～Ｈ１２２一Ｈ１８９（３Ｈ位点） ＮＤＭ．１的动力学特点，我们选择头孢呋辛钠作为报告 底物，在２６０ｎｍ波长下测定其吸光度随酶水解时间的 配位，Ｚｎ２与Ｄ １ ２４一Ｃ２０８一－Ｈ２５０（ＤＣＨ位点）配位。氨 苄西林及卡托普利与ＮＤＭ—ｌ的相互作用模式如图３所 变化，计算反应初速度。反应的缓冲液体系为含Ｚｎｒ＋ 浓度１ ００ｇｍｏｌ／Ｌ的５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ，具体步骤：①首 先将终浓度为１０ｎｍｏｌ／Ｌ的ＮＤＭ—ｌ金属酶加到ＨＥＰＥＳ缓 示。氨苄西林的酰胺氧与Ｚｎ１配位，羧基氧与Ｚｎ２配 位，卡托普利的巯基同时与两个锌离子配位，这是 配体与ＮＤＭ—ｌ之间最重要的相互作用键。另外，氨 苄西林还与ＮＤＭ一１的Ｑ１２３和Ｅ１５２形成氢键，卡托普 冲液中，在３０￣Ｃ干式恒温器中孵育５ｍｉｎ，使Ｚｎ２ 充分 占据酶的活性中心；②加入不同体积的抑制剂溶液， 使其终浓度呈梯度增加，总体积为１００ｇＬ，同样３０￣Ｃ 孵育５ｍｉｎ，使抑制剂分子与酶充分结合；③将体系 转入石英比色皿，加入１００ｐＬ头孢呋辛钠溶液（终浓 度为ｌ６０ｇｍｏｌ／Ｌ），立即混匀后测定体系吸光度的变 ９７．２ ６６．４ ４４．３ 化，记录数据。取线性部分计算反应的初速度。每 个浓度至少平行测定三次以减少偶然误差。ＩＣ 值采 用ＳＰＳＳ２２软件中的回归分析获得。 ２９．０ ２．３．２ 三肽分子与抗生素联合抑菌活性的测定 重组菌株ｐＥＴ－２８ａ．．ＮＤＭ一１一 ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）复 苏后挑取单菌落培养至对数生长期（ＯＤ ＝Ｏ．６），依 ２０．１ 照１ＯＤ＝１×ｌ０ ＣＦｕ／ｍＬ的换算关系，将菌株稀释 到１×１０ ＣＦＵ／ｍＬ备用。抗生素的浓度梯度范围为 Ｉ４－３ ２５６￣０ｇｇ／ｍＬ，细菌终浓度为１×ｌｆｆ ＣＦＵ／ｍＬ，用含有 ５０１ｘｇ／ｍＬ卡那霉素的Ｌｕｒｉａ．．Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）液体培养基补 图２ ＮＤＭ一１的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳结果 表１ ＮＤＭ一１的酶动力学参数 足体系至１００ｇＬ。大肠埃希菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）作为 阴性对照。９６孔板放置在３７℃培养箱培养１２～１４ｈ， 测定６００ｎｍ处的吸光度值，与不加菌液的体系相比， 检测值无明显差异（即检测不到细菌生长）的孔所对应 的头孢呋辛钠的浓度作为最低抑菌浓度（ＭＩＣ），每个 ｌ０８ Ｗｏｒｌｄ Ｎｏｔｅｓ ｏｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２０１ ８，Ｖｏ１．３９，Ｎｏ．２ ⑧ ④ ⑧ 卡托酱利 ⑤ ⑧ ＦＣｆ ⑤ ◇ ④ ＦＣｐ ④ ⑨⑨ ｆｃｐ 图３氨苄西林、卡托普利和三肽分子与ＮＤＭ．１的对接模式 国外医药抗生素分册２０１８年３月第３９卷第２期 利与Ｎ２２０形成氢键。 通过分子对接方法研究三肽分子与ＮＤＭ一１的相 Ｌ．Ｐｈｅ变成Ｄ．Ｐｈｅ时，检测不￣ＵｆＣｐ对ＮＤＭ一１的抑制活 性，ｆｏｐ对ＮＤＭ．１的ＩＣ 降￣Ｕ３２１．３７ｇｍｏｌ／Ｌ，说明Ｎ端 Ｐｈｅ的构型偏好Ｌ型。 互作用。如图３所示，含有半胱氨酸的三肽游离巯基 均能与锌离子发生配位，其中ＦＣｆ、Ｆｃｆ、ＦＣｐ和Ｆｃｐ 的巯基同时与两个锌离子配位，而ｆＣｐ和ｆｏｐ上的巯基 ３．３．２ 三肽分子与头孢呋辛联用对重组ＮＤＭ一１大肠 埃希菌的ＭＩｃ测定 三肽分子在终浓度为２００ｐｍｏｌ／Ｌ时与头孢呋辛联 用对重组ＮＤＭ一１大肠埃希菌的抑菌效果如表３所示。 当头孢呋辛浓度为０￣ｔｍｏｌ／Ｌ时，６条三肽分子均不能抑 制大肠埃希菌生长，说明三肽本身无抗菌活性；ＦＣｆ 只与Ｚｎ２配位，其羧基Ｚｎｌ配位。ＦＣｆ、ＦＣｐ和Ｆｃｐ还 与Ｋ２１ １形成氢键，ＦＣｆ、Ｆｃｆ、Ｆｃｐ￣ｌｆｃｐ与Ｎ２２０形成 氢键，ＦＣｆ还与Ｑ１２３形成氢键。 ３．３ 三肽分子对ＮＤＭ一１的抑制活性 ３．３．１ 三肽分子对ＮＤＭ一１的抑制活性Ｉｃ 测定 三肽分子对ＮＤＭ．１的抑制活性ＩＣ 测定结果如表 与头孢呋辛联用的抑菌效果比较明显，使头孢呋辛 对ＮＤＭ一１重组菌的ＭＩＣ由１２８￣ｇ／ｍＬ降低至３２ ｇ／ｎ１Ｌ， ２。ＦＣｆ对ＤＮＭ．１的抑制活性ＩＣ 为２６．５９￣ｔｍｏｌ／Ｌ；当 半胱氨酸变为Ｄ型时，三肽分子Ｆｃｆ对ＮＤＭ一１的抑制 活性ＬｇＦＣ 低，ＩＣ 为２９．１５￣ｔｍｏｌ／Ｌ，说明含Ｌ型半 胱氨酸的三肽对ＮＤＭ一１的活性更好一些，此结论在 ＦＣｐ和Ｆｅｐ的活性中也得到了验证，它们对ＮＤＭ．１的 降低４倍；当半胱氨酸变为Ｄ型时，Ｆｃｆ－￣头孢呋辛 联用的抑菌效果下降，ＭＩＣ变为６４￣ｔｇ／ｍＬ；三肽Ｃ端 Ｄ—Ｐｈｅ变成Ｄ—Ｐｒｏ或者Ｎ端Ｌ．Ｐｈｅ变成Ｄ—Ｐｈｅ时，与ＦＣｆ 相比，联合抑菌效果均降低，其中ｆＣｐ和ｆｃｐ没有使头 孢呋辛的ＭＩＣ降低，说明无联合抑菌效果。由此可 抑制活性分别为７４－３６和８６．４６ｔｘｍｏｌ／Ｌ，这也说明三肽 见，联合抑菌实验结果与３．３．１中的ＩＣ 。测定结果基本 一Ｃ端的Ｄ—Ｐｈｅ变成Ｄ．Ｐｒｏ会使活性明显下降。而当Ｎ端 致。 表２三肽分子对ＮＤＭ．１的抑制活性ＩＣ 表３三肽抑制剂与头孢呋辛联合对ｐＥＴ－２８ａ－ＮＤＭ－１ 大肠埃希菌的ＭＩＣ￣ＩＪ定 肽。相互作用模式分析发现它们的游离巯基均能与 ＮＤＭ．１的锌离子配位，与卡托普利和ＮＤＭ．１的关键 作用模式类似。通过对ＮＤＭ一１的抑制活性ＩＣ 以及 它们与头孢呋辛联用的抑菌效果ＭＩＣ测定，发现ＦＣｆ 对ＮＤＭ一１的抑制活性最好，ＩＣ 为２６．５９￣ｔｍｏｌ／Ｌ，能够 使头孢呋辛对ＮＤＭ一１重组菌的ＭＩＣ降低４倍。当Ｃｙｓ 和Ｎ端的Ｐｈｅ为Ｄ型时会使三肽分子的活性降低，Ｃ端 引入Ｐｒｏ也会导致活性下降。 本研究为新型金属．Ｂ．内酰胺酶抑制剂的研发奠 定了基础。但是因为小肽分子本身稳定性差，其对 细菌细胞膜的通透能力及在细菌体内的代谢性质等 都会影响分子的活性，因此本研究设计的三肽分子 注：每个浓度重复三次，ａ：三次结果均有菌体生长；ｂ：三次结果均无 菌体生长；ｃ：有两次无菌体生长，一次有菌体生长。 有待进一步改造以提高活性。 参考文献 『１１ Ａｍｂｌｅｒ ＲＰ．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｉｌｏｓ ＴｒａｎｓＲＳｏｃＬｏｎｄＢＢｉｏｌＳｃｉ，１９８０，２８９（１０３６）：３２１—３３１． ｆ２１ Ｇａｒａｕ Ｇ，Ｇａｒｃｉａ－Ｓｆｉｅｚ Ｉ，Ｂｅｂｒｏｎｅ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ４结论 近年来，细菌耐药性的发展使得金属一ｐ．内酰胺 酶抑制剂的研发倍受关注，而多肽类抗生素的耐药性 发展相对较慢，且对临床上多重耐药菌的治疗效果 可观，因此开发新型多肽类抗菌药物具有重要的应用 价值。本文基于ＮＤＭ．１的底物氨苄西林和抑制剂卡 托普利的结构，通过理性设计得到６条含有Ｃｙｓ的三 ｓｔａｎｄａｒｄ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｃｌａｓｓ Ｂ ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅｓ［Ｊ］． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００４，４８（７）：２３４７－２３４９． ［３】 Ｙｏｎｇ Ｄ，Ｔｏｌｅｍａｎ ＭＡ，Ｇｉｓｋｅ ＣＧ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｌ１０ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍｅｔａｌｌｏ—ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅ ｇｅｎｅ，ｂｌａ（ＮＤＭ一１），ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｎ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｅ １４ ｆｒｏｍ Ｉｎｄｉａ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎ￣Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００９，５３（１２）： ５０４６．５０５４． ［４】Ｋｕｍａｒａｓａｍｙ ＫＫ，Ｔｏｌｅｍａｎ ＭＡ，Ｗａｌｓｈ ＴＲ，ｅｔ ａ１． Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｉｎｄｉａ，Ｐａｋｉｓｔａｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ＵＫ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄ ，２０ １ ０，１ ０（９）： ５９７－６０２． ［５］Ｌｉｕ Ｚ，Ｗａｎｇ Ｗａｌｓｈ ＴＲ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｓｍｉｄ。ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｏｖｅｌ ｂｌａＮＤＭ一１７ Ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｅ ４８ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ｓｔｒａｉｎ［Ｊ］． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２０１７，６１（５）：ｅ０２２３３一ｅ０２２１６． ［６］Ｍｏｊ ｉｃａ ＭＦ，Ｂｏｎｏｍｏ ＲＡ，Ｆａｓｔ Ｗ．Ｂ １－ｍｅｔａｌｌｏ—ｂｅｔａ－ ｌａｃｔａｍａｓｅｓ：ｗｈｅｒｅ ｄｏ ｗｅ ｓｔａｎｄ？［］］．Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ， ２０１６，１７（９）：１０２９－１０５０． ［７］ＭｃＧｅａｒｙ ＲＰ，Ｔａｎ ＤＴ，Ｓｃｈｅｎｋ Ｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｉｈｎｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏ—ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅｓ［Ｊ］．Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１７， ９（７）：６７３—６９１． 【８］Ｚｈａｉ Ｌ，Ｚｈａｎｇ ＹＬ，Ｋａｎｇ ＪＳ，ｅｔ ａ１．Ｔｒｉａｚｏｌｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ： ａ ｖａｌｉｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ ｍｅｔａｌｌｏ— ｂｅｔａ·ｌａｃｔｍａｓｅ一１（ＮＤＭ一１）ｉｎｈｉｂｉｏｔｒｓ［Ｊ］．ＡＣＳＭｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ， ２０１６，７（４）：４１３—４１７． ［９】Ｈｉｎｃｈｌｉｆｅ Ｐ，Ｇｏｎｚ￣ｉｌｅｚ ＭＭ，Ｍｏｊｉｃａ ＭＦ，ｅｔ ａ１．Ｃｒｏｓｓ·ｃｌａｓｓ ｍｅｔａｌｌｏ－－ｂｅｔａ—·ｌａｃｔａｍａｓｅ ｉｈｎｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｂｉｓｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ，２０１６， １ １ ３（２６）：Ｅ３７４５—３７５４． ［１０］Ｃａｈｉｌｌ ＳＴ，Ｃａｉｎ Ｒ，Ｗａｎｇ ＤＹ，ｅｔ ａ１．Ｃｙｃｌｉｃ ｂｏｒｏｎａｔｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅｓ［Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２０１７，６１（４）：ｅ０２２６０一ｅ０２２１６． Ｗｏｒｌｄ Ｎｏｔｅｓ ｏｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２０１ ８，Ｖｏ１．３９，Ｎｏ．２ ［１ １１ Ｃｈｅｎ ＡＹ，Ｔｈｏｍａｓ ＰＷ，Ｓｔｅｗａｒｔ ＡＣ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｐｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ ｍｅｔａｌｌｏ．．ｂｅｔａ．． １ａｃｔａｍａｓｅ．１【１ Ｊ］．ＪＭｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１７，６０（１７）：７２６７—７２８３． ［１２】Ｍａｎｇｏｎｉ ＭＬ，Ｂｈｕｎｉａ Ａ．Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ：ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１６，１６（１）：２－３． ［１３】Ｇｕｏ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｎｉｕ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ＮＤＭ－１ ｆｒｏｍ ａ ｓｕｐｅｒｂｕｇ［Ｊ］． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ，２０１１，２（５）：３８４—３９４． ［１４］Ｙｕｓｏｆ Ｔａｎ ＤＴＣ，Ａｒｊｏｍａｎｄｉ ＯＫ，ｅｔ ａ１．Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ ｍｅｔａｌｌｏ－ｂｅｔａ—ｌａｅｔａｍａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２０１６，２６（６）：１５８９—１５９３． ［１５］Ｂａｉ ＣＧ，Ｘｕ ＹＴ，Ｌｉ ＮＮ，ｅｔ ａ１．Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ ｍｅｔａｌｌｏ—ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅ一１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ，２０１５，１ １（１）：４６—５７． ［１６］Ａｒｊｏｍａｎｄｉ ＯＫ，Ｈｕｓｓｅｉｎ ＷＭ，Ｖｅｌｌａ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｓｉｇｎ， ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｈｉｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｌｌｏ．ｂｅｔａ． １ａｃｔａｍａｓｅ ＩＭＰ－１［Ｊ］．ＥｕｒＪＭｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１６，１１４：３１８—３２７． ［１７］Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｓｈｉ ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｔｈｅ ｎｏｎ— ａｃｔｉｖｅ．ｓｉｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｙ２２９Ｗ ｉｎ Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ ｍｅｔａｌｌｏ．ｂｅｔａ。 ｌａｃｔａｍａｓｅ—ｌ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ， ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０ １ ３， ８（１２）：ｅ８２０８０． ［１８】Ｓｈｅｎ Ｂ，Ｙｕ Ｙ＇Ｃｈｅｎ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｆｕｌｌ— ｌｅｎｇｔｈ Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ ｍｅｔａｌｌｏ－ｂｅｔａ—ｌａｃｔａｍａｓｅ一１（ＮＤＭ一１）［Ｊ】． Ｄ Ｏｎｅ，２０１３，８（５）：ｅ６２９５５． ［１９］Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｚｈｕ ｅｔ ａ１．Ａｓｐ１２０Ａｓｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｍｐａｉｒｓ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＮＤＭ·－１ ｍｅｔａｌｌｏ—－ｂｅｔａ·－ｌａｃｔａｍａｓｅ： ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｕｔｄｙ［Ｊ］．Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｃｈｅｍ Ｐ ｓ，２０１４，１６（１４）：６７０９－６７１６．
