腺苷药物预适应对缺血心肌的保护作用

摘要】目的：分析腺苷药物预适应对缺血心肌的保护作用及Mn-SOD、ICAM-1﹑iNOS的含量变化。方法：试验用Wistar 大鼠140只，随机分为：对照组﹑心肌梗塞组﹑IP组﹑腺苷PP1个循环组﹑腺苷PP 2个循环组﹑腺苷PP 3个循环组﹑腺苷PP 4个循环组。通过TTC（Triphenyl tetrazolium chloride）染色方法来测定心肌梗塞的面积；通过氧化还原酶法测定血清中的Mn-SOD、ICAM-1﹑iNOS的含量变化。结果：⑴心肌梗塞面积在心肌梗塞组中最大，IP后心肌梗塞面积有明显的下降，两者之间有明显的统计学差异。在PP三个循环组，心肌梗塞面积达到最小，在PP四个循环组，心肌梗塞面积较PP三个循环组稍有升高，两者之间没有统计学差异（p>0.05）。⑵ 心肌梗塞以后Mn-SOD含量与对照组相比明显升高(p<0.05)。PP以后血清中的Mn-SOD含量亦有明显的升高，从第一个循环到第三个循环，随着循环次数的增加而增加，高峰在PP三个循环的时间，与心肌梗塞组相比较两者之间有明显的统计学差异（p<0.01）；第四个循环Mn-SOD的含量较三个循环组反而稍有下降，两者之间没有统计学差异(p>0.05)。⑶心肌梗塞以后血清中的ICAM-1含量表达较对照组有明显的升高，两者之间有统计学差异

（p<0.05）。ICAM-1的含量随PP循环次数的增加而增加，其含量在PP四个循环的时间达到最高峰，其同心肌梗塞组之间有明显的统计学差异（p<0.01）。⑷心肌梗塞以后血清中的iNOS含量表达较对照组有明显的升高，两者之间有统计学差异（p<0.05）。iNOS的含量随PP循环次数的增加减少， PP四个循环最低，同心肌梗塞组之间有明显的统计学差异（p<0.01）。结论：PP对梗塞心肌具有保护作用，Mn-SOD、ICAM-1﹑iNOS在PP过程中有明显的变化，可能参与了心肌PP的过程。

【关键词】缺血预适应; 药物预适应; Mn-SOD; iNOS; ICAM-1

【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0168-03

在心肌梗塞前，预先给予心肌几次短暂的缺血再灌注之后，可以明显的增加心肌对随后缺血的耐受性，此为缺血预适应(Ischemic Preconditioning， IP)［1］，在体内应用某些药物可以部分的模拟IP的过程，称此过程为药物预适应

(Pharmacologic precondition PP )。本实验就是在建立大鼠心肌梗塞模型和IP、PP模型的基础上来探讨Mn-SOD、iNOS、ICAM-1在IP及腺苷PP过程中含量表达的变化和腺苷PP作用及其临床意义，以期为冠心病的防治提供更好的指导。 1材料和方法

1．1试验动物：Wistar 大鼠，3－6个月，体重150g左右，雌雄不限（购于浙江省人民医院实验动物中心）。

1．2 主要仪器：千分之一天平(METTLER公司)；动物用呼吸机 (浙江大学动物仪器厂)；紫外可见分光光度计(上海医用设备厂)；显微镜(OLLIMPUS公司)。 1．3 主要药品 ：腺苷注射液（沈阳光大药业公司）；TTC试剂（浙江省华东医药股份公司）；伊凡蓝试剂（瑞士Restang 公司）；Mn-SOD、ICAM-1、iNOS检测试剂（南京建成生物有限公司）。 2试验分组

试验用Wistar 大鼠140只，随机分为7组，每组20只：

A组 对照组 只开胸暴露心脏，不结扎冠状动脉，24小时后取血清和心肌标本供检测用。

B组 心肌梗塞组 结扎冠状动脉后1小时，关闭胸腔。24小时后取血清和心肌标本供检测用。

C组IP组 结扎冠状动脉前降支5分钟，放松3分钟，做三个循环。24小时以后，结扎冠状动脉前降支1小时，取血清和心肌标本供检测用。 D 组 腺苷PP组

D1组 PP1个循环组 腺苷PP 24小时，结扎冠状动脉1小时。取血清和心肌标本供检测用。

D2组 PP2个循环组 腺苷PP 24小时，再注射相同剂量，做二个循环。24小时以后，结扎冠状动脉前降支1小时，取血清和心肌标本供检测用。

D3组 PP3个循环组 腺苷PP 24小时，再注射相同剂量，做三个循环。24小时以后，结扎冠状动脉前降支1小时，取血清和心肌标本供检测用。

D4组 PP4个循环组 腺苷PP 24小时，再注射相同剂量，做四个循环。24小时以后，结扎冠状动脉前降支1小时，取血清和心肌标本供检测用。 3动物模型的建立

3．1建立心肌梗塞动物模型。 3．2建立IP动物模型。 3．3建立腺苷PP模型 4标本的收集和处理

4．1Mn-SOD 暴露下腔静脉，抽取静脉血3ml，4000转∕分钟离心5分钟，取血清置于－20℃低温冰箱保存。

4．2 心肌标本 试验终点时间，剪下心脏，剪下梗塞部位。 5试验检测

5．1 心肌梗塞面积的检测：按TTC染色的方式进行。

5．2 Mn-SOD、ICAM-1、iNOS的检测：严格按照说明书操作进行。 6 统计分析

资料以均数±标准差表示，各试验组之间比较用T检验，组内之间比较用单因素方差分析。P<0. 05为有统计学差异，P<0.01为有显著统计学差异。 7试验结果

7．1肉眼观察: 结扎冠状动脉前降支1小时以后，肉眼可见心室前壁颜色逐渐呈现浅淡、苍白样改变，收缩幅度下降，部分伴有室壁瘤形成。 7．2 心肌梗塞面积的测定结果 （见表1，2） 表1心肌梗塞面积的测定结果

﹡P<0.05 ＃P<0.01

从表1中可以看出：心肌梗塞面积在心肌梗塞组中最大，平均达到了22.86%，而在IP以后，心肌梗塞面积有明显的下降，两者之间有明显的统计学差异。在PP三个循环组，心肌梗塞面积达到最小，但是单纯的增加PP的刺激量，并不能相应的继续减少心肌梗塞的面积，在PP四个循环组，心肌梗塞面积较PP三个循环组稍有升高。PP三个循环组和四个循环组与心肌梗塞组相比较有明显的统计学差异（p<0.01），但是PP三个循环和四个循环组之间没有统计学差异（p>0.05）。 7．3 Mn-SOD的测定结果 （见表2） 表2Mn-SOD含量测定结果

﹡P<0.05 ＃P<0.01

从表2 中可以看出：心肌梗塞以后血清中的Mn-SOD含量表达较对照组有明

显的升高，两者之间有统计学差异（p<0.05）。Mn-SOD的含量随PP循环次数的增加而有部分增加，其含量在PP三个循环的时间达到最高峰，而在四个循环以后逐渐下降，其同心肌梗塞组之间有明显的统计学差异（p<0.01）。 7．4 ICAM-1的测定结果（见表3） 表3ICAM-1含量测定结果

﹡P<0.05 ＃P<0.01

从表3 中可以看出：心肌梗塞以后血清中的ICAM-1含量表达较对照组有明显的升高，两者之间有统计学差异（p<0.05）。ICAM-1的含量随PP循环次数的增加而增加，其含量在PP四个循环的时间达到最高峰，其同心肌梗塞组之间有明显的统计学差异（p<0.01）。

7．5 iNOS的测定结果（见表4 ） 表4iNOS含量测定结果

从表4中可以看出：心肌梗塞以后血清中的iNOS含量表达较对照组有明显的升高，两者之间有统计学差异（p<0.05）。IP后血清中iNOS含量表达较心肌梗塞组有所下降，两者之间有统计学差异（p<0.05）。iNOS的含量随PP循环次数的增加而减少，其含量在PP四个循环达最低值。（p>0.05） 8讨论

PP对心肌有明显的保护作用，腺苷是机体能量代谢的产物，主要来源于ATP降解。心脏短暂缺血后大量ATP降解，导致局部心肌组织腺苷积聚［2-3］。SOD是体内自由基重要的清除酶之一，有三种不同的类型，分别命名为：Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe- SOD。 Mn -SOD在IP中发挥了重要的作用，而在IP第一相中产生的Mn-SOD还可能在第二相保护作用中发挥了更大的保护作用［4-6］。

Yamashita的研究则指出Mn-SOD蛋白表达的高峰和IP发挥作用的时间相同，并且Mn-SOD的含量和心肌梗塞面积呈负相关。国外学者Yamashita 曾经指出Mn-SOD可能是缺血IP的最终效应器［6］。NOS分为两大类，即原生型

NOS(constitutive NOS， cNOS)和诱生型NOS(inducible NOS， iNOS)。缺血后几分钟内iNOS活性即增加，继之NO浓度升高，随时间的延长iNOS蛋白表达下降；NOS已被选择性地确定为预适应延迟相的调节物。在野生型小鼠，初发预适应后24h iNOS 的表达和活性增强。无iNOS 等位基因的纯和型小鼠缺乏延迟相预适应的保护作用［7-10］。ICAM- 1 又称CD54，是分子量为76～114 KD 的单链糖蛋白，微血管内皮是其主要的靶细胞。许多研究证实，发生脑缺血、脑和脊髓缺血再灌注损伤，ICAM-1 表达增加，使得白细胞与血管内皮细胞间粘附力增加,进而贴壁、滚动、嵌塞微血管,造成局部血液动力学环境改变。白细胞跨过内皮细胞间隙进入周围组织，释放大量炎性介质和细胞因子，造成缺血区域的脑组织损伤，并吸引更多的白细胞进入组织，形成恶性循环［11-13］。

在人类通过开胸建立IP模型的可能性不大，建立PP效应显得极为重要，通过我们的研究也发现在PP过程中体内的抗氧化系统发挥了重要的作用，分析在PP过程中iNOS做为始动因子发挥作用，ICAM-1做为中间因子起作用，而MN-SOD可能做为效应物质发挥作用，但是三者之间如何发挥进一步的作用，尚待研究。

9结论

9.1腺苷PP以后可以明显的减少心肌梗塞的面积；

9.2腺苷发挥PP的作用可能也需要机体内的抗氧化酶系统参与。

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