淫羊藿素的制备方法[发明专利]

[12]发明专利申请公布说明书

[21]申请号200710099025.1

[51]Int.CI.

C12P 17/06 (2006.01)C07D 311/40 (2006.01)C07H 1/06 (2006.01)C07H 1/08 (2006.01)

[43]公开日2008年11月12日[22]申请日2007.05.09[21]申请号200710099025.1

[71]申请人北京珅奥基医药科技有限公司

地址100085北京市海淀区上地信息路26号506

室[72]发明人孟坤

[11]公开号CN 101302548A

[74]专利代理机构北京海虹嘉诚知识产权代理有限公

司

代理人张涛

权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页

[54]发明名称

淫羊藿素的制备方法

[57]摘要

本发明涉及“淫羊藿素的制备方法”，其特征在于：将淫羊藿苷用β－Glycosidase进行酶解反应制得。本发明采用β－葡萄糖苷酶为淫羊藿苷进行酶解反应，其去糖解完全，且收率很高，采用自行设计的从淫羊藿药材中提取淫羊藿苷，整个工艺过程操作简便，反应后处理方便，产物纯度完全符合药用标准。

200710099025.1

权 利 要 求 书

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1.淫羊藿素的制备方法，其特征在于：将淫羊藿苷用β-葡萄糖苷酶进行酶解反应制得。 2.根据权利要求1所述的淫羊藿素的制备方法，所述β-葡萄糖苷酶用量与淫羊藿苷的重量比为1∶3-8，酶解反应条件是在40-60℃的醇-水溶液中反应20-30小时。

3.根据权利要求2所述的淫羊藿素的制备方法，所述β-葡萄糖苷酶用量与淫羊藿苷的重量比为1∶5，酶解反应条件是50℃的醇-水溶液中反应24小时，所述醇为乙醇。 4.根据权利要求3所述的淫羊藿素的制备方法，所述酶解反应后的反应混合液的后处理采用离心处理法，所述离心处理法是将反应混合液离心处理弃上清液，再用丙酮溶解后离心处理，过滤，弃滤渣，滤液蒸干。

5.根据权利要求1所述的淫羊藿素的制备方法，还包括淫羊藿素的纯化，所述纯化是采用丙酮-水重结晶。

6.根据权利要求1所述的淫羊藿素的制备方法，还包括淫羊藿苷的制备步骤，所述淫羊藿苷的制备步骤包括淫羊藿总黄酮的提取和淫羊藿苷的纯化，所述淫羊藿总黄酮的提取步骤包括(1)提供淫羊藿水提取液，(2)浓缩后用D101大孔树脂柱吸附，先后用水、30％乙醇、50％乙醇洗脱，再分别用90％乙醇、水冲洗回用，(3)收取50％乙醇洗脱部分，浓缩，干燥。

7.根据权利要求6所述的淫羊藿素的制备方法，所述浓缩后的溶液含量为0.2g淫羊藿生药材/ml。

8根据权利要求7所述的淫羊藿素的制备方法，所述D101大孔树脂用量为淫羊藿生药材的1-2倍，浓缩液的上柱流速为5个柱体积/h，洗脱液用量为3-4个柱体积。

9.根据权利要求6所述的淫羊藿素的制备方法，所述淫羊藿苷的纯化包括采用硅胶层析柱分离纯化法，其中包括采用10∶0，9∶1，8∶1，7∶1，6∶1的三氯甲烷-甲醇梯度洗脱；用TLC法检测，浓缩含淫羊藿苷的馏分步骤。

10.根据权利要求9所述的淫羊藿素的制备方法，所述淫羊藿苷的纯化还包括将浓缩物用甲醇重结晶，滤出物依次用丙酮，甲醇洗涤。

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说 明 书

淫羊藿素的制备方法

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技术领域

本发明涉及中药领域，特别是涉及一种中药淫羊藿中的有效成分淫羊藿素的提取方法。背景技术

淫羊藿是常用的中药材，是小檗科(Berberridaceae)淫羊藿属(Epimedium genus)多种植物的地上干燥部分，中华人民共和国药典(2000版)收录了如下五种淫羊藿药材，即淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim))、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanenes)、朝鲜淫羊藿(Epimediumkoreanum Nakai)等。淫羊藿具有补肾壮阳、强筋健骨、袪风除湿之功效，常用于治疗阳痿不举、小便淋漓、腰膝无力以及冠心病、慢性支气管炎、神经衰弱和小儿麻痹等症。现代药理研究证明，淫羊藿含有特殊的化学成分和显著的生物活性，目前，已从淫羊藿中分离提取得到该化学成分即为淫羊藿苷。淫羊藿苷的分子结构为：

化学命名为：3，5，7-三羟基-4′甲氧基-8-异戊烯基黄酮-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

研究发现，由于淫羊藿苷含有两个糖基，即3-位上的葡萄糖基和7-位上的鼠李糖基，其活性很差，而淫羊藿苷的去糖解产物淫羊藿素的活性则很高。国内多数采用酸式水解法，然而盐酸水解易与8-取代基上的双键形成加成，致成产物收率大低而没有使用价值，而硫酸水解只能去掉7-位上的糖基，而3-位上的糖基不易水解掉，结果只能得到低糖基的淫羊藿苷，其活性与淫羊藿苷比，较高一些，但与淫羊藿素相比还是相差很远。专利申请(申请号031336353)“酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法”，其采用以淫羊藿为菌

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种的发酵产酶诱导物，发酵后提取得到的酶用于淫羊藿甙的糖水解，但结果显示，其酶解产物是一种低糖、去糖、不同取代的淫羊藿甙或甙元，说明其去糖解效率并不是很好。发明内容

本发明提供一种淫羊藿素的制备方法，其去糖解反应完全，且收率很高，整个工艺过程操作简便，反应后处理方便，纯化简单。

淫羊藿素的制备方法，其特征在于：将淫羊藿苷用β-葡萄糖苷酶，进行酶解反应制得。 所述β-葡萄糖苷酶用量与淫羊藿苷的重量比为1∶1-10，酶解反应条件是在40-60℃的醇-水溶液中反应20-30小时。

优选β-葡萄糖苷酶用量与淫羊藿苷的重量比为1∶5，酶解反应条件是50℃的醇-水溶液中反应24小时，所述醇为乙醇。

所述酶解反应后的反应混合液的后处理采用离心处理法，所述离心处理法是将反应混合液离心处理弃上清液，再用丙酮溶解后离心处理，过滤，弃滤渣，滤液蒸干。 所述淫羊藿素的制备方法，还包括淫羊藿素的纯化，所述纯化是采用丙酮-水重结晶。 淫羊藿素的制备方法还包括淫羊藿苷的制备步骤，所述淫羊藿苷的制备步骤包括淫羊藿总黄酮的提取和淫羊藿苷的纯化，所述淫羊藿总黄酮的提取步骤包括(1)提供淫羊藿水提取液，(2)浓缩后用D101大孔树脂柱吸附，先后用水、30％乙醇、50％乙醇洗脱，再分别用90％乙醇、水冲洗回用，(3)收取50％乙醇洗脱部分，浓缩，干燥。 所述浓缩后的溶液含量为0.2g淫羊藿生药材/ml。

所述D101大孔树脂用量为淫羊藿生药材的1-2倍，浓缩液的上柱流速为5个柱体积/h，洗脱液用量为3-4个柱体积。

所述淫羊藿苷的纯化包括采用硅胶层析柱分离纯化法，其中包括采用10∶0，9∶1，8∶1，7∶1，6∶1的三氯甲烷-甲醇梯度洗脱；用TLC法检测，浓缩含淫羊藿苷的馏分步骤。 所述淫羊藿苷的纯化还包括将上述得到的浓缩物用甲醇重结晶，滤出物依次用丙酮，甲醇洗涤。

从淫羊藿苷到淫羊藿素，关键是要将淫羊藿苷的3-，7-上的糖取代基水解掉，发明人作了长期的研究和探索，发现β-葡萄糖苷酶(β-Glycosidase)能将上述两个位置上的糖取代基一步水解掉，同时其酶解收率较高(达55％左右)，且其后处理简捷，整个酶解工艺简单，易于工业化生产。

β-葡萄糖苷酶的加入量与反应物的重量比为1∶1-10，酶解反应条件是在40-60℃的醇-水溶液中反应20-30小时，由于淫羊藿苷能溶解在醇中，因此选用醇水溶液作为反应液，醇选用常用的乙醇，其成本低，且污染小。因为水解反应在乙醇中进行，酶较易失活，故反应

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时间不宜过长，因此选用时间在20-30小时，这时去糖解反应基本完成。优选β-Glycosidase用量与淫羊藿苷的重量比为1∶5，酶解反应条件是50℃的醇-水溶液中反应24小时。 本发明在酶解反应后只用将反应混合液离心处理弃上清液，再用丙酮溶解后离心处理，过滤，弃滤渣，滤液蒸干即得到淫羊藿素，非常简单方便，易于工业化生产。淫羊藿素还可以利用重结晶的方法进一步纯化中，得到高纯度的产物，重结晶溶剂采用丙酮-水混合溶剂。本发明经过纯化后所得淫羊藿素的收率达55％。

本发明可以采用市售的淫羊藿苷进行酶解，同时还可以自行从淫羊藿药材中自行提取，自行提取的好处在于可以节约成本，同时还可以监控杂质含量，从而针对性采用各种方式除去某些杂质。

淫羊藿苷的制备包括淫羊藿总黄酮的提取和淫羊藿苷的纯化，所述淫羊藿总黄酮的提取步骤包括用水煮沸提取淫羊藿，然后合并提取液浓缩至0.2g淫羊藿生药材/ml，用D101大孔树脂柱吸附(D101大孔树脂柱在使用前要将其上面吸附的一些有机溶剂清洗干净再装柱，D101大孔树脂用量为淫羊藿生药材的1-2倍，浓缩液的上柱流速为5个柱体积/h，洗脱液用量为3-4个柱体积，使分离效果更好。)，用乙醇-水梯度洗脱。先用水洗至洗脱液至淡黄色，再用30％乙醇洗脱，约4个柱，然后50％乙醇洗脱，该洗脱液为淫羊藿总黄酮产物，收集浓缩，产率为2％左右(即100g淫羊藿药材可以得到2g左右的淫羊藿总黄酮)。再用90％乙醇、水冲洗D101大孔树脂柱回用。淫羊藿总黄酮经过HPLC检测，含有淫羊藿苷25％左右，要进行酶解反应需进一步纯化。

淫羊藿苷的纯化采用硅胶层析柱分离纯化法，采用10∶0，9∶1，8∶1，7∶1，6∶1的三氯甲烷-甲醇梯度洗脱；用TLC法检测，展开剂选用三氯甲烷∶甲醇∶甲酸＝8∶2∶0.2，Rf值为0.5-0.6之间，收取含淫羊藿苷馏份，浓缩。所得淫羊藿苷还需要进一步纯化，用甲醇重结晶，滤出物依次用丙酮，甲醇洗涤。这样得到的产物淫羊藿苷的纯度达到95％左右，完全满足下一步的酶解反应的要求。

本发明采用β-葡萄糖苷酶为淫羊藿苷进行酶解反应，其去糖解完全，且收率很高，采用自行设计的从淫羊藿药材中提取淫羊藿苷，整个工艺过程操作简便，反应后处理方便，产物纯度完全符合药用标准。附图说明

图1实施例1制得的淫羊藿苷元(淫羊藿素)HPLC图谱 图2实施例2制得的淫羊藿素HPLC图谱 图3淫羊藿总黄酮HPLC图谱 图4淫羊藿苷HPLC图谱

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图5实施例3制得的淫羊藿素HPLC图谱 具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

(实施例1、2是采用的淫羊藿苷为市售产品，纯度98％以上，实施例3淫羊藿苷为自制的产品，β-葡萄糖苷酶(β-Glycosidase)为天野酶制剂公司产品。) 实施例1

1.淫羊藿苷的酶解  淫羊藿苷100g，加入20％乙醇5000ml，搅拌溶解，加入10g β-葡萄糖苷酶，60℃下水解反应20小时。

2.反应液的后处理：对反应液进行离心处理，弃去上清液。沉淀用2500ml丙酮溶解，溶液进行离心处理，取出上清液，滤过，弃取不溶物，上清液蒸干。 3.淫羊藿素(苷元)纯品制备：

加丙酮-水(1∶1)1500ml重结晶，放置，析晶，过滤，干燥，即得淫羊藿苷元纯品29g。经HPLC检测纯度达98％以上。(如图1)HPLC条件为乙腈-1％冰醋酸水溶液70∶30，检测波长273nm。熔点：高于250℃。 总得率：53.3％。 实施例2

1.淫羊藿苷的酶解  淫羊藿苷100g，加入20％乙醇5000ml，搅拌溶解，加入100g β-葡萄糖苷酶，40℃下水解反应30小时。

2.反应液的后处理：对反应液进行离心处理，弃去上清液。沉淀用2500ml丙酮溶解，溶液进行离心处理，取出上清液，滤过，弃取不溶物，上清液蒸至每克25ml(相对于淫羊藿苷)。 3淫羊藿苷元纯品制备：

取浓缩的上清液，加等量的水重结晶，放置，析晶，过滤，干燥，即得淫羊藿苷元纯品30.2g。经HPLC检测纯度达98％以上。(如图2)HPLC条件为乙腈-1％冰醋酸水溶液70∶30，检测波长273nm.。

总得率55.5％。

因为在后处理时用到溶剂丙酮，而重结晶时又用到溶剂丙酮，因此可以节约些步骤，省时工艺时间。 实施例3

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3.1淫羊藿总黄酮的提取

3.1.1粉碎：将淫羊藿干燥药材10000g粉碎，装入提取罐中。

3.1.2提取：加16倍量水煎煮3次，第一次2h，以后每次1.5h。合并3次的提取液，过滤，减压浓缩至0.2g生药材/ml的溶液。

3.1.3树脂纯化：提取液通过预先处理好的D101大孔树脂柱吸附总黄酮(树脂用量约为药材的1.5倍。)。提取液上柱的流速为5个柱体积/h。吸附后先用水洗脱至水洗脱液呈淡黄色，约4个柱体积，再分别用30％乙醇，约4个柱体积，50％乙醇，约4个柱体积，90％乙醇处理后，水洗备用。

3.1.4浓缩：减压下浓缩50％乙醇洗脱部分，60℃下真空干燥，粉碎，即得200g产品。 3.1.5测定：总黄酮的收率：2％左右(即100g药材可以得到2g总黄酮)，HPLC法测定淫羊藿苷为含量25％左右。如图3.(测定方法参见2005版中国药典第一部229页) 3.2淫羊藿苷的纯化

3.2.1样品：淫羊藿药材50％乙醇提取物200g(步骤3.1的产物)，甲醇-水溶解，用60-100目硅胶拌样(样品(g)∶硅胶(g)＝1∶2)，晾干，研成细粉备用。

3.2.2装柱：湿法装柱。填料与样品比例约为1∶10(重量比)，用三氯甲烷浸泡硅胶，装入层析柱，平衡柱床至柱床高度不再变化为止。 3.2.3上样：干法上样。

3.2.4洗脱：用三氯甲烷-甲醇(10∶0，9∶1，8∶1，7∶1，6∶1)梯度洗脱，TLC跟踪检测淫羊藿苷是

否洗脱出来。其中，10∶0，9∶1两个梯度，每个梯度洗脱10个柱体积。8∶1梯度开始检测出淫羊藿苷，洗脱20柱体积。7∶1和6∶1梯度各洗脱直至洗脱30个柱体积。

3.2.5进一步纯化：经TLC检测，三氯甲烷-甲醇-甲酸8∶2∶0.2展开，Rf值0.6，合并含淫羊藿苷的馏分，减压蒸干，将固体用热甲醇转移到三角瓶中，放置直至析出淡黄色粉末，抽滤。 得到的固体，依次用丙酮，甲醇洗涤，最终得到95％左右的淫羊藿苷的粗品20g。 结果如图4.HPLC条件乙腈-1％冰醋酸水溶液28∶72。熔点：230～232℃。 该步骤淫羊藿苷的收率约为10％。(即100g总黄酮可以得到10g淫羊藿苷) 3.3淫羊藿素的制备 3.3.1淫羊藿苷酶解反应：

淫羊藿苷粗品20g，50倍加入20％的乙醇，50℃下搅拌1h，经β-葡萄糖苷酶(酶用量与底物用量比分别为1∶5)，50℃下水解反应24h。 3.3.2反应液的后处理：

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对反应液进行离心处理，弃去上清液。沉淀用25倍量丙酮溶解，溶液进行离心处理，取出上清液，滤过，弃取不溶物，上清液蒸至每克25ml(相对于淫羊藿苷)。 3.3.3淫羊藿苷元纯品制备：

取浓缩的上清液，加等量的水重结晶，放置，析晶，过滤，干燥，即得淫羊藿苷元纯品6g。 液相检测结果如图5.HPLC条件：乙腈-1％冰醋酸水溶液70∶30，检测波长280nm熔点：高于250℃.该步骤得率：该步骤得率为55％。

采用自制的淫羊藿苷，其纯度只用控制成95％以上，其酶解产物也很完全，制得的淫羊藿苷完全能达到药用标准。该工艺的总收率为2％×10％×55％＝0.11％。

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图2

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图3

图4

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图5

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