(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 106580851 A(43)申请公布日 2017.04.26
(21)申请号 201611130462.0(22)申请日 2016.12.09
(71)申请人 北京雨泽瑞清生物科技有限公司
地址 100000 北京市平谷区兴谷经济开发
区6区305-851号(72)发明人 孙博
(74)专利代理机构 北京细软智谷知识产权代理
有限责任公司 11471
代理人 王淑玲(51)Int.Cl.
A61K 8/98(2006.01)A61Q 19/00(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页
(54)发明名称
一种间充质干细胞提取物、其提取方法和应用
(57)摘要
本发明提供了一种间充质干细胞提取物、其提取方法和应用。所述提取方法包括以下步骤：A、使用MSC无血清培养基培养人脐血间充质干细胞，并分离人脐血间充质干细胞和培养液；B、将人脐血间充质干细胞裂解，并加入所述培养液得到蛋白悬液；C、将所述蛋白悬液浓缩，得到浓缩液，即为间充质干细胞提取物浓缩液。利用所述提取方法得到的间充质干细胞提取物中包含GDF11、IGFBP-1和IGFBP-2在内的许多强效抗衰老因子，能够应用于美容产品中，起到对皮肤抗衰老修复和美容作用。CN 106580851 ACN 106580851 A
权 利 要 求 书
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1.一种间充质干细胞提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：A、使用MSC无血清培养基培养人脐血间充质干细胞，并分离人脐血间充质干细胞和培养液；
B、将人脐血间充质干细胞裂解，并加入所述培养液得到蛋白悬液；C、将所述蛋白悬液浓缩，得到浓缩液，即为间充质干细胞提取物浓缩液。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤A中，所述MSC无血清培养基还含有浓度为10ng/mL的bFGF和10ng/ml的EGF。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤A中，所述人脐血间充质干细胞为离体培养3代以后的人脐血间充质干细胞，其中90％以上的细胞的表面抗原表型为：CD34-、CD45-、CD3-、CD73+、CD105+且CD90+。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤B中，将109人脐血间充质干细胞中加入1-10mL的1×PBS中混匀后，加入0.1-5ug蛋白酶抑制剂，并破碎离心，离心后去上清液，将上清液加入1L所述培养液中得到蛋白悬液。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤C中，将所述蛋白悬液使用醋酸纤维素膜或透析袋分离浓缩相对分子质量为100-1000的物质，得到间充质干细胞提取物浓缩液。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤C中，将所述蛋白悬液浓缩后，将浓缩液冷冻干燥，得到间充质干细胞提取物冻干粉。
7.一种间充质干细胞提取物，其特征在于，由权利要求1-6任一所述的提取方法提取而成。
8.权利要求7所述的间充质干细胞提取物作为美容原料的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，当所述间充质干细胞提取物为间充质干细胞提取物浓缩液时，所述间充质干细胞提取物浓缩液在美容产品中的质量分数为10-100％；当所述间充质干细胞提取物为间充质干细胞提取物冻干粉时，所述间充质干细胞提取物冻干粉在美容产品中的含量为2-1000ug/mL。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述美容产品为面霜、润肤露、爽肤水或面膜原料。
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说 明 书
一种间充质干细胞提取物、其提取方法和应用
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技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞提取物、其提取方法和应用。
背景技术[0002]成体干细胞维持着人体组织的新陈代谢，他们本身处于较为原始的状态，能够在环境信号的调节下增殖分裂，并分化为最终的功能性细胞。为维持干细胞的原始状态，干细胞自身分泌了许多调控性蛋白和信号因子。已经证明干细胞自身的蛋白成分和分泌组分对人的皮肤再生和修复过程有极好的促进作用。[0003]科学数据表明，干细胞随着人的年龄增长无论从数量和质量上都有所降低，这是人体衰老的关键因素。生存时间和复制次数的增加，会导致干细胞内基因水平上错误信号的积累，这意味着，即便能够获得这些细胞并实现扩增，这些细胞的干细胞特性也受到了损害。[0004]而目前的美容产品，无法提供干细胞抗衰老因子，从而造成皮肤抗衰老修复和美容效果有限。
发明内容[0005]为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种间充质干细胞提取物、其提取方法和应用。利用所述提取方法得到的间充质干细胞提取物中包含GDF11、IGFBP-1和IGFBP-2在内的许多强效抗衰老因子，能够应用于美容产品中，起到对皮肤抗衰老修复和美容作用。[0006]本申请的发明人，从获得年轻态的间充质干细胞出发进行研究，脐血是胎儿组织因此脐血组织中的间充质干细胞是最年轻的一类干细胞，经发明人研究发现，人脐血间充质干细胞中包括高浓度的GDF11、IGFBP-1和IGFBP-2在内的许多强效抗衰老因子，故对其进行提取浓缩后，能够应用于美容产品中。[0007]本发明所采用的技术方案为：一种间充质干细胞提取物的提取方法，包括以下步骤：[0008]A、使用MSC无血清培养基培养人脐血间充质干细胞，并分离人脐血间充质干细胞和培养液；[0009]B、将人脐血间充质干细胞裂解，并加入所述培养液得到蛋白悬液；[0010]C、将所述蛋白悬液浓缩，得到浓缩液，即为间充质干细胞提取物浓缩液。[0011]所述间充质干细胞提取物浓缩液中含有多种强效抗衰老因子。[0012]为提高人脐血间充质干细胞的培养效率，优选的技术方案是，步骤A中，所述MSC无血清培养基还含有浓度为10ng/mL的bFGF和10ng/ml的EGF。[0013]进一步地，步骤A中，所述人脐血间充质干细胞为离体培养3代以后的人脐血间充质干细胞，其中90％以上的细胞的表面抗原表型为：CD34-、CD45-、CD3-、CD73+、CD105+且
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说 明 书
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CD90+。
为使人脐血间充质干细胞充分裂解，优选的技术方案是，步骤B中，将109人脐血间
充质干细胞中加入1-10mL的1×PBS(pH值＝7.4)中混匀后，加入0.1-5ug蛋白酶抑制剂，并破碎离心，离心后去上清液，将上清液加入1L所述培养液中得到蛋白悬液。[0015]根据本发明的一个实施例，所述1×PBS的pH值为7.4。[0016]为进一步提高最终产品中强效抗衰老因子的含量，优选的技术方案是，步骤C中，将所述蛋白悬液使用醋酸纤维素膜或透析袋分离浓缩相对分子质量为100-1000的物质，得到间充质干细胞提取物浓缩液。[0017]为进一步便于保存和使用，还可以将所述间充质干细胞提取物制成冻干粉，具体操作为：步骤C中，将所述蛋白悬液浓缩后，将浓缩液冷冻干燥，得到间充质干细胞提取物冻干粉。[0018]本发明还提供了一种间充质干细胞提取物，所述间充质干细胞提取物由上述提取方法提取而成。[0019]本发明还公开了所述间充质干细胞提取物作为美容原料的应用。[0020]所述间充质干细胞提取物能够作为添加剂添加至美容产品中，使用不同的间充质干细胞提取物时，在美容产品的含量也不同：当所述间充质干细胞提取物为间充质干细胞提取物浓缩液时，所述间充质干细胞提取物浓缩液在美容产品中的质量分数为10-100％；当所述间充质干细胞提取物为间充质干细胞提取物冻干粉时，所述间充质干细胞提取物冻干粉在美容产品中的含量为2-1000ug/mL。[0021]所述美容产品为面霜、润肤露、爽肤水或面膜原料。[0022]本发明提供了一种间充质干细胞提取物、其提取方法和应用。利用所述提取方法得到的间充质干细胞提取物中包含GDF11、IGFBP-1和IGFBP-2在内的许多强效抗衰老因子，能够应用于美容产品中，起到对皮肤抗衰老修复和美容作用。
[0014]
具体实施方式[0023]下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。[0024]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。[0025]实施例1[0026]一种间充质干细胞提取物的提取方法，包括以下步骤：[0027]A、使用MSC无血清培养基培养离体培养3代以后的人脐血间充质干细胞，所述MSC无血清培养基还含有浓度为10ng/mL的bFGF和10ng/ml的EGF，其中90％以上的细胞的表面抗原表型为：CD34-、CD45-、CD3-、CD73+、CD105+且CD90+；培养完成后分离人脐血间充质干细胞和培养液；[0028]其中，离体培养液的成分为：向培养α-MEM培养基中添加0.5％的Pen-Strep，100ng/mL的b-FGF，5ng/mL的EGF和100ng/mL的TGF-β；其中，α-MEM为α-最小必需极限培养基；Pen-Strep为青霉素-链霉素，b-FGF为b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因
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说 明 书
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子，TGF-β为转化生长因子。[0029]B、将109人脐血间充质干细胞中加入1mL的1×PBS(pH值＝7.4)中混匀后，加入5ug蛋白酶抑制剂，放置于冰上在超声破碎仪中破碎3分钟，破碎后在20000rpm离心15min，离心后去上清液，将上清液加入1L所述培养液中得到蛋白悬液；[0030]C、将所述蛋白悬液使用醋酸纤维素膜分离浓缩相对分子质量为100-1000的物质，得到间充质干细胞提取物浓缩液。[0031]实施例2[0032]一种间充质干细胞提取物的提取方法，包括以下步骤：[0033]A、使用MSC无血清培养基培养离体培养3代以后的人脐血间充质干细胞，所述MSC无血清培养基还含有浓度为10ng/mL的bFGF和10ng/ml的EGF，其中90％以上的细胞的表面抗原表型为：CD34-、CD45-、CD3-、CD73+、CD105+且CD90+；培养完成后分离人脐血间充质干细胞和培养液；[0034]其中，离体培养液的成分为：向培养α-MEM培养基中添加2％的Pen-Strep，5ng/mL的b-FGF，100ng/mL的EGF和5ng/mL的TGF-β；其中，α-MEM为α-最小必需极限培养基；Pen-Strep为青霉素-链霉素，b-FGF为b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，TGF-β为转化生长因子。[0035]B、将109人脐血间充质干细胞中加入10mL的1×PBS(pH值＝7.4)中混匀后，加入0.1ug蛋白酶抑制剂，放置于冰上在超声破碎仪中破碎10分钟，破碎后在10000rpm离心25min，离心后去上清液，将上清液加入1L所述培养液中得到蛋白悬液；[0036]C、将所述蛋白悬液使用截留分子量为100-1000的透析袋分离浓缩相对分子质量为100-1000的物质，得到间充质干细胞提取物浓缩液。[0037]实施例3[0038]一种间充质干细胞提取物的提取方法，包括以下步骤：[0039]A、使用MSC无血清培养基培养离体培养3代以后的人脐血间充质干细胞，所述MSC无血清培养基还含有浓度为10ng/mL的bFGF和10ng/ml的EGF，其中90％以上的细胞的表面抗原表型为：CD34-、CD45-、CD3-、CD73+、CD105+且CD90+；培养完成后分离人脐血间充质干细胞和培养液；[0040]其中，离体培养液的成分为：向培养α-MEM培养基中添加1％的Pen-Strep，50ng/mL的b-FGF，10ng/mL的EGF和10ng/mL的TGF-β；其中，α-MEM为α-最小必需极限培养基；Pen-Strep为青霉素-链霉素，b-FGF为b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，TGF-β为转化生长因子。[0041]B、将109人脐血间充质干细胞中加入5mL的1×PBS(pH值＝7.4)中混匀后，加入2.5ug蛋白酶抑制剂，放置于冰上在超声破碎仪中破碎6分钟，破碎后在15000rpm离心20min，离心后去上清液，将上清液加入1L所述培养液中得到蛋白悬液；[0042]C、将所述蛋白悬液使用醋酸纤维素膜分离浓缩相对分子质量为100-1000的物质，得到间充质干细胞提取物浓缩液，取1-5ml间充质干细胞提取物浓缩液加入到西林瓶中，在冷冻干燥仪中冷冻干燥得到间充质干细胞提取物冻干粉，压盖密封后贴签，放置-80℃冰箱保存。[0043]实施例4
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本实施例为所述间充质干细胞提取物的应用。
[0045]取1g实施例3中得到的间充质干细胞提取物冻干粉，用200ml超纯水进行溶解，分装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，即可得到皮肤再生修复精华液。所述皮肤再生修复精华液保存在4℃条件下，保质期为1个月。[0046]当然，使用不同的间充质干细胞提取物时，在美容产品的含量也不同：当所述间充质干细胞提取物为间充质干细胞提取物浓缩液时，所述间充质干细胞提取物浓缩液在美容产品中的质量分数为10-100％；当所述间充质干细胞提取物为间充质干细胞提取物冻干粉时，所述间充质干细胞提取物冻干粉在美容产品中的含量为2-1000ug/mL。[0047]最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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