一种表达纯化重组CXCL9蛋白的方法及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108707193 A(43)申请公布日 2018.10.26

(21)申请号 201810501425.9(22)申请日 2018.05.23

(71)申请人 上海交通大学

地址 200240 上海市闵行区东川路800号 申请人 复旦大学附属华山医院

(72)发明人 路慧丽　朱建伟　罗晗　张浩　

王燕　石伟　陆吉麟　(74)专利代理机构 上海汉声知识产权代理有限

公司 31236

代理人 封喜彦　胡晶(51)Int.Cl.

C07K 14/52(2006.01)C07K 1/22(2006.01)C07K 1/18(2006.01)C12N 15/70(2006.01)

()发明名称

一种表达纯化重组CXCL9蛋白的方法及其应用

(57)摘要

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种利用促溶标签和内含肽(Intein)融合表达实现重组CXCL9蛋白在大肠杆菌可溶性表达的方法及其应用。所述方法将目的蛋白与促溶标签及具有自剪切功能的Intein融合表达，从而实现目的蛋白的可溶性表达及剪切释放。与已知的大肠杆菌表达重组CXCL9蛋白的方法相比，本发明所述方法可避免包涵体变性复性过程，并无需引入蛋白酶，能够得到序列完全天然的目标产物，对于放大规模的工业生产具有很好的应用前景。

权利要求书2页 说明书11页

序列表3页 附图4页

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1.一种表达纯化重组CXCL9蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建CXCL9融合蛋白表达载体：将CXCL9蛋白编码基因序列与具有自剪接功能的内含肽编码基因序列以及促溶标签编码基因序列融合后获得融合蛋白表达单元，并将所述融合蛋白表达单元插入表达质粒上，构建获得融合蛋白表达载体；

(2)将步骤(1)中所得融合蛋白表达载体转化宿主，获得转化的宿主，并在表达的条件下培养转化的宿主至所需的菌种密度，诱导表达由标签、内含肽、CXCL9组成的融合蛋白，通过内含肽的剪切作用释放目的蛋白--重组CXCL9蛋白；

(3)诱导结束后收集宿主菌，破碎后去除不溶性物质，提取上清液，得到可溶性的重组CXCL9蛋白；

(4)进行重组CXCL9蛋白的分离纯化，得到纯的重组CXCL9蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述促溶标签为具有可溶性的蛋白表达或纯化标签。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述促溶标签选自Zbasic、Zbasic2、FATT、sumo、MBP、Fh8的一种或几种，其中，所述Zbasic的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述促溶标签与其他纯化标签进行联合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Intein选自具有C-端自剪切功能的已知各类Intein的顺式及反式剪接形式。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述内含肽为来源于MtuRecA内含肽的ΔI-CM，其编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述促溶标签和内含肽组合为新的标签，整体用于CXCL9的表达。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述促溶标签编码基因序列与内含肽编码基因序列之间直接连接，或采用柔性肽端连接。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养是将单菌落接种于添加有Kana+的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时，作为种子菌；取种子菌接种于新鲜的培养基37℃培养至合适菌密度后，加诱导剂，在20℃～37℃温度下继续培养3～20h。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，通过离子交换层析和/或羟基磷灰石柱层析实现目的蛋白的纯化。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析是采用含有酸性官能集团、在溶液中能够解离-H+的凝胶介质，对重组CXCL9蛋白进行有选择的吸附和洗脱，以达到富集与纯化的作用；

所述羟基磷灰石柱层析设置为能够特异性吸附重组CXCL9蛋白，而不吸附等电点相近的杂蛋白组分。

12.如权利要求1-11任一所述的方法在表达纯化目的蛋白中的用途。13.一种表达纯化生物大分子目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法将目的蛋白与促溶标签及具有自剪切功能的内含肽融合后插入表达质粒，之后通过转化宿主、在表达的条件下培养宿主，并诱导表达由标签、内含肽、CXCL9组成的融合蛋白，通过内含肽的剪切作用

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释放目的蛋白--重组CXCL9蛋白，实现目的蛋白的可溶性表达及剪切释放。

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一种表达纯化重组CXCL9蛋白的方法及其应用

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技术领域

[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种综合运用促溶标签和内含肽实 现重组CXCL9蛋白可溶性表达的方法及其应用。

背景技术[0002]酶、蛋白、抗体等重组蛋白类产品在人们的生产、生活、医疗中发挥着 不可或缺的作用，尤其是重组蛋白、单克隆抗体等生物技术药物是20世纪后 期随着生命科学的发展而出现的最新一代药物，具有高效、低毒、生物功能 明确等一系列优势。[0003]然而以重组蛋白、多克隆抗体为代表的生物技术药物分子量大，结构复 杂，在表达、纯化、质量控制等方面还存在相当大的技术困难。作为上游阶 段的蛋白表达，很大程度上影响后续纯化及质量控制工作，因此提高表达水 平及效率具有重要价值。[0004]大肠杆菌原核表达系统具有生产周期短、培养成本低等优点，是重组蛋 白的主要表达体系之一，许多重组蛋白药物通过其成功制备生产。重组蛋白 药物主要来源于哺乳动物细胞，多含有二硫键等复杂结构，而大肠杆菌胞内 缺乏合适的氧化还原环境，因此这些蛋白在大肠杆菌中过表达时易形成无规 则结构的包涵体，必须通过繁琐的变性复性步骤才能得到有生物学活性的产 物。为避免低效的变性和复性过程，人们开发了各种方法在大肠杆菌中实现 目的蛋白的正确折叠、可溶性表达，包括降低诱导温度，优化培养基组分， 共表达分子伴侣共表达，采用促溶标签等。促溶标签是最常用的方法之一， 包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽转移酶(GST)、硫氧还蛋白(Trx)， 泛素样修饰蛋白(Sumo)，以及近年发现的超碱性标签例如Zbasic以及超酸 性标签例如FATT等。采用促溶标签，尤其是促溶与亲和功能兼备的标签在很 大程度上实现了大肠杆菌中重组蛋白的可溶性表达，从而显著促进了蛋白的 研究和应用。但在药用重组蛋白的制备中，需彻底除去标签，以保证目的蛋 白的序列完全天然，以降低免疫原性及其他潜在风险。以往的研究中，多在 融合表达时标签和目的蛋白之间插入一段蛋白酶的识别序列，在纯化过程的 某一阶段在体系中加入外源蛋白酶，特异性将标签从目的蛋白切除。常用的 蛋白酶包括TEV蛋白酶，Rhinovirus 3C蛋白酶，Xa因子等。然而外源性蛋 白酶的去除及验证将增加工艺的复杂程度。[0005]趋化因子CXCL9(C-X-C motif chemokine 9)是缺乏ELR结构域的CXC 趋化因子亚族之一，主要作用于活化的T淋巴细胞和NK细胞等，同时也是 一种重要的血管稳定因子，在体内外均被证明具有抑制血管生成的作用。 CXCL9在许多疾病中发挥重要功能，包括外部感染、肿瘤治疗、自体免疫性 疾病、移植排斥及造血干细胞增殖等。然而，重组CXCL9蛋白的制备尚 存在较大困难，在昆虫细胞、哺乳动物细胞的表达产量较低，难于实现大规 模生产，而在大肠杆菌系统中表达量虽然较高，但易形成包涵体，必须通过 繁琐的变性复性步骤才能得到有生物学活性的产物。

发明内容

[0006]本发明提供一种综合运用促溶标签和内含肽实现重组CXCL9蛋白可溶性 表达纯

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化的方法及其应用。

[0007]为避免外源性蛋白酶的去除及验证增加工艺的复杂程度，提高重组 CXCL9蛋白的生产工艺，本发明采用促溶标签与Intein结合，具体是采用具 有C-端自剪切的内含肽(Intein)与促溶标签及目的蛋白融合表达，能够在表 达纯化过程中发挥Intein活性，从而在不添加外源蛋白酶的情况下获得目的蛋 白的精确释放，实现重组CXCL9蛋白的可溶性表达及纯化。本发明采用的 Intein是C-端自剪切的，采用C-端自剪切相对于其他端如N-端自剪切的优点 是，目的蛋白最终产品的N端可以不带Met。

[0008]本发明所述方法将重组CXCL9蛋白与具有自剪接功能的内含肽(Intein) 以及促溶标签融合表达，可通过离子交换层析快速实现目的蛋白的纯化。[0009]与传统方法相比，本发明所述方法可实现目的蛋白可溶性表达，且不需 外源性酶的应用，对于放大规模的工业生产具有很好的应用前景。[0010]本发明的另一创新性在于，由于Intein的活性较为困难，因此以往报 道中均首先纯化与Intein融合的蛋白，再在纯化过程中增强Intein的活性从而 释放目的蛋白，而本发明中，则通过筛选不同的标签及目的蛋白的组合、培 养和诱导条件优化如培养基成分、诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等，使 得Intein具有较高活性，融合蛋白表达后旋即剪切释放目的蛋白，从而省却融 合蛋白的纯化步骤。[0011]本发明的技术方案如下：

[0012]本发明的第一方面提供了一种表达纯化重组CXCL9蛋白的方法，所述方 法具体包括如下步骤：[0013](1)构建CXCL9融合蛋白表达载体：将CXCL9蛋白编码基因序列与具 有自剪接功能的Intein编码基因序列以及促溶标签编码基因序列融合后获得 融合蛋白表达单元，并将所述融合蛋白表达单元插入表达质粒上，构建获得 融合蛋白表达载体；[0014](2)将步骤(1)中所得融合蛋白表达载体转化宿主，获得转化的宿主， 并在表达条件下，培养转化的宿主至所需的菌种密度，例如达到对数生长期， 诱导表达由标签、Intein、CXCL9组成的融合蛋白，其通过Intein的剪切作用 释放目的蛋白--重组CXCL9蛋白；诱导表达的方法可以为加入诱导剂；[0015](3)诱导结束后收集宿主菌，破碎后去除不溶性物质，提取上清液，得 到可溶性的重组CXCL9蛋白；[0016](4)分离目的蛋白：根据重组CXCL9蛋白的理化性质选择现有的合适 的方法进行目的蛋白的分离，得到纯的目的蛋白。例如，将步骤(3)中所得 溶液进行离子交换层析及羟基磷灰石柱层析，洗脱得到目的蛋白。[0017]所述CXCL9蛋白包括人源、小鼠、大鼠等不同种属的CXCL9蛋白，由 于物种保守性较高，皆可采用本发明方法进行制备。[0018]在本发明的实施例中，所述重组CXCL9蛋白包括来源于小鼠的mCXCL9 (SEQ ID No.3)及来源于人的hCXCL9(SEQ ID No.4)等。[0019]优选的，步骤(1)中，所述促溶标签为Zbasic、FATT、sumo、MBP等 具有可溶性的蛋白表达或纯化标签，包括但不限于Zbasic，Zbasic2等，所述 Zbasic的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。优选的促溶标签为Zbasic， FATT，它们与目的蛋白结合后使得Intein具有较高活性。

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所述促溶标签可以与其他纯化标签进行联合，例如His，CBD，抗体Fc 片段等。

[0021]优选的，步骤(1)中，所述Intein选自具有C-端自剪切功能的已知各类 Intein的顺式及反式剪接形式。更优选地，步骤(1)中，所述Intein为ΔI-CM， 所述ΔI-CM的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。[0022]优选的，所述促溶标签和intein组合为新的标签，整体用于CXCL9的表 达。更优选地，所述促溶标签的编码基因序列与Intein的编码基因序列之间可 以直接连接，也可以采用GGGGS或GGSG及其重复等柔性肽端连接。[0023]优选的，步骤(1)中，所述表达质粒为采用T7、lac、tac、araBAD、FLD1、 AOX1、GAP、CMV、E1α等启动子的适用于原核或真核表达系统的质粒。 更优选地，步骤(1)中所述表达质粒为pET系列载体。更优的，所选表达质 粒为pET30a载体。更优的，所述融合蛋白表达单元的序列插入到pET30a原 核表达载体(即前述的pET30a载体)的Nde I酶和Xho I酶的性酶切位 点之间。[0024]优选的，步骤(2)中，所述宿主为大肠杆菌BL21(DE3)，BL21-AI或 Rosetta(DE3)等。

[0025]优选的，步骤(2)中，所述培养是将单菌落接种于添加有Kana+的LB 液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时，作为种子菌；取种子菌接种 于新鲜的培养基37℃培养至合适菌密度后，加诱导剂，在20℃～37℃温度 下继续培养3～20h。[0026]优选的，步骤(3)中，所述离子交换层析具体是采用含有酸性基团、在 溶液中能够解离-H+(如磺酸基－SO3H、羧基－COOH)的凝胶介质，例如 SP Sehparose,CM Sepharose,Capto S,Mono S等，对重组CXCL9蛋白进行有 选择的吸附和洗脱，以达到富集与纯化的作用。

[0027]优选的，步骤(3)中，所述羟基磷灰石柱层析设置为能够特异性吸附重 组CXCL9蛋白，而不吸附等电点相近的杂蛋白组分，从而实现重组CXCL9 蛋白的纯化与富集。[0028]本发明第二方面提供了一种前述的方法在表达纯化目的蛋白中的用途。[0029]优选的，所述目的蛋白为生物大分子目的蛋白，选自细胞因子、酶、抗 菌肽、抗体或抗体片段等各种基因重组药物产品。更优选为细胞因子。[0030]更优选地，所述目的蛋白例如为与CXCL9结构类似的细胞因子类蛋白。[0031]本发明第三方面提供了一种表达纯化生物大分子目的蛋白的方法，将目 的蛋白与促溶标签及具有自剪切功能的内含肽融合后插入表达质粒，之后通 过转化宿主、在表达的条件下培养宿主，并诱导表达由标签、内含肽、CXCL9 组成的融合蛋白，通过内含肽的剪切作用释放目的蛋白--重组CXCL9蛋白， 实现目的蛋白的可溶性表达及剪切释放。[0032]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0033]1)该方法所采用的标签和Intein系统，与目的蛋白单独表达的传统技术 相比，能够克服目的蛋白在原核表达系统易形成包涵体的缺点，使目的蛋白 实现可溶性表达，方便后续纯化；

[0034]2)本发明与常见的亲和标签和蛋白酶组合的技术相比，能够免除外源性 蛋白酶的使用，降低成本，简化纯化步骤。[0035]当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优 点。

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附图说明

[0036]图1是本发明的促溶标签和Intein介导重组CXCL9蛋白可溶性表达纯化 的技术示意图；

[0037]图2是本发明实施例1的Intein介导的CXCL9可溶性表达质粒的构建， 其中a为融合表达的Zbasic-ΔI-CM-CXCL9，b为单独表达CXCL9的质粒；

[0038]图3是本发明实施例1的CXCL9蛋白的可溶性表达SDS-PAGE鉴定；[0039]图4是本发明实施例2的采用FATT及Fh8标签实现CXCL9蛋白的可溶 性表达SDS-PAGE鉴定；

[0040]图5为本发明实施例3的SP FF和CHT I两步纯化 Zbasic-ΔI-CM-mCXCL9可溶表达的mCXCL9蛋白；

[0041]图6为本发明实施例4的可溶性表达纯化的mCXCL9终产品的 SEC-HPLC色谱图谱；[0042]图7为本发明实施例5的HUVEC增殖实验检测mCXCL9蛋白产品生物 学活性；[0043]图8为本发明实施例6的采用本发明方法的h重组CXCL9蛋白可溶性 表达SDS-PAGE鉴定。

具体实施方式

[0044]请参见图1，本发明公开了一种利用促溶标签和内含肽(Intein)融合表达实 现重组CXCL9蛋白在大肠杆菌可溶性表达的方法及其应用。所述方法将目的 蛋白与促溶标签及具有自剪切功能的Intein融合表达，从而实现目的蛋白的可 溶性表达及剪切释放。与已知的大肠杆菌表达重组CXCL9蛋白的方法相比， 本发明所述方法可避免包涵体变性复性过程，并无需引入蛋白酶，能够得到 序列完全天然的目标产物，对于放大规模的工业生产具有很好的应用前景。

[0045]在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不 局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语 是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了本发明的保护范围；在本 发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一”和“这 个”包括复数形式。[0046]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范 围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本 发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相 同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人 员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的 方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本 发明。

[0047]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采 用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、 细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已 有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，19and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the 

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series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition， Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304， Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego， 1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。[0048]下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。[0049]实施例1

[0050]pET30a/Zbasic-ΔI-CM-CXCL9质粒构建及mCXCL9的可溶性表达[0051]本实例中，我们以Zbasic作为促溶标签构建Intein(ΔI-CM)介导的融合 蛋白表达质粒，采用PCR及酶切连接方法，依次将Zbasic、ΔI-CM、mCXCL9 的序列同时进行连接并插入到pET30a质粒中，其中标签编码序列与内含肽编 码序列之间使用了柔性肽链，同时构建单独的PET30a/mCXCL9单独表达质 粒作为对照，构建方法如图2所示。[0052]质粒构建成功后转化BL21(DE3)宿主菌，挑取单克隆菌落接种于Kana+ 的LB液体培养中，37℃200rpm培养12小时，作为种子菌。取种子菌按 1:100体积比接种于无菌的Kana+LB培养基中，37℃200rpm培养3小时 后进行诱导，并于4小时后收集菌体，采用高压均质仪破碎细胞。将裂解菌 液4000g离心30分钟分离上清可溶性成分和沉淀包涵体成分，制备 SDS-PAGE样品。

[0053]根据mCXCL9条带的位置和所在组份，可判断其表达可溶性。本实施例 对此进行了测定，测定条件如下：37℃诱导Zbasic-ΔI-CM-CXCL9及单独 CXCL9，分离可溶性上清及包涵体成分进行电泳；泳道M：Marker；泳道Ind： 诱导后的菌液；泳道Sup：裂菌后的上清；泳道IB：裂菌后的包涵体；箭头 指示位置为目的蛋白mCXCL9，其理论分子量约为15kDa。结果如图3所示， 从图3中可见，采用Zbasic-ΔI-CM-CXCL9融合表达显著提高了mCXCL9蛋 白的表达可溶性。

[00]本实施例表明，采用本发明方法，融合表达的mCXCL9在表达后即从 intein的C端断裂，并以可溶形式存在于上清中，但单独表达的mCXCL9主 要以包涵体形式存在，因此本发明方法显著提高了目的蛋白的表达可溶性。[0055]实施例2

[0056]采用其他促溶标签实现mCXCL9的可溶性表达[0057]本实例中，我们采用其他两个促溶标签替换Zbasic，证实本发明方法的 外延性。我们选用FATT(SEQ ID NO.5)及Fh8(SEQ ID NO.6)两个标签， 采用PCR及酶切连接方法，依次将促溶标签、ΔI-CM、mCXCL9的序列连接 并插入到pET30a载体，获得pET30a/FATT-ΔI-CM-CXCL9和 pET30a/Fh8-ΔI-CM-CXCL9质粒，并转化BL21(DE3)宿主菌，如实施例1的 步骤进行诱导表达及SDS-PAGE和Western blot检测，如图4所示。[0058]检测条件如下：37℃诱导FATT-ΔI-CM-CXCL9及Fh8-ΔI-CM-CXCL9 表达，分离可溶性上清及包涵体成分进行SDS-PAGE(A)及Western blot(B)。 泳道M：Marker；泳道Ind：诱导后的菌液；泳道Sup：裂菌后的上清；泳道IB：裂菌后的包涵体；箭头指示位置为目的蛋白mCXCL9。从图4中结果可 见，两种融合表达策略均实现了mCXCL9蛋白的可溶性表达。[0059]从本实施例的结果可见，采用FATT或Fh8等促溶标签，采用本发明策略， 也能够显著提高大肠杆菌表达CXCL9蛋白的可溶性。

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实施例3

[0061]可溶性表达后的mCXCL9纯化

[0062]采用本发明方法获得mCXCL9蛋白的可溶性表达后，由于其等电点较高 (PI＝10.62)，适合采用阳离子交换层析进行纯化。具体方法为，表达m重组 CXCL9蛋白的宿主菌用50mM PB,pH 7.0的溶液重悬至10％浓度，经高压均 质破碎后，离心获得含有可溶性mCXCL9的上清液。选取SP FF介质进行阳 离子交换纯化，首先采用SPFF Loading Buffer(50mM PB,1mM EDTA,100 μM PMSF,pH 7.0)，1mL/min流速平衡层析柱，待紫外基线平稳后继续1 mL/min上样，使目的蛋白结合在SP FF介质上。上样完成后，继续采用Loading Buffer清洗柱子，并调整溶剂到pH 9.0准备洗脱。最后目的蛋白被Elution Buffer(50mM PB,1M NaCl,1mM EDTA,pH 9.0)以两步梯度(50％及100％) 洗脱，如图5中的A所示。但SP FF洗脱的蛋白含有部分杂蛋白，因此采用 羟基磷灰石CHT I型填料(Bio-Rad)进行第二步纯化。首先，SPFF纯化洗 脱所得样品于4℃，4000g 45min离心3次置换Buffer为CHT Loading Buffer (10mM PB,4mg/L Ca2+,pH 6.5)。Loading Buffer平衡CHT柱至UV280平 稳后1mL/min上样。再以Loading Buffer以1mL/min流速冲洗至UV280平 稳至基线，将缓冲液置换至Elution Buffer，流速1mL/min，20个柱体积线性 洗脱mCXCL9蛋白(图5中的B)。[0063]图5中，A:SP FF纯化图；B:CHT I纯化图；C:SDS-PAGE；D:Western Blot.泳道M:Marker；泳道Sup：破菌上清；泳道SP：SP FF洗脱产物；泳道 CHT:CHT洗脱产物。黑色箭头指向A、B中的mCXCL9洗脱峰，以及C、D 中的mCXCL9蛋白条带。[00]SDS-PAGE和Western blot检测可见，经过SP FF及CHT I两步纯化，可 得到纯度较高的mCXCL9终产品。[0065]实施例4

[0066]可溶性表达纯化mCXCL9蛋白的纯度检测

[0067]采用本发明方法在大肠杆菌系统可溶性表达纯化的m重组CXCL9蛋白 可采用分子筛色谱层析(SEC-HPLC)检测样品纯度：将G2000SWXL色谱柱 (G2000SWXL；5μm,0.78×30cm,Tosoh Biosciences,King of Prussia,USA) 连接在安捷伦1260HPLC系统中，前端连接SWXL保护柱。设置柱温20℃， 流动相采用磷酸盐缓冲液PBS，进样量25μL，流速0.75mL/min，280nm 波长检测并计算纯度。HPLC谱图如图6所示，主峰保留时间为12.674min， 采用安捷伦ChemStation软件，根据峰面积计算其终产品的纯度约为97.79％。[0068]实施例5

[0069]可溶性表达纯化mCXCL9蛋白的生物学活性检测

[0070]由于mCXCL9及hCXCL9具有很高的序列同源性及交叉生物学活性，因 此根据CXCL9的血管内皮细胞抑制作用，采用HUVEC细胞增殖实验进行m 重组CXCL9蛋白产品的生物学活性鉴定。具体方法为，将HUVEC细胞采用 完全培养基(ECM，5％fetal bovine serum，0.05mg/mL ECGS和100U/mL penicillin/streptomycin)，37℃5％CO2环境下培养。实验时，将HUVEC细 胞稀释按照每孔2500个细胞接种到96孔板，加入10ng/mL bFGF及以下梯 度终浓度的mCXCL9蛋白产品：0,0.03,0.1,0.33,1,3.33,10,33.3,100μ g/mL。继续培养96小时，采用CCK-8试剂检测HUVEC细胞的增殖，根据 450nm波长的光吸收值进行四参数非线性拟合，绘制细胞增殖抑制曲线如图 7，图7中可见，mCXCL9抑制HUVEC细胞增殖活性，并计算CXCL9蛋白 抑制HUVEC细胞增殖的IC50约为3.μg/mL。

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实施例6

[0072]hCXCL9的可溶性表达[0073]本实例中，我们进行重组hCXCL9(SEQ ID NO.4)的可溶性表达研究。 在以往研究中，与mCXCL9相似，hCXCL9仅能在大肠杆菌以包涵体形式表 达(Qian L et al,2012)。我们构建pET30a/Zbasic-ΔI-CM-hCXCL9质粒(该实 例中标签编码序列与内含肽编码序列之间使用了柔性肽链)并转化BL21(DE3) 宿主菌，挑取单克隆菌落接种于Kana+的LB液体培养中，37℃200rpm培 养12小时，作为种子菌。取种子菌按1:100体积比接种与无菌的Kana+LB培 养基中，37℃200rpm培养3小时后进行诱导，并于4小时后收集菌体，采 用高压均质仪破碎细胞。将裂解菌液4000g离心30分钟分离上清可溶性成 分和沉淀包涵体成分，制备SDS-PAGE样品，电泳如图8所示。图8中，37 ℃诱导Zbasic-ΔI-CM-hCXCL9，分离可溶性上清成分进行SP FF阳离子交换 纯化；A：层析图，收到两个峰Peak1和Peak2；B：电泳分析收集峰的成分， Peak 1中为杂蛋白，Peak 2中含有目的蛋白hCXCL9，其位置如图8所示。从 图8中可见，采用Zbasic-ΔI-CM-hCXCL9融合表达显著提高了hCXCL9蛋白 的表达可溶性。[0074]与mCXCL9的表达情况相同，表达过程中，融合表达表达后即发挥intein 的C端剪切功能，从而释放hCXCL9，使得hCXCL9以可溶形式存在于上清 中，能够采用SPFF从上清中纯化得到粗产品。与文献中包涵体表达方法相比， 本发明的方法显著提高了hCXCL9蛋白的表达可溶性。

[0075]以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并 没有详尽叙述所有的细节，也不该发明仅为所述的具体实施方式。显然， 根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这 些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领 域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范 围和等效物的。

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<110>上海交通大学

<120>一种表达纯化重组CXCL9蛋白的方法及其应用<130> DAG36781<160> 6<210> 1<211> 171<212> DNA<213> Artificial<220>

<223>Zbasic<400>1

gttgataacaaatttaacaaagaacgtcgccgtgctcgtcgtgaaatccgtcatctgccg 60aatctgaatcgtgaacagcgtcgtgcgtttattcgtagcctgcgcgatgacccgtcacaa 120agcgcaaacctgctggctgaagcgaaaaaactgaacgatgcccaaccgaa a 171<210> 2<211> 504<212> DNA<213> Artificial<220>

<223>Intein (ΔI-CM)<400>2

gccctcgcagagggcactcggatcttcgatccggtcaccggtacaacgcatcgcatcgag 60gatgttgtcggtgggcgcaagcctattcatgtcgtggctgctgccaaggacggaacgctg 120catgcgcggcccgtggtgtcctggttcgaccagggaacgcgggatgtgatcgggttgcgg 180atcgccggtggcgccatcctgtgggcgacacccgatcacaaggtgctgacagagtacggc 240tggcgtgccgccggggaactccgcaagggagacagggtggcgcaaccgcgacgcttcgat 300ggattcggtgacagtgcgccgattccggcgcgcgtgcaggcgctcgcggatgccctggat 360gacaaattcctgcacgacatgctggcggaagaactccgctattccgtgatccgagaagtg 420ctgccaacgcggcgggcacgaacgttcggcctcgaggtcgaggaactgcacaccctcgtc 480gccgaaggggttgtcgtgcacaac 504<210> 3<211> 315<212> DNA<213> Artificial<220>

<223>mCXCL9<400>3

Accctagtgataaggaatgcacgatgctcctgcatcagcaccagccgaggcacgatccac 60

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序　列　表

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Tacaaatccctcaaagacctcaaacagtttgccccaagccccaattgcaacaaaactgaa 120Atcattgctacactgaagaacggagatcaaacctgcctagatccggactcggcaaatgtg 180Aagaagctgatgaaagaatgggaaaagaagatcaaccaaaagaaaaagcaaaagaggggg 240Aaaaaacatcaaaagaacatgaaaaacagaaaacccaaaacaccccaaagtcgtcgtcgt 300Tcaaggaagactaca 315<210> 4<211> 309<212> DNA<213> Artificial<220>

<223>hCXCL9<400>4

accccagtagtgagaaagggtcgctgttcctgcatcagcaccaaccaagggactatccac 60ctacaatccttgaaagaccttaaacaatttgccccaagcccttcctgcgagaaaattgaa 120atcattgctacactgaagaatggagttcaaacatgtctaaacccagattcagcagatgtg 180aaggaactgattaaaaagtgggagaaacaggtcagccaaaagaaaaagcaaaagaatggg 240aaaaaacatcaaaaaaagaaagttctgaaagttcgaaaatctcaacgttctcgtcaaaag 300aagactacataa 309<210> 5<211> 291<212> DNA<213> Artificial<220>

<223>FATT标签<400>5

Gctgaagaaagtgacaatgtggattctgctgatgcggaggaggatgactcggatgtctgg 60Tggggcggagcagacacagactatgcagatgggagtgaagacaaagtagtagaagtagca 120Gaggaggaagaagtggctgaggtggaagaagaagaagccgatgatgacgaggacgatgag 180Gatggtgatgaggtagaggaagaggctgaggaaccctacgaagaagccacagagagaacc 240Accagcattgccaccaccaccaccaccaccacagagtctgtggaagaggtg 291<210> 6<211> 228<212> DNA<213> Artificial<220>

<223>Fh8标签<400>6

Aatcacaaagtgccgtctgttcaagaggttgaaaaactgctgcatgttctggatcgcaac 60Ggtgacggtaaggtttctgccgaggagctgaaagccttcgctgatgattctaaatgtccg 120

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Ctggactccaacaagatcaaggctttcattaaggaacacgataaaaacaaggatggcaag 180Ctggatctgaaagaactggtttctattctgtcttctggtggttctggt 228

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图5

图6

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图7

图8

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