无血清全悬浮MDCK细胞株及其在生产流感病毒中的应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107460156 A(43)申请公布日 2017.12.12

(21)申请号 2016103624.6(22)申请日 2016.06.03

(83)生物保藏信息

CGMCC No.12256 2016.03.28

(71)申请人 北京大北农科技集团股份有限公司

动物医学研究中心

地址 100098 北京市海淀区杏石口路西杉

创意园四区（益园文创基地C区）8号楼申请人 北京大北农科技集团股份有限公司　

福州大北农生物技术有限公司　北京科牧丰生物制药有限公司(72)发明人 孔文刚　王贵华　赵亚荣　闫林　

刘飞　郎洪彬　刘天伦　冯鹏　(51)Int.Cl.

C12N 5/071(2010.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图2页

C12N 5/02(2006.01)C12N 7/00(2006.01)C12N 7/02(2006.01)C12R 1/91(2006.01)

()发明名称

无血清全悬浮MDCK细胞株及其在生产流感病毒中的应用(57)摘要

本发明公开了一株通过一步适应法驯化的无血清全悬浮培养的MDCK细胞株及其在制备流感病毒疫苗中的应用，属于兽医生物学技术领域。本发明通过一步法适应法在两个月内将贴壁型细胞驯化为单个分散的全悬浮MDCK细胞系，命

CGMCC No.12256。名为MDCK-S，其菌种保藏号为：

本发明还提供了利用所述细胞系培养流感病毒的方法。本发明提供的MDCK细胞悬浮培养生产H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的方法，可以替代传统鸡胚生产，显著降低生产成本，提高下游纯化效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模。CN 107460156 ACN 107460156 A

权　利　要　求　书

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1.一株通过一步适应驯化法得到的无血清全悬浮MDCK细胞株，其保藏号为：CGMCC No.12256。

其包括如下步骤：2.一种一步适应法驯化无血清全悬浮MDCK细胞系的方法，

1)贴壁MDCK细胞的传代与培养；

2)利用无血清培养基将贴壁细胞一步适应法驯化为全悬浮细胞，具体为：将步骤1)扩大培养的MDCK细胞经0.25％胰酶消化后接种到无血清培养基，置于摇床上进行震荡培养，初始接种密度为0.5×106-2.0×106个/ml，每48-72h取样计数，将细胞密度调节为初始接种密度进行适应性传代培养，直至细胞生长稳定，细胞呈单个分散状，细胞饱满，边缘光亮，呈悬浮状态。

3.权利要求1所述的MDCK细胞株在生产流感病毒中的应用。4.一种生产流感病毒的方法，其包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的MDCK细胞株按照0.3×106-1×106个/ml接种于无血清培养基，得

置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养；到MDCK细胞悬液，

2)当细胞悬液的细胞密度达到2×106-10×106个/ml时，按照MOI为1-5％(v/v)的比例接种流感病毒；

3)病毒液在32-35℃培养3-4天收获病毒上清液，即得流感病毒液。5.如权利要求4所述的生产流感病毒的方法，其特征在于，所述的流感病毒为人流感病毒、禽流感病毒、马流感病毒或猪流感病毒。

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说　明　书

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无血清全悬浮MDCK细胞株及其在生产流感病毒中的应用

技术领域

[0001]本发明涉及一株通过一步适应法驯化的悬浮MDCK细胞株及其在培养、生产猪流感病毒疫苗中的应用。本发明属于兽医生物学技术领域。背景技术

[0002]猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种急性、传染性的呼吸道疾病。猪流感单独感染猪群的病死率较低，但经常会导致猪群并发或激发其他病毒或细菌的感染，增加猪的死亡率。同时，猪是人流感和禽流感的混合器，存在感染人的风险，因此具有重要的公共卫生意义。到目前为止，疫苗接种是预防猪流感的最好方法。[0003]采用鸡胚培养流感病毒是目前人和禽流感灭活疫苗的经典方法。目前，国内上市的猪流感疫苗只有武汉科前的猪流感H1N1亚型灭活疫苗，该疫苗仍采用鸡胚生产工艺。鸡胚生产存在一些不足：其一，需要大量劳动力，占地面积大；其二，病毒质量受鸡胚质量和批次的影响较大；其三，SPF鸡胚的供应；其四，鸡胚中存在较多杂蛋白，降低了疫苗的免疫效果，增加了后期纯化的压力。[0004]犬肾上皮细胞(MDCK，通用性强；Madin-Darby canine kidney)由于其背景明确，细胞生产的流感疫苗免疫效果优于鸡胚；对多种流感病毒敏感，比如人流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒等，现被广泛用于流感病毒疫苗的生产以替代鸡胚培养。动物细胞培养过程具有生产成本低，自动化程度高，易于纯化和快速规模化生产等特点。[0005]通常，细胞的驯化方法主要有两种：逐步降低血清适应法和一 步适应驯化法。前者通过逐渐降低血清的方法使贴壁型细胞逐步驯化为悬浮细胞，其驯化周期相对较长，而对于一步适应法驯化，其驯化周期较短。虽然ZL201210224401.6，ZL2015102010.3报道了悬浮细胞的驯化过程，但两者均为贴壁细胞在贴壁环境下用无血清培养基适应数代，胰酶消化后进行适应性传代培养，从而获得无血清全悬浮细胞。然而，不经过贴壁环境下的数代适应，将细胞消化后直接用无血清培养基进行适应性传代的驯化方式尚未见报道。[0006]目前，利用MDCK细胞微载体悬浮或全悬浮培养生产禽流感、人流感的相关报道较多，但尚未见利用无血清全悬浮培养MDCK细胞技术生产猪流感病毒的报道，并且市场上仍未有全悬浮培养MDCK细胞制备的猪流感疫苗。

发明内容

[0007]为了解决上述问题，本发明提供一种一步适应法驯化的无血清全悬浮MDCK细胞株及其应用。

[0008]首先，本发明提供一株通过一步适应驯化法得到的无血清全悬浮MDCK细胞株，其保藏号为：CGMCC No.12256。

[0009]本发明还提供一步适应法驯化的无血清全悬浮MDCK细胞系的方法，其包括如下步骤：

[0010]1)贴壁MDCK细胞的传代与培养；

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2)利用无血清培养基将贴壁细胞一步适应法驯化为全悬浮细胞，具体为：将步骤

1)扩大培养的MDCK细胞经0.25％胰酶消化后接种到无血清培养基，置于摇床上进行震荡培养，初始接种密度为0.5×106-2.0×106个/ml，每48-72h取样计数，将细胞密度调节为初始接种密度进行适应性传代培养，直至细胞生长稳定，细胞呈单个分散状，细胞饱满，边缘光亮，呈悬浮状态。

[0012]本发明还提供所述的MDCK细胞株在生产流感病毒中的应用。[0013]本发明还提供一种生产流感病毒的方法，其包括以下步骤：

[0014]1)将所述的MDCK细胞株按照0.3×106-1×106个/ml接种于无血清培养基，得到MDCK细胞悬液，置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养；

[0015]2)当细胞悬液的细胞密度达到2×106-10×106个/ml时，按照MOI为1-5％(v/v)的比例接种流感病毒；

[0016]3)病毒液在32-35℃培养3-4天收获病毒上清液，即得流感病毒液。[0017]其中，所述的流感病毒为人流感病毒、禽流感病毒、马流感病毒或猪流感病毒。[0018]本发明实现了MDCK细胞的无血清培养，同时以最快的速度克服了细胞由贴壁培养转向悬浮培养所引起的失巢凋亡，具有时间和技术的优势。[0019]与现有技术相比，本发明的有益之处在于：[0020]1.本发明的一步适应法的驯化方法操作简单，驯化时间较短，能够快速有效的得到悬浮细胞。其驯化的悬浮MDCK细胞系能够在无载体的情况下实现细胞的悬浮培养，实现

使得病毒含量等同或高出一般的贴壁培养。了细胞密度的最大化，减少了培养体积，

[0021]2.本发明的悬浮MDCK细胞系能够高效扩增不同亚型的猪流感病毒，血凝效价高于传统的鸡胚生产，对替代鸡胚生产制备猪流感病毒疫苗具有重大意义。附图说明

[0022]图1为MDCK细胞驯化前期、驯化后期的细胞形态图。[0023]图2为MDCK细胞驯化过程中的比生长速率的变化图。[0024]图3为MDCK-S细胞的生长曲线图。

具体实施方式

[0025]以下实施例用于说明本发明，但不用来本发明的范围。[0026]本实施例涉及的材料来源：[0027]细胞：贴壁型MDCK细胞购自于ATCC；[0028]病毒：猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)株、A/Swine/Guangdong/01/2005(H3N2)株。

[0029]DMEM/F12购自于Gibco；

[0030]金源康胎牛血清购自于内蒙古金源康生物工程有限公司；[0031]9-11日龄SPF蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。[0032]仪器设备：

[0033]Corning 125ml摇瓶；奥盛OS-200摇床；Thermo二氧化碳培养箱；[0034]FT-QCFC3整批孵化出雏机，Thermo二级生物安全柜。

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实施例1无血清全悬浮MDCK细胞系的制备

[0036]S1.贴壁MDCK细胞的传代：

[0037]取T75方瓶培养铺满单层的MDCK细胞，经0.25％的胰酶消化细胞，用DMEM/F12(10％FBS)的细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将MDCK细胞置于37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养48-72h，待形成细胞单层时进行放大培养。上述细胞生长液为10％金源康胎牛血清的DMEM/F12培养液。

[0038]S2.一步适应法将贴壁细胞驯化为无血清培养的全悬浮细胞：[0039]S21.细胞驯化过程：

[0040]将步骤S1扩大培养的MDCK细胞经0.25％胰酶消化后接种到无血清培养基，置于摇床上进行震荡培养，初始接种密度为0.5×106-2.0×106个/ml，每48-72h通过离心换液、稀释等方法进行适应性传代，驯化20-30代，细胞生长趋于稳定，细胞的比生长速率在0.4day-1左右。细胞呈单个分散状，细胞饱满，边缘光亮，呈悬浮状态。细胞驯化过程中细胞形态如附图1，比生长速率如附图2所示。

[0041]S22.细胞生长曲线的测定：

[0042]以0.5×106个/ml的细胞密度接种于125ml的摇瓶中，培养体积 为30ml，置于37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养。细胞前120h持续生长，120h时活细胞密度达到最高，

之后细胞密度降低，结果见附图3。为3.3×106个/ml，

[0043]S23.外源病毒检测：

[0044]提取病毒的RNA和基因组DNA，RNA应用随机引物反转录成cDNA，以cDNA和基因组DNA为模板，通过PCR或RT-PCR方法进行外源病毒的检测。所检的病毒包括支原体(MH)、犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒(PCV2)。检测所用引物均参考相关文献合成。结果表明细胞无外源病毒污染。

[0045]S24.细胞的传代稳定性：

[0046]从液氮罐中取出冻存的MDCK细胞，迅速置于37℃水浴锅中快速融化，将融化的细胞加入适量培养基离心以去除二甲基亚砜，然后用新鲜培养基重悬细胞并放置于摇瓶中培养。复苏的细胞经过2-3代的适应期，细胞的生长状态逐渐恢复，细胞饱满，边缘清晰。此时将细胞以0.5×106-0.6×106个/ml接种125ml摇瓶中，培养体积为30ml，每48h取样计数并进行传代。经过50次的传代，细胞生长平稳，每48h细胞密度为1.5×106-1.8×106个/ml，约为初始密度的3倍。

[0047]通过一步适应法驯化，得到一株适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系。[0048]实施例2MDCK-S细胞系的克隆筛选

[0049]利用有限稀释法对实施例1中的MDCK-S细胞系进行3轮克隆筛选，得到3株形态饱满，边缘光亮、生长速度较快、细胞活率较高的细胞株。为了考察这3个克隆细胞株的差异，将这3株细胞分别以0.5×106个/ml的细胞密度接种于125ml的摇瓶中，培养体积为30 ml，置于37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养，48h时取出1ml细胞液，台盼蓝染色后进行细胞计数并计算细胞活率。三株细胞的细胞密度及活率见表1。[0050]表1 三株MDCK-S细胞的生长情况

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将生长速度最快，活性最高的MDCK-S3细胞保藏于2016年3月28日保藏于中国微生

物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，中国普通微生物菌种保藏管理中心，命名为悬浮型犬肾细胞MDCK-S，其保藏号为：CGMCC No.12256。

[0053]实施例3悬浮培养MDCK-S细胞生产H1N1亚型猪流感病毒[00]S1.细胞复苏

[0055]从液氮罐中取出冻存的MDCK-S细胞，迅速置于37℃水浴锅中快速融化，将融化的细胞加入适量培养基离心以去除二甲基亚砜，然后用新鲜培养基重悬细胞并放置于摇瓶中培养。复苏的细胞经过2-3代的适应期，待细胞生长状态稳定时进行实验。[0056]S2.H1N1亚型猪流感病毒细胞毒种的繁殖：

[0057]将MDCK-S细胞按照0.3×106-1×106个/ml的细胞密度接种于无血清培养基进行悬浮培养，当细胞密度达到2×106-3×106个/ml，按0.1-0.01％(v/v)的比例接种鸡胚生产的H1N1亚型猪流感病毒，培养48-72h收获毒液；将此毒液作为种毒，在MDCK-S细胞上进行细胞适应性连续传代，直至TCID50稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒。[0058]S3.H1N1亚型猪流感病毒液的制备：

[0059]S31.将MDCK-S细胞按照0.6×106个/ml接种于无血清培养基，得到MDCK细胞悬液，置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养；

[0060]S32.当细胞悬液的细胞密度达到2×106个/ml时，按照2％(v/v)的比例接入H1N1亚型猪流感病毒；

[0061]S33.病毒液在35℃培养3-4天收获病毒上清液，即得H1N1亚型猪流感病毒液。[0062]S34.收获的病毒液离心除去细胞碎片后置于-70℃保存备用。[0063]S35.流感病毒血凝效价的测定[00]冻融收获的病毒液，按照常规方法对其进行血凝活性检测，取96孔血凝板，第一排加入待检测病毒原液100μl，后面每孔加入50μl 1×PBS，吸取50μl病毒原液2倍倍比稀释至11孔，最后一孔留作对照，加入1％鸡红细胞悬液，混匀后置室温30min，观察结果。三批H1N1亚型猪流感病毒的血凝效价见表2。

[0065]表2 三批H1N1亚型猪流感病毒的血凝效价

[0052]

[0066]

[0067]

实施例4悬浮培养MDCK-S细胞生产H3N2亚型猪流感病毒

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S1.细胞复苏

[0069]从液氮罐中取出冻存的MDCK-S细胞，迅速置于37℃水浴锅中快速融化，将融化的细胞加入适量培养基离心以去除二甲基亚砜，然后用新鲜培养基重悬细胞并放置于摇瓶中培养。复苏的细胞经过2-3代的适应期，待细胞生长状态稳定时进行实验。[0070]S2.H3N2亚型猪流感病毒细胞毒种的繁殖：

[0071]将MDCK-S细胞按照0.3×106-1×106个/ml的细胞密度接种于无血清培养基进行悬浮培养，当细胞密度达到2×106-3×106个/ml，按0.1-0.01％(v/v)的比例接种鸡胚生产的H3N2亚型猪流感病毒，培 养48-72h收获毒液；将此毒液作为种毒，在MDCK-S细胞上进行细胞适应性连续传代，直至TCID50稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒。[0072]S3.H3N2亚型猪流感病毒液的制备：

[0073]S31.将MDCK-S细胞按照0.6×106个/ml接种于无血清培养基，得到MDCK细胞悬液，置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养；

[0074]S32.当细胞悬液的细胞密度达到2×106个/ml时，按照2％(v/v)的比例接入H3N2亚型猪流感病毒；

[0075]S33.病毒液在35℃培养3-4天收获病毒上清液，即得H3N2亚型猪流感病毒液。[0076]S34.收获的病毒液离心除去细胞碎片后置于-70℃保存备用。[0077]S35.流感病毒血凝效价的测定[0078]冻融收获的病毒液，对病毒液血凝效价进行测定，三批H3N2亚型猪流感病毒的血凝效价见表3。

[0079]表3 三批H3N2亚型猪流感病毒的血凝效价

[0080]

实施例5细胞培养或鸡胚培养的猪流感病毒血凝效价比较

[0082]4.1.MDCK-S细胞培养生产猪流感病毒[0083]S1.从液氮罐中取出冻存的MDCK-S细胞，迅速置于37℃水浴锅中快速融化，将融化的细胞加入适量培养基离心以去除二甲基亚砜，然后用新鲜培养基重悬细胞并放置于摇瓶中培养。复苏的细胞经过2-3代的适应期，待细胞生长状态稳定时进行实验。[0084]S2.将MDCK-S细胞按照0.6×106个/ml接种于无血清培养基，得到MDCK细胞悬液，

5％CO2的二氧化碳培养箱中培养；置于37℃、

[0085]S3.当细胞悬液的细胞密度达到2×106个/ml，按照MOI为2％ (v/v)的比例分别接入H1N1，H3N2亚型猪流感病毒；

[0086]S4.病毒液在35℃培养3-4天收获病毒上清液，即得H1N1、H3N2亚型的猪流感病毒液。

[0087]4.2.鸡胚培养生产猪流感病毒[0088]S1.暗室中照胚，避开鸡胚及主动脉，寻找两血管间空隙并划线；[00]S2.在生物安全柜中用碘酒对鸡胚划线处进行消毒，消毒后打孔；[0090]S3.一次性注射器吸取0.2ml的H1N1，H3N2猪流感病毒，针头从开孔处插入鸡胚尿

[0081]

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囊腔进行接毒，平行做5枚胚；

[0091]S4.接毒完成后对开孔进行封蜡处理，置于35℃，50％空气饱和度的整批孵化出雏机中培养。

[0092]S5.接毒24h检查鸡胚，弃去死胚，其余的鸡胚培养至72h收获尿囊液，即得猪流感病毒液。

[0093]4.3对细胞培养和鸡胚培养的猪流感病毒血凝效价的进行测定，结果见表4。[0094]表4细胞培养或鸡胚培养的猪流感病毒血凝效价比较

[0095]

实施例6鸡胚培养和全悬浮细胞培养的经济效益对比

[0097]鸡胚及全悬浮细胞培养生产1000L单价毒液的经济效益如表5所示。其中SPF鸡胚以12元/枚计算，收获体积为10ml，无血清培养基400元/升。细胞培养方式下的原料成本、血凝价、产品纯化、生产周期较鸡胚生产均有较大的优势。同时，近年来动物细胞大规模反应器培养技术、病毒分离纯化技术的快速发展为工业化生产不同亚型流感病毒疫苗提供了技术支持和保障。

[0098]表5鸡胚及全悬浮细胞培养生产1000L单价毒液的经济效益对比

[0096]

[0099]

[0100]

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人

员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

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