维普资讯 http://www.cqvip.com 刘海英等原发性胆汁性肝硬化ＨＬＡ．Ａ｝０２０１限制性ＰＤＣ．Ｅ２特异性ＣＴＬ功能 笠 ・５５５・ ・临床免疫学・ 原发性胆汁性肝硬化Ｉ－ＩＬＡ．Ａ米０２０１限制性ＰＤＣ．Ｅ２特异性ＣＴＬ功能分析① 刘海英张建②邓安梅②石玉玲徐德兴仲人前②（广州军区广州总医院检验科，广州５１００１０） 中国图书分类号Ｉ ７５．２２ 文献标识码Ａ 文章编号ｌＯＯＯ．４８４ｘ（２００７）０６－０５５５ Ｄ４ 【摘要］ 目的：探讨原发性胆汁性肝硬化（ＰＢＣ）中ＨＬＡ．Ａ ０２０１限制的ＰＤＣ—Ｅ２ 特异性ＣＴＬ与ＰＤＣ—Ｅ２ 特异 性ＣＴＬ功能。方法：分析１５例ＨＬＡ—Ａ ０２０１阳性（Ａ２ ）ＰＢＣ患者抗原肽ＰＤＣ．Ｅ２ｌ５９ ７、ＰＤＣ—Ｅ２ １７４诱导的ＣＴＬ对以表达 ＨＬＡ－Ａ ０２０１分子的 细胞作为靶细胞的细胞毒性作用，并利用四聚体技术结合细胞内因子染色研究ＰＤＣ．Ｅ２ 特异性 ＣＴＬ与ＰＤＣ－Ｅ２ １７４特异性ＣＴＬ分泌细胞因子（ＩＦＮ一－ｙ、ＩＬ４和ＴＮＦ—ｏｔ）情况。结果：１５例Ａ２ ＰＢＣ患者中，１２例ＰＤＣ．Ｅ２ｌ５９－ｌ６７ 诱导的ＣＴＬ和１０例ＰＤＣ－Ｅ２ 诱导的ＣＴＬ对负载相应抗原肽的靶细胞特异杀伤活性大于１０％（Ｅ：Ｔ＝４０：１），而对照组则 均小于１０％；１５例Ａ２ ＰＢＣ患者从ＰＢＭＣ诱导的ＰＤＣ—Ｅ２ｌ５９＿１６７特异性ＣＴＬ和ＰＤＣ．Ｅ２ １７４特异性ＣＴＬ中分泌ＩＦＮ．－ｙ细胞比值 分别为０．３３％±０．２４％（０％一ｏ．８６％）、０．２７％±０．２４％（０％一ｏ．７５％），未检测到分泌ＴＮＦ—ｄ或ＩＬ－４的ＰＤＣ—Ｅ２ｍｌ６７或ＰＤＣ． Ｅ２ｌ刚７４特异性ＣＴＬ。结论：结果表明，大部分ＰＢＣ患者中ＨＬＡ・Ａ ０２０１限制性ＰＤＣ—Ｅ２ｌ５９ ７特异性ＣＴＬ和ＰＤＣ－Ｅ２ １７４特异性 ＣＴＬ具有特异杀伤活性，ＨＬＡ—Ａ ０２０１限制性ＰＤＣ．Ｅ２特异性ＣＴＬ主要分泌ＩＦＮ．－ｙ并非ＩＬ－４、ＴＮＦ．ｄ。 【关键词］原发性胆汁性肝硬化；ＰＤＣ．Ｅ２特异性ＣＴＬ；四聚体；细胞因子 Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＬＡ—Ａ米０２０１一ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＰＤＣ—Ｅ２ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＣＴＬｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｂ＇ｄｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ＬＩＵ Ｈａｉ－Ｙｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎ，ＤＥＮＧ Ａｎ－Ｍｅｉ，ＳＨＩ Ｙｕ－Ｌｉｎｇ，ＸＵ Ｄｅ．Ｘｉｎｇ，ＺＨＯＮＧ Ｒｅｎ．Ｑｉａｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｃｏｍｍａｎｄ ｆｏＰ ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００１０。Ｃｈｉｎａ ［Ａｔｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｉｔｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｅｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｉｈｔｅｒ ＨＬＡ—Ａ ０２０１一ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＰＤＣ．Ｅ２ｌ５９－ｌ６７ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＣＴＬｓ ｏｒ ＰＤＣ－Ｅ２ｌ６５．１７４ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＣＴＬ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＤＣ—Ｅ２１５９．１６７ ｏｒ ＰＤＣ．Ｅ２１６５．１７４一ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＴＬ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ １５ ｃａ８ｅｓ ｏｆ ＨＩ￣－Ａ ０２０１ ｐｏｓｉｉｔｖｅ（Ａ２ ）ＰＢＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｔ２ ｃｅｌｌｓ ｓａ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ３ Ａ２ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ３ Ａ２ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｈｎｔｅｅｒｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＩＦＮ． ，ＩＬ４ ａｎｄ ＴＮＦ．ｄ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＰＤＣ．Ｅ２ ｓｐｅｃ近ｃ ＣＴＬｓ ｗｅｌ，￣ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｈｔ ｔｅｔｒａｍｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｌｕａｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｏｆ ｔｈｅ １５ Ａ２ ＰＢＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ，ＰＤＣ—Ｅ２ｌ５９＿１６７ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃ Ｉ ｆｒｏｍ １２ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ＰＤＣ—Ｅ２１６５．１７４ ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＴＬｓ ｆｒｏｍ １０ ｐａｔｉｅｎｔｓ，ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １０％。ｂｕｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｗｅｌｔ￣ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １０％．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ＩＦＮ一 ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＰＤＣ—Ｅ２１５９．１６７ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＣＴＬｓ ａｎｄ ＰＤＣ—Ｅ２１６５．１７４ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬｓ ｉｎ Ａ２ ＰＢＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ０．３３％±０．２４％（ｏ－ｏ．８６％）ａｎｄ ０．２７％±０．２４％（０－０．７５％），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｅｒｅａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ４ ｏｒ ＴＮＦ．ｄ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ｄｅ． ｔｅｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＤＣ－Ｅ２ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｏｕｒ ｄａｔａ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ＨＩＡ—Ａ ０２０１ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＰＤＣ—Ｅ２１５９．１６７ ｏｒ ＰＤＣ—Ｅ２１６５．１７４ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃ ｉｎ ｍｏｓｔ ｏｆ Ａ２ ＰＢＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｈｏｗ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｃｙ【０ｔ０）【ｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＩＦＮ一一ｙ，ｂｕｔ ｎｏｔ ＩＬ－４ ａｎｄ ＴＮＦ．ｄ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｈｏｓｉｓ；ＰＤＣ—Ｅ２ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ＣＴＬ；Ｔｅｔｒａｍｅｒ；Ｃｙｔｏｋｉｎｅ 原发性胆汁性肝硬化（ＰＢＣ）是一种典型的器官 别的主要自身抗原。ＰＤＣ．Ｅ２ １５９～１６７ ａａ（ＫＬＳＥＧ－ 特异性自身免疫性疾病，其组织学特征是胆管破坏 ＤＬＬＡ）和１６５～１７４ ａａ（ＬＬＡＥＩＥＴＤＫＡ）为ＰＢＣ人群 伴随着门脉淋巴细胞浸润，ＰＢＣ胆小管结构的破坏 中ＨＬＡ－Ａ ０２０１限制性的ＣＤ８ ＣＴＬ的免疫优势 与抗原特异性Ｔ细胞密切相关 。丙酮酸脱氢酶 表位。在前部分研究中，我们通过四聚体技术证实 复合体（ＰＤＣ）Ｅ２亚基是ＰＢＣ中自身免疫反应中识 这两种抗原特异性Ｔ细胞在患者外周血含量相 当 。本文拟通过对其细胞毒性分析以及分泌细 ①本文受国家自然科学基金（３０３００１５７）、上海市卫生系统“百人计 胞因子隋况，进一步研究ＰＤＣ．Ｅ２抗原特异性ＣＴＬ的 划”项目资助 功能，以期深入阐明其在ＰＢＣ发病中的作用机制。 ②第二军医大学附属长征医院实验诊断科暨全军ｌＩ缶床免疫中心，上 海２００００３ １材料与方法 作者简介：刘海英（１９７０年一），女，博士，主管技师，主要从事自身免 疫性疾病研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉａｎｇｌｉｕｈａｉｙｉｎｇ＠２１ｃｎ．ｃｏｒｎ； １．１ 研究对象患者均先经ＨＬＡ分型，即以ＨＬＡ． 指导教师：仲人前（１９６２年一），男，教授，博士生导师，主要从事自身 Ａ２ ｍＡｂ（Ｓｅｒｏｔｅｃ，英国）对患者抗凝全血进行流式初 免疫性疾病、肿瘤的实验室诊断与发病机制研究。 步筛选，然后再以ＨＬＡ．Ａ２ ＳＳＰ．ＰＣＲ试剂盒（Ｏｎｅ 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国免疫学杂志２００７年第２３卷 Ｌａｎｌｂｄａ，美国）进一步确认其Ａ￥０２０１亚型。ＨＬＡ－ Ａ ０２０１阳性（－Ａ２ ）ＰＢＣ患者１５例，均符合美国肝 ５００ ｇ离心５分钟，吸去上清。加１００ ｌ穿膜剂和 １０ ｌ ＦＩＴＣ标记的细胞内因子抗体（ＩＦＮ一 ＩＬ－４或 ｒＩ’ＮＦ．仅，均购自美国Ｃａｌｔａｇ公司），混匀１～２秒，孵 育２０分钟。用３ ｒＩｌｌ洗液洗１遍。３００～５００ ｇ离心 病学会２０００年推荐的ＰＢＣ诊断指南 ，其中男１ 例，女１４例，平均年龄５２岁。３例Ａ２ 阳性的其他 慢性肝病患者与３例Ａ２ 健康志愿者设为对照组。 １．２ 多肽与四聚体合成 Ｆｌｕ ＭＰ ５８—６６ ａａ和 ＰＤＣ．Ｅ２ １５９—１６７ ａａ、１６５～１７４ ａａ多肽及其相应 ＨＬＡ．Ａ ０２０１／肽四聚体均委托英国ＰｒｏＩｍｍｕｎ公司 合成。多肽采用Ｆ—ｍｏｃ化学法合成，纯度经ＨＰＬＣ 鉴定，均大于９５％，冻干粉保存在４￣Ｃ待用，用前以 二甲亚砜（ＤＭＳＯ）复苏多肽（１０ ｇ／ ）。ＨＬＡ—Ａ￥ ０２０１／肽四聚体以ＰＥ标记，４℃保存备用。ＨＢｃ １８～２８ ａ４ｑ：ｔ多肽购自上海生工，纯度大于９５％。 １．３抗原特异性ＣＴＬ制备外周血单个核细胞分 离、抗原提呈细胞及培养参考文献［５］。即将经照 射过的抗原提呈细胞与抗原肽（１０ Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ）在培养 基中３７℃、５％ＣＯ 条件下共孵过夜。再将１×１０ 个负载有抗原肽的抗原提呈细胞与１×１０ 个自体 外周血单个核细胞（ＰＢＩ￣ＩＣ）种植于含１０％胎牛血清 （ＦＣＳ）的ＲＰＭＩ１６４０完全培养基的２４孔细胞培养板 中，３７℃、５％ＣＯ 条件下，混合培养３天后加入ｒＩＬ． ２（终浓度为２０ Ｕ／ｍ１），继续培养１０天，然后进行四 聚体染色检测。 １．４阳性对照９５％以上的人体血循环中均存在 着流感病毒ｎｕ ＭＰ５。＿６６特异性ＣＤ８ Ｔ淋巴细胞ｌ６］。 因此，以相同方法制备的Ｆｌｕ ＭＰ 。舶特异性ＣＴＬ，然 后用ＨＬＡ－Ａ ０２０１／Ｆｌｕ ＭＰ 。＿６６四聚体检测，作为阳 性质控来检验制备抗原特异性ＣＴＬ的过程。 １．５细胞毒性分析 以抗原肽诱导的ＣＴＬ为效应 细胞（Ｅ），负载抗原肽的 细胞作为靶细胞（Ｔ）， 采用时间分辨荧光ＤＥＬＦＩＡ细胞毒性试验测其杀伤 活性 Ｊ。参照试剂盒（ＡＤＯ１１６）说明书进行操作， 效应细胞与靶细胞的系列比例为５：１、１０：１、２０：１、 ４０：１和８０：１，共培养４小时。最后通过时间分辨荧 光检测仪（ＤＥＬＦＩＡ １２３５）检测样本荧光值。每个样 本设立３个复孔，取其平均值为检测结果。细胞杀伤 活性ｃ％ ＝ 毅耧箍 ｘ １００。 １．６细胞内因子检测 １ Ｘ １０ 个ＣＴＬ，在抗原肽 （１０ ｔ￣ｏｌ／Ｌ）刺激下，ＢＦＡ为１０ ｍｌ条件下，于 １．５ ｍｌ １０％ＦＣＳ的ＲＰＭＩ１６４０培养基中，２４孔培养 板，３７￣Ｃ、５％ＣＯ 下培养４小时。１ Ｘ １０ 个细胞，加 ２ ＰＥ标记的四聚体，混匀，室温暗处孵育ｌ５分 钟。加１００ 固定剂，室温暗处孵育１５分钟。用 ３ ｍｌ含０．１％ＮａＮ３、５％ＦＣＳ的ＰＢＳ洗１遍。３００～ ５分钟，吸去上清。用鞘液悬浮，上机检测。 １．７统计分析组间均数比较视情况采用ｔ检验、 方差分析或非参数检验，皆以ＳＳＰＳ １０．０软件系统 处理。 ２ 结果 ２．１细胞毒性分析结果 以负载相应抗原肽的 细胞作为靶细胞，ＰＤＣ．Ｅ２抗原肽诱导的ＣＴＬ作为 效应细胞，效靶比分别为５：１、１０：１、２０：１、４０：１和 ８０：１抗原肽诱导ＣＴＬ的特异性杀伤活性，以无关肽 ＨＢｃ。。 为对照，见图１。从图１可见，抗原肽ＰＤＣ－ Ｅ２。５９＿。 或ＰＤＣ－Ｅ２。刚 诱导的ＣＴＬ只对负载相应抗 原肽的 细胞产生杀伤效应，效靶比为８０：１的细 胞特异性杀伤活性与４０：１无显著差异。１５例Ａ２ ＰＢＣ患者中ＰＤＣ－Ｅ２。 。 诱导的ＣＴＬ杀伤活性大于 １０％的有１２例（Ｅ：Ｔ＝４０：１），ＰＤＣ—Ｅ２ ＿ｌ７４诱导的 ＣＴＬ则有１０例。３例Ａ２ 阳性的其他慢性肝病患 者和３例Ａ２ 健康志愿者的ＣＴＬ对负载ＰＤＣ．Ｅ２抗 原肽的靶细胞的细胞毒性均小于１０％，见图２。 ２．２抗原特异性ＣＴＬ细胞内因子检测结果 为了 进一步研究ＰＤＣ－Ｅ２特异性ＣＴＬ分泌细胞因子的功 能，分别检测了ＰＤＣ－Ｅ２。５９＿。 与ＰＤＣ—Ｅ２。 ７４特异性 ＣＴＬ在其相应抗原肽刺激下分泌细胞因子ＩＦＮ．＾ｙ、 ｒＩ’ＮＦ－仅和ＩＬ一４的情况，以ＨＢｃ 。 为对照。我们发 现，从Ａ２ ＰＢＣ患者ＰＢｔＣＩＣ中制备的ｎｕ ＭＰ ８＿６６特 异性ＣＴＬ，在经抗原肽ｎｕ ＭＰ５。舶刺激后，流式细胞 检仪可检测到一群ＩＦＮ．＾ｙ ／ｎｕ ＭＰ ８＿６６四聚体阳性 细胞（图３Ｂ），该结果说明本实验抗原特异性ＣＴＬ 制备与细胞内因子检测具有可行性。在Ａ２ ＰＢＣ 患者经相应抗原肽刺激后ＰＤＣ．Ｅ２ 与ＰＤＣ． Ｅ２ｌ ５＿ ｌ特异性ＣＴＬ中也同样出现四聚体与ＩＦＮ．＾ｙ 双阳性的细胞群（图３Ｄ、Ｆ）；１５例Ａ２ ＰＢＣ患者从 ＰＢＩ￣ＩＣ诱导的ＰＤＣ－Ｅ２ ＿ｌ６７特异性ＣＴＬ和ＰＤＣ． Ｅ２。刚 特异性ＣＴＬ中分泌ＩＦＮ１情况见图４，比值 分另Ｕ为０．３３％±０．２４％（０％一０．８６％）、０．２７％± ０．２４％（０％～０．７５％）。但上述三类抗原特异性 ＣＴＬ在对照抗原肽ＨＢｃ。蚴刺激下却未发现有可分 泌ＩＦＮ－＾ｙ的抗原特异性ＣＴＬ（图３Ａ、Ｃ、Ｅ）。以相同 方法在Ａ２ ＰＢＣ患者的ＰＤＣ－Ｅ２抗原肽诱导的ＣＴＬ 中未检测到分泌ｒＩ’ＮＦ－仅或ＩＬ－４的ＰＤＣ．Ｅ２ ＿ｌ６７或 ＰＤＣ－Ｅ２ 。 特异性Ｔ细胞。 维普资讯 http://www.cqvip.com 刘海英等原发性胆汁性肝硬化ＨＬＡ．Ａ｝０２０１限制性ＰＤＣ．Ｅ２特异性ＣＴＬ功能分析—ｏ／ｄ一扫一３１—３ 曙１３０盘∞ 第６期 ・５５７・ 加 ∞ 加 ｍ ｌ０ ０ ０ Ｅ：Ｔ（ｐａｔｉｅｎｔ１） Ｅ：Ｔ（ｐａｔｉｅｎｔ２） 圈１ Ａ２’ＰＢＣ患者ＰＤＣ・Ｅ２抗原肽诱导的ＣＴＬ在不同效靶比时的特异杀伤活性 №１ Ｓｐｅｃｍｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＴＬ ｆｒｏｍ Ａ２’ＰＢＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ Ｎｏｔｅ：ｌ・ＰＤＣ＿Ｅ２ｌ５９１６７ ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＴＬ＋Ｔ２ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ＰＤＣ—Ｅ２１５９１ ；２．ＰＤＣ—Ｅ２１６５ｌ７４ ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＴＬ＋Ｔ２ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ＰＤＣ—Ｅ２１６５１７４；３．ＰＤＣ． ．．Ｉ ｌ，９１６７ ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＴＬ＋Ｔ２ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ＨＢｃ１８２７；４．ＰＤＣ—Ｅ２ ｌ６５１７４ ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＴＬ＋Ｔ２ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ＨＢｃ１Ｒ，，．．． Ｆｌｕ ＭＰ ５８－６６ ｓｐｅｃｉｉｃ ＣＴＬ ｆｌｉｎｅ ＰＤＣ－Ｅ２ １５９—１６７ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｌｉｎｅ ＰＤＣ—Ｅ２ １６５—１７４ ｓｐｅｃｉｉｃ ＣＴＬ ｌｆｉｎｅ —ｏ／０）＾ Ｉｘ０ｌ＾ｕ ｕＩＪＩ ： 誊 量 皇 寮 三 ＩＦＮ￣＋ ＩＦＮ－Ｔ＋ ＩＦＮ吖＋ 圈３ ＰＤＣ－Ｅ２特异性ＣＴＬ分泌ＩＦＮ－Ｙ四聚体检测结果 ｒｉｇ．３ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＩＦＮ－．ｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＰＤＣ－Ｅ２ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ５０ ｔｈ ｔｅｔ姗ｅｒｓ Ｐａｔｉｅｎｔｓ 圈２ ｌ５名Ａ２’ＰＢＣ患者抗原肽诱导的ＣＴＬ细胞毒性 （Ｅ：Ｔ＝加：１） ｒｉｇ．２ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＤＣ－Ｅ２ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＴＬ ｆｒｏｍ 图４ １５例Ａ２’ＰＢＣ患者分泌ＩＦＮ－．ｒ的ＰＤＣ．Ｅ２特异性 ＣＴＬ比值 Ｆｉｇ．４ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ＩＦＮ－Ｙ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＰＤＣ－Ｅ２ ｓｐｅｃ￣ｃ ＣＴＬ ｉｎ １５ Ａ２’ＰＢＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ １５ Ａ２’ＰＢＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ（Ｅ：Ｔ＝加：１） 维普资讯 http://www.cqvip.com ・５５８・ 中国免疫学杂志２００７年第 Ｉ３卷 ３讨论 为升高，胆管上皮细胞内ＴＮＦ表达也增强。我们分 ＣＴＬ是特异性细胞免疫应答的主要效应细胞， 在机体抗感染、抗肿瘤免疫及移植排斥反应和自身 免疫病中发挥重要作用，在ＣＴＬ中起主要作用的是 ＣＤ８ ＣＴＬ。肝组织活检的免疫组化显示ＰＢＣ门管 区浸润的淋巴细胞主要是活化的Ｔ细胞，在ＰＢＣ早 期以ＣＤ８ 为主。ＰＢＣ患者的胆管上皮细胞和肝细 胞表达大量的ＨＬＡ分子以及为免疫识别所需的淋 巴细胞共刺激分子和细胞间黏附分子 。Ｔｉｎ－ ｍｏｕｔｈＬ８ 发现ＰＢＣ患者肝组织炎症部位中ＢＥＣ凋亡 显著增高，凋亡在早期就可见到，在没有炎细胞浸润 之处没有凋亡，表明ＰＢＣ中的ＢＥＣ凋亡是继发于炎 细胞浸润。这些研究提示胆管上皮细胞的破亡与浸 润的炎细胞有直接关系，ＣＤ８ Ｔ细胞介导的免疫反 应是胆管损伤的重要机制。然而，目前我们还不清 楚ＣＤ８ 抗原特异性ＣＴＬ的功能，又是如何参与 ＰＢＣ发病。 本研究表明，大部分ＰＢＣ患者中ＨＬＡ—Ａ ０２０１ 限制性ＰＤＣ—Ｅ２ｌ５９＿ｌ６７特异性ＣＴＬ和ＰＤＣ—Ｅ２ｌ６５＿１７４特异 性ＣＴＬ对ＰＤＣ—Ｅ２抗原肽的靶细胞具有杀伤能力， 且具有特异性。早先的免疫组化实验发现受损胆管 上皮细胞胞浆中含有穿孔素，胞核区颗粒酶强阳性， 并且荧光显微镜观察到大量与自身抗体起反应的抗 原均分布在患者肝脏中的胆管上皮细胞表面上。因 而，提示ＰＤＣ—Ｅ２特异性ＣＴＬ先通过Ｔ细胞受体识 别提呈在胆管上皮细胞上的ＨＬＡ一抗原肽复合物后， 向靶细胞释放穿孔素／颗粒酶发挥杀伤效应，对胆管 上皮细胞产生特异性破坏。 本研究中利用四聚体技术，检测了ＰＤＣ—Ｅ２ 特异性ＣＴＬ和ＰＤＣ—Ｅ２ １７４特异性ＣＴＬ合成ＩＦＮ一 、 ＩＬ４与ＴＮＦ一仅的能力，结果发现ＰＢＣ中两种ＰＤＣ— Ｅ２特异性ＣＴＬ合成的主要都是ＩＦＮ一 。这与Ｋｉｔａ 等 对ＰＤＣ—Ｅ２ｌ５９＿ｌ６７特异性ＣＴＬ研究结果相符。 Ｈａｒａｄａ等¨ 用原位杂交法分析发现ＰＢＣ肝内汇管 区表达ＩＦＮ一 和ＩＬ４ ｍＲＮＡ的Ｔ细胞增多，以前者 为甚，ＩＦＮ一＾ｙ和ＩＬ４ ｍＲＮＡ表达和汇管区炎症程度 一致。Ｍａｒｔｉｎｅｚ等… 用ＲＴ—ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法 发现大多数ＰＢＣ肝内表达ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＴＧＦ—Ｂ 和ＩＦＮ一＾ｙ ｍＲＮＡ。Ｎａｇａｎｏ等¨ 对晚期ＰＢＣ肝组织 研究显示相似的细胞因子表达谱。另外我们结果显 示ＰＤＣ—Ｅ２特异性ＣＴＬ基本上不分泌ＩＬ４或ＴＮＦ— ａ，与Ｃｏｒｄｏｎ等¨ 得到的ＰＢＣ患者Ｔ淋巴细胞 ＴＮＦ一仅分泌较正常低的研究结果较相符。但是，这 很难解释为什么ＰＢＣ患者血清ＴＮＦ一仅水平却表现 析，血循环及病灶区内高水平的ＴＮＦ一仅可能为其他 细胞所合成。 本研究进一步证实ＨＬＡ—Ａ ０２０１限制的ＰＤＣ— Ｅ２特异性ＣＴＬ一方面可以细胞毒性作用直接杀伤 靶细胞，另一方面又可通过分泌细胞因子ＩＦＮ一 的 方式调节多种细胞的功能，控制疾病的发生和发展。 ４参考文献 １ Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ Ｈ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｍ，Ｓｈｉｍｏｄａ Ｓ ｅｔ ａ１．Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｉ— ｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｙｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００３；（２）：１９— ２４． ２ Ｍａ￣ｕｍｕｍ Ｓ，Ｋｉｔａ Ｈ，Ｈｅ Ｘ Ｓ ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＨＬ —Ａ｝０２０１ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＣＤ８ Ｔ—ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ＰＤＣ—Ｅ２ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ［Ｊ］． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００２；３６：１１２５—１１３４． ３刘海英，张建，仲人前ｅｔ ａ１．四聚体技术检测原发性胆汁性肝硬 化患者血循环中抗原特异性Ｔ细胞［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂 志，２００６；２２（１）：７８－８１． ４ Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ Ｅ Ｊ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ— ｃａｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ［Ｊ］． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０００；３１：１００５—１０１３． ５刘海英，屠小卿，仲人前ｅｔ ａ１．原发性胆汁性肝硬化中ＰＤＣ—Ｅ２特 异性ＣＤ８ ＣＴＬ表位预测及鉴定［Ｊ］．中国医学科学院学报， ２００４；２６（５）：５００－５０４． ６ Ｄｕｎｂａｒ Ｐ Ｒ，Ｏｇｇ ＧＳ，Ｃｈｅｎ Ｊ ｅｔ ａ１．Ｄｉｅｒｃｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ。ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｌｏｗ—ｆｅｒｑｕｅｎｃｙ ａｎｔｉｇｅｎ—ｓｐｅｃ ｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｅｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ，１９９８；８：４１３－４１６． ７ ＫｉａｔＨ，ＮａｌｂａｎｄｉｎａＧ，ＫｅｅｆｆｅＥ Ｂ ｅｔ ａ１．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌ— ｉａｒｙ ｃｉｒｈｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ，２００３；（７）：８２１－８３９． ８ Ｔｉｎｍｏｕｔｈ Ｊ，Ｌｅｅ Ｍ，Ｗａｎｌｅｓｓ Ｉ Ｒ ｅｔ ａ１．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆｂｉｌｉａｒｙ ｅｐｉｈｔｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｈｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｅｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌｎａｇｉｔｉｓ 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