实时定量PCR技术的方法学分类

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・综述与进展・

实时定量PCR技术的方法学分类

关键词:实时定量PCR;概念;方法学

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王行综述,王惠民审校(南通大学附属医院医学检验中心,江苏南通226001)

　　本文简要介绍实时定量PCR技术的概念,并在此基础上对目前常用定量PCR方法(包括2种绝对定量、7种相对定量)作一详细说明。1　实时定量PCR的基本概念介绍111　参照物　参照物有外参照与内参照之分,在应用中各具优缺点。所谓外参照是指与目的基因不在同一反应体系中扩增的参照物。以已知浓度的目的基因为模板(它可以是纯化的质粒dsDNA或体外转录的RNA,也可以是体外合成的ssD2NA)按一定的倍比稀释,制备标准曲线图,未知标本根据标准曲线得出相对的拷贝数和Ct值。由于外参照能与目的基因保持较高的同源性,保证了二者的扩增效率近似,但由于外参照与目的基因不在同一反应体系中扩增,所以无法检测也不能克服可能出现在样本反应体系中的影响因素,如PCR抑制子等。内参照是相对于外参照而言的,即将已知浓度的内参照基因加到各个标本中,与样本一起抽提一起扩增。内参照基因与目的基因有相似的DNA片段,它的两端序列与目的基因完全一致,只是中间探针结合部位运用定点突变方法改变了序列,使之不能与目的基因的探针结合,只能与内参照探针结合。反应体系中的标准品和靶基因探针分别用两种不同的荧光染料标记,双通道荧光检测系统可以特异地同时检测出标准品和靶基因的扩增产物。与外参照相比这种内参照系统避免了由于不同的抽提效率而导致的样本间的差异,使结果的重复性更好。这种方法会出现两种模板之间的干扰和竞争,当两种模板的起始拷贝数相差较大时,这种竞争表现得更为显著。由于待测样品中的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内参照。另外,管家基因通常也被称为内参照,只是它与目的基因既可以在同一管内也可以在不同的管内扩增,如在同一管内扩增则要求内参的探针与目的基因的探针用两种不同的荧光素标记。其使用目的是作为内对照补偿待测样本核酸抽提过程造成的目的基因变异,以反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素。但并非所有的管家基因在所用的组织中都恒定表达,所以针对不同的实验要选择不同的管家基因。参照系统的合理设置直接关系到最终实验结果的可信度和准确性,必须根据实验目的和实验室条件选择最佳的参照系统。112　Ct值　它是指PCR扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。初始量越多其到达指数扩增期的Ct值越小。定量结果虽然不能直接用Ct值的大小表示,但可根据不同的公式计算后用于定量结果的表示。113　扩增效率(E)　当扩增效率最大(E=1)且目的基因与参照物的扩增效率近似相同时实验结果才科学、可信。因为

E值5%的差异就可在26个循环后导致产物2倍的差别

[1]

,

且不同的定量方法对E值要求也不同。

2　实时定量PCR的方法学分类

实时定量PCR大致分为两类[2],即绝对定量与相对定量。绝对定量与相对定量又可进一步分类:绝对定量包括两种:(1)单一的外参照,即只用外标准品构建标准曲线,测得目的基因的量在标准曲线上有一个对应的值,检测结果的报告方式是目的基因的拷贝数。该法是最早使用的绝对定量方法,但由于对各样本的个体差异及反应体系无法监控,对造成假阴性的结果也无法控制,因此该方法目前已较少使用。(2)外参照+非竞争性内参照(管家基因),该法一方面利用标准曲线实现了准确定量,另一方面应用内标管家基因来标化结果并补偿待测样本的体积变异、核酸抽提过程造成的目的基因拷贝数的变化,故结果比第一种绝对定量更可信。另外通过PCR反应条件的优化使目的基因具有最佳的扩增效率,并与内标管家基因扩增效率尽可能相同,但此方法的缺点是成本较高。

相对定量有如下7种方法。211　标准曲线法　首先要制备标准品,包括目的基因的标准品与内参基因的标准品。标准品可以不知道准确拷贝数或浓度,但必须准确地倍比稀释,一般为10倍倍比稀释制成标准曲线,样品与内参的基因表达量根据标准曲线得出,并用内参进行均一化,即将目的基因的数量(微克、纳克或拷贝数)除以与之相应的内参基因数量。另外还要选定一个用于表达差异分析的参照体系。假定目的基因在参照体系中的表达量为1×,那么目的基因在其他情况下的表达量以相对于参照体系的n倍表示。该方法是目前应用较多的相对定量方法,当标准品内参照因子与目的基因扩增效率不同时可用该方法进行相对定量。

ΔΔ

212　比较2-Ct法[3]　该方法所用公式如下:Xn=Xo×(1

n

+Ex)①,Xn是第n个循环后目标分子数,Xo是初始目标分子数,Ex是目标分子扩增效率,n是循环数;Xt=Xo×(1+

Ct,xEx)=Kx②,Xt是目标分子达到设定阈值时的分子数,Ct,x是目标分子扩增达到阈值时的循环数,Kx是一个常数;内参也有同样的公式:Rt=Ro×(1+Er)Ct,rt=Kr③,用Xt除以

Ct,xCt,r

Rt得到:Xt/Rt=Xo×(1+Ex)/Ro×(1+Er)=Kx/Kr=K④,假设目标序列与内参序列扩增效率相同Ex=Er=E,

Δ

则Xo/Ro×(1+E)Ct,x2Ct,r=K⑤,或Xn×(1+E)Ct=K⑥。Xn表示经过均一化处理过的初始目标分子量,ΔCt表示目标基因和内标基因Ct值的差异(Ct,x-Ct,r)。整理上式得:Xn

-ΔCt

=K×(1+E)⑦。最后用任一样本的Xn除以参照因子

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作者简介:王行,1980年生,女,在读硕士,免疫学专业,主要从事分子生物学方面研究。

72　临床检验杂志2007年第25卷第1期　ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2007,Vol125,No11　

明:该法比“标准曲线法”更简单、省时,比“22Ct法”更准确、

可靠。因为使用者可根据模拟的动力学图形确定PCR过程的指数增长期并将其应用于计算。215　Q2基因法[6]　Q2基因是通过两种不同的数学公式用标准误来计算基因表达的均值,两种公式都需要校正扩增效率,计算得到的表达量再与其匹配的组进行比较从而得到样本相对于参照因子(假定表达量为1×的样本)的表达量。该方法还包括一些统计学分析,如,配对t检验、非配对t检验、u检验、Wilcoxon配对法、Personπs相关性分析等从而全面评价实验结果的重要意义。利用可在Excel中运行的自动处理程序Q2Geneb软件高通量地处理复杂的定量PCR实验,可优化实验方案、资料分析、数据处理,还可保证实验的高重复性,加快了实验的进程。[7]

216　Gentle法　该法是不用标准品曲线计算样本与对照品倍比变化的公式之一,在PCR过程指数增长期通过计算荧光量的变化来计算每个样品扩增效率,通过将对照品与样本一起作图,两图形间的垂直距离表明样本与对照品的表达差异,而图形的斜率表示其扩增的效率。

[8]

217　Amplificationplot法　该方法用一种简单的算法来计算每个样本的扩增效率,得到的数据用于表达量的计算。为简化数据的处理,Peirson等开发了相关的软件DART2PCR(DataAnalysisforReal2TimePCR),该软件可根据SDS1.7软件得出的原始数据快速计算出Ct值、E值及Ro。该法的优点是提供一种手段,可依赖自身反应动力学的分析使PCR数据处理流水化操作,以使实验过程自动化,由于不需标准曲线可省去手工标准品制备的繁杂过程。

以上7种实验方法均有相应的文献,研究者可根据自身实验室的条件以及对定量精确性的要求进行选择。参考文献:

[1]FreemanWM,WalkerSJ,VranaKE.QuantitativeRT2PCR:pitfalls

andpotential[J].Biotec2hniques,1999,26:1122125.

[2]WongML,MedranoJF.Real2timePCRformRNAquantitation[J].

Biotechniques,2005,39(1):1211.

[3]LivarkKJ,SchmittgenTD.Analysisofrelativegeneexpressiondata

2ΔCtusingreal2timequantitativePCRandthe2Δmethod[J].Methods,

ΔΔ

Δ

的Xn得到:Xn,q/Xn,cb=K×(1+E)-Ct,q/K×(1+

ΔCt-ΔCt,cb-Δ

ΔΔCt=-(ΔCt,q2ΔCt,E)=(1+E)⑧。这里2

cb)。如果对反应条件进行优化使扩增效率接近1,那么目标分子经均一化处理后相对于参照因子就是:总目标分子=

ΔCt-Δ2。公式⑧中参照因子的选择是根据不同的实验类型确定的,其应用有以下3种情况:(1)某种处理方法对基因表达的影响,将未经处理的样本表达量设为1×,那么可得到经某种方法处理后的样本相对于未处理样本的基因表达差异。(2)检测基因在不同时间的表达差异,假设某基因在某时刻(可设为0时刻)的表达量为1×,则可比较基因在其他时刻的表达量相对于其在0时刻的表达量的变化。例如,细胞在不同周期内某基因表达量的变化。(3)比较基因在不同组织中的表达差异,将用作参照的组织中目的基因表达量设定为1×,那么目的基因在待测组织中的表达量用相对于参照组织的N倍表示。例如,APRIL基因在肿瘤组织中的表达量是其在正常组织中表达量的多少倍。该方法的优点是不需要标准曲线,但其公式的应用要满足两个条件:(1)目的基因与内参要有相同的扩增效率,(2)要使扩增效率达到最佳(接近于100%),主要通过一系列反应体系与条件的优化来实现。由于不同的扩增效率会导致该方法结果的错误,因此该方法必须检测扩增效率是否一致,方法是以系列稀释的cD2NA(组织标本抽提总RNA后再逆转录得到)浓度为横坐标,以ΔCt为纵坐标作图,如果直线斜率的绝对值小于0.1则该法方可使用。

[4]

213　Pfaffl法　Pfaffl法也是用公式来计算基因相对的表达量,相对的表达量由未知样本和内参基因(管家基因)的E值和Cp值(同Ct值,在不同仪器中表示不同,意义相同)推

ΔCptarget(control2sample)ΔCpreference(control2sample)

导出,公式为:ratio=Etarget/Erefere,Etarget为目的基因的扩增效率,Erefere为内参基因的扩增效率,ΔCptarget为参照体系中目的基因的Cp减去待测样品中目的基因的Cp,ΔCpref为参照体系中内参基因的Cp减去待测样本中内参基因的ΔCp。参照体系就是预先假定目的基因在其表达量为1×的体系,那么目的基因在其他体系的表达量为相对于参照因子N倍。利用可在Excel中运行的相对表达软件(RESTΖ)可对数据进行自动分析。RESTΖ利用随机区组设计资料的两两比较使实验结果更具意义,并同时显示所选的参照基因是否适合该实验。

[5]

214　LiuandSaint法　该法首先通过仪器的软件(PEAp2

n

pliedBiosystems)根据公式Rn=Ro×(1+E)(Rn为n个循环后的荧光值,Ro为初始荧光值)模拟出在PCR指数扩增早期的动力学曲线。因为随着反应的进行,反应体系的各成分的消耗将影响目的片段的扩增,所以将指数扩增早期的动力学图形用于分析结果更加可信。通过PCR的动力学曲线得

()

出扩增效率E值:E=(Rn,A/Rn,B)2Ct,A2Ct,B21(Rn,A、Rn,B为在扩增曲线上任意A、B两点的阈值的Rn)。通过该公式可直接得出各不同扩增反应的E值。最后根据E值推导出

)的表达公式:Rn,b/Rn,a=(1+其相对于参照因子(即1×

Δ2ΔCt

(Rn,b、E)Rn,a是待检样本a、b经过公式:Ro,t/Ro,r=ΔCt

(1+E)标化后的Ro,ΔCt=Ct,r2ΔΔCt为待检样本Ct,t,2a、b的ΔCt的差值),该公式在定量的同时标化实验结果。

Δ2ΔCt

作者还将该法与标准曲线法、2法同时进行比较,结果表

2001,25:4022408.

[4]PfafflMW.Anewmathematicalmodelforrelativequantificationin

real2timeRT2PCR[J].NucleicAcidRes,2001,29(1):e45.[5]LiuW,SaintDA.Anewquantitativemethodofrealtimereverse

transcriptionpolymerasechainreactionassaybasedonsimulationofpolymerasechainreactionkinetics[J].Anal.Biochem,2002,302(1):52259.

[6]MullerPY,JanovjakH,MiserezAR,etal.Processingofgeneexpres2

siondatageneratedbyreal2timeRT2PCR[J].Biotechniques,2002,32:137221379.

[7]GentleA,AnastasopoulosF,McBrinNA.High2resolutionsemi2quan2

titativereal2timePCRwithouttheuseofastandardcurve[J].Bio2techniques,2001,31:5022508.

[8]PeirsonSN,ButlerJN,FosterRG.Experimentalvalidationofnovel

andconventionalapproachestoquantitativereal2timePCRdataanaly2sis[J].NucleicAcidsRes,2003,31(14):e73.

(收稿日期:2006204219,修回日期:2006209212)

(本文编辑:陈维忠)